Por que o DNA?

✔ A maioria do DNA humano está empacotada no núcleo, na forma dos 46 cromossomos e é

chamado DNA nuclear;

Técnicas Moleculares Utilizadas em ✔ DNA mitocondrial está presente em maior número de cópias;

estudos de Genealogias ✔ Possui alta estabilidade química mesmo após longos períodos de tempo e está presente em
todas as células nucleadas do organismo, o que facilita a sua obtenção;

✔ A maioria das células humanas é diplóide, ou seja, possuem 2 cópias de cada cromossomo
(46 cromossomos divididos em 23 pares). As células sexuais (espermatozóide e óvulo) são
haplóides e só possuem 1 cópia de cada cromossomo (23 cromossomos).

✔Gêmeos idênticos únicos indivíduos que possuem cópias idênticas do genoma.

DNA mitocondrial DNA Mitocondrial X DNA Nuclear

✔ A principal vantagem do DNA mitocondrial, em comparação com o DNA nuclear, e que ele está
presente em torno de 500 a 2.000 cópias por célula. Nesse contexto, a análise do DNAmt é • Marcador genético • Marcador genético
particularmente útil em investigações criminais, uma vez que esta abundância oferece uma maior
chance de algumas cópias suportarem a degradação das amostras obtidas para a análise forense.
Apesar de o DNA nuclear possuir um ótimo poder para as identificações criminais, ele aparece com • Testes de maternidade • Testes de maternidade
uma frequência de apenas duas cópias por célula diplóide;

• Testes de paternidade

DNA mitocondrial Humano

16.600 pb

PRINCIPAIS METODOLOGIAS UTILIZADAS PARA A PCR = Polymerase Chain Reaction

DETECÇÃO DE VARIAÇÕES NA SEQUÊNCIA DO DNA

O DNA pode ser obtido a partir de qualquer célula nucleada.

(Reação em Cadeia da Polimerase)
• Extração de DNA:
Técnica usada em Biologia Molecular para obter-se a amplificação exponencial específica
1) As células são lisadas e centrifugadas para separar os núcleos;
2) As membranas nucleares são rompidas; de pequenas quantidades de DNA, in vitro, utilizando elementos do processo natural de
3) As proteínas são desnaturadas para liberar o DNA e manter sua replicação do DNA. Os produtos da reação de PCR são os amplicons.
integridade.
4) O DNA é precipitado de acordo com sua solubilidade.
 Vantagens do PCR PCR
• Inventor: Kary B Mullis em 1985 (Science)
• Método rápido, eficiente e de fácil utilização;
• Nobel Química em 1993
• http://www.karymullis.com
• Sensibilidade PCR é capaz de amplificar sequências a partir de quantidades ínfimas do
DNA-alvo e, até mesmo, DNA de uma única célula. • Produto do PCR: Amplicon

• Robustez e possibilidade de análise de amostras degradadas PCR pode permitir a

amplificação de sequências específicas a partir de material no qual o DNA está gravemente
degradado. Assim, através da PCR, e possível a tipagem do DNA em amostras que de outra
maneira não poderiam ser analisadas, como amostras antigas e já decompostas, restos
mortais de vítimas de incêndios ou acidentes e corpos em decomposição;

Utilizado em testes de paternidade, investigação de crimes, diagnóstico de doenças

Replicação do DNA requer vários componentes Síntese in vitro de DNA por PCR

DNA
1) Helicase: desnatura a fita de 5´ 3´ molde
DNA. DNA
polimerase dATP
2) DNA polimerase: adiciona 3´ 5´ dCTP
Primers
os nucleotídeos. dGTP
específicos
Desnaturação DNA dTTP
3) Iniciadores (primers): a 3´
enzima adiciona novos
nucleotídeos a partir da ligação
à hidroxila do nucleotídeo 5´ l
po
A
anterior. DN
DNA pol
4) Nucleotídeos livres (dNTPs) DNA pol
DN
A po
l
3´
Mas como desnaturar o DNA na ausência de helicases?
5´

A desnaturação é feita através do calor!

DNA
DNA polimerase dATP
dCTP
Primers
dGTP
dTTP

94ºC

DENATURAÇÃO

A enzima não desnatura porque é termoestável! A Taq DNA polimerase é extraída de

um organismo (Thermus aquaticus) capaz de viver em regiões com altas temperaturas. Resolveu o problema da etapa de desnaturação
 Temperaturas específicas permitem a desnaturação, anelamento de
primers e extensão da cadeia de DNA

DNA
molde
Taq polimerase dATP
dCTP
Primers
dGTP
dTTP

94ºC 50 - 65ºC 72ºC

DENATURAÇÃO ANELAMENTO EXTENSÃO

(Temp ideal Taq pol)

A repetição (30 a 40 vezes) dos ciclos de alternância de temperaturas permite a

geração de várias cópias da região de interesse.

“RAMPA” Termocicladores

Termocicladores atuais: “touchscreen”

Applied Biosystems
1º termociclador
Desenvolvido por Cetus Corp.
“Mr. Cycle”

Primers no PCR Fragmento desejado

5´ 3´
3´ 5´
 Fragmento desejado Fragmento desejado

5´ 3´ 5´ 3´
3´ 5´ 3´ 5´

Desnaturação (94o C)

5´ 3´ 5´ 3´
3´ primer 5´

Anelamento dos iniciadores (~60o C)

5´ primer 3´
3´ 5´ 3´ 5´

(A) Ciclo seguinte começa com 4 moldes

Fragmento desejado 5´ 3´

5´ 3´
3´ 5´
(B)
3´ 5´
Desnaturação

5´ 3´
3´ primer 5´

Extensão da nova fita (72o C) (C) 5´ 3´

5´ primer 3´
3´ 5´
(D)
3´ 5´

(A) Os iniciadores se anelam a esses moldes... (A) ...e 4 novas fitas são formadas
5´ 3´ 5´ 3´
3´ primer 5´ 3´ primer 5´

(B) (B)
3´ 5´ 3´ 5´
5´ primer 3´ 5´ primer 3´

Fragmentos
específicos

(C) 5´ 3´ (C) 5´ 3´
3´ primer 5´ 3´ primer 5´

(D) (D)
3´ 5´ 3´ 5´
5´ primer 3´ 5´ primer 3´
 Amplificação é exponencial

Os resultados são observados com o auxílio da técnica de Como DNA é “forçado” a migrar pelo gel?
eletroforese em gel

Corrida Revelação

- Um gel constitui uma rede molecular com poros de tamanho definido;

- Molécula de DNA é forçada a migrar dentro do gel (corrente elétrica);

- A separação é por tamanho: moléculas maiores demoram mais para passar pelo gel,
enquanto que moléculas menores correm mais rápido

Eletroforese em gel de agarose DNA é corado com brometo de etídeo, que fluoresce
quando submetido à luz UV
 Brometo de etídeo, um intercalante de DNA Eletroforese em Gel de Agarose

Padrão de Peso Molecular

Visualização de Gel de Agarose Corado com Brometo de Visualização de Gel de Agarose Corado com Brometo de
Etídeo sob Luz UV Etídeo sob Luz UV

Visualização de Gel de Agarose Corado com Brometo de

PCR – Reação em cadeia da
Etídeo sob Luz UV polimerase

• Isolamento específico de regiões do DNA

• Análise de DNA com pouca quantidade – DNA antigo
• Sequenciamento de DNA
• Testes de paternidade
• Análise forense – identificação da vítima e de suspeitos
• Tipagem para transplante de órgão
• Doenças infecciosas – tuberculose, HIV
• Diagnóstico genético
• Melhoramento animal e seleção de embriões.
• Confirmação pedigrees
• Monitoramento de pescado
 Teste de identificação para genética Teste de paternidade – também se baseia
forense
STR – Short tandem repeats (repetições curtas in tandem) muito variáveis em em STRs
Cada banda do DNA do bebê precisa coincidir pelo menos com a do mãe
tamanho ou do pai
•Método altamente polimórfico 5 a 20% da população compartilha o mesmo STR Quais fragmentos de DNA vieram da mãe? Qual dos homens não pode ser
•Pessoas não relacionadas tem chances baixas de compartilhar o mesmo STR PCR
o pai?de
•Poder de resolução está em analisar múltiplos STRs STRs
•Herança independente de cada locus STR (2ª Lei de Mendel)
•CODIS 20 – sistema norte americano combina 20 loci (Combined DNA Index System)
•Probabilidade é dada pela multiplicação de frequências alélicas de cada loci na
população
•Resolução de 1 em 1 quintilhão (1x1018)

Teste de 1.2 STR – Pequenas seqüências em tandem (microsatélites)

paternidade
-Repetições de 2-7 nucleotídeos

-Locí hipervariável

-Flanqueado por sítios conservados

1.2 STR – Pequenas seqüências em tandem (microsatélites) 1.2 STR – Pequenas seqüências em tandem (microsatélites)
 1.2 STR – Pequenas seqüências em tandem (microsatélites)

Doenças Genéticas analisadas por PCR

Enzimas de restrição
Síndrome do X frágil
• São enzimas que reconhecem sequências específicas de nucleotídeos e clivam o DNA na
Causa genética: expansão da sequência repetitiva CGG a região 5'UTR do gene FMR1, que
presença de tais sequências (sítios de restrição).
codifica uma chaperona expressa abundantemente em neurônios.

Nos indivíduos normais da população, o número de cópias desta sequência de CGG varia de
6 a 40 e o gene está ativo, produzindo quantidades normais de proteína FMR1.
Repetições acima de 200 cópias caracterizam a existência da Síndrome.
Sintomas: retardo mental moderado em homens e leve em mulheres.
• O tratamento de uma molécula de DNA com uma enzima de restrição, produz fragmentos de
tamanhos diversos que podem ser separados por eletroforese.
• Enzimas de restrição são isoladas de bactérias. Nestes organismos estas enzimas são utilizadas
na resistência à infecção por bacteriófagos.

Eletroforese em gel após o

PCR

10 40 200 Nº Repetições
CGG

Werner Arber Daniel Nathans Hamilton O. Smith

“Tesouras
Moleculares” DIAGNÓSTICO MOLECULAR:
SUBSTITUIÇÃO DE BASE ÚNICA

ANEMIA FALCIFORME

• Os polimorfismos genéticos podem criar ou eliminar sítios de restrição na molécula

de DNA.

A mudança do aminoácido altera a conformação da proteína, fazendo com que as moléculas de

• Amplicons quando digeridos com uma dada enzima de restrição geram fragmentos hemoglobina cristalizem quando os níveis de O 2 no sangue são baixos. Como resultado, as hemácias
de tamanhos diferentes conforme os alelos presentes, ou seja, o DNA exibe ficam com sua morfologia alterada.
polimorfismo em relação ao comprimento dos fragmentos de restrição (RFLPs)
 DIAGNÓSTICO DA ANEMIA FALCIFORME POR PCR-RFLP Iniciador para PCR Sítio reconhecido
pela Mst I

NNN NNN NNN NNN NNN NNN CCT GAG GAG NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN
A troca de A para T elimina um sítio para a enzima de restrição Mst I.
NNN NNN NNN NNN NNN NNN CCT GTG GAG NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN
GAG (normal) ⇨ GTG (mutante)
Iniciador para PCR

Sítio reconhecido
pela Mst I Eletroforese em gel após o
PCR
NNN NNN NNN NNN NNN NNN CCT GAG GAG NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN
AA AT TT
NNN NNN NNN NNN NNN NNN CCT GTG GAG NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN

Iniciador para PCR Sítio reconhecido Iniciador para PCR Sítio reconhecido
pela Mst I pela Mst I

NNN NNN NNN NNN NNN NNN CCT GAG GAG NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN CCT GAG GAG NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN

NNN NNN NNN NNN NNN NNN CCT GTG GAG NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN CCT GTG GAG NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN
Iniciador para PCR Iniciador para PCR

Eletroforese em gel após o Eletroforese em gel após o Eletroforese em gel após o

PCR PCR tratamento com a enzima

AA AT TT AA AT TT AA AT TT

Fragmentos amplificados Fragmentos amplificados

são tratados com Mst I. são tratados com Mst I.

Doenças Genéticas analisadas por PCR/RFLP

Iniciador para PCR Sítio reconhecido
pela Mst I

NNN NNN NNN NNN NNN NNN CCT GAG GAG NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN Acondroplasia
NNN NNN NNN NNN NNN NNN CCT GTG GAG NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN FGFR3 (Receptor 3 do Fator de Crescimento de Fibroblastos) ⇨ G380R (Gli – Arg);
Mutações de ganho de função: G1138A (98%) ou G1138C (1 a 2%).
Iniciador para PCR

Diagnóstico molecular
Eletroforese em gel após o Eletroforese em gel após o
PCR tratamento com a enzima O gene do receptor3 do fator de crescimento
de fibroblastos (FGFR3), localizado no braço
AA AT TT AA AT TT
curto do cromossomo 4, está associado à
300 pb 300 pb

200 pb
acondroplasia. Mais de 97% dos casos são
Fragmentos amplificados 200 pb
100 pb são tratados com Mst I. 100 pb causados por uma ou duas mutações neste
gene, o qual resulta na substituição de um
aminoácido específico, G380R, cujo padrão de
AA – indivíduo
Sítio presente em Sítio ausente em
normal todos os fragmentos. todos os fragmentos.
herança é autossômico dominante.
AT – traço falcêmico Clivagem total Não há clivagem.
TT – anemia faciforme
 Indels multialélicos
✔ Nos testes de determinação de identidade genética são estudadas regiões genômicas em
que há variação entre pessoas normais (mais de 1% de variação). Essas regiões são
chamadas de “polimorfismos de DNA” ou “marcadores de DNA”.
✔ Métodos mais usados: estudo de regiões repetitivas de DNA, chamadas de “minissatélites”
(VNTR’s) e “microssatélites” (STR’s). A chave da diversidade nessas regiões baseia-se no
número de repetições, que varia entre indivíduos, e pode ser estudada com sondas de DNA,
ou através de PCR.
* No caso dos STRs e VNTRs, os “alelos” são identificados através do número de
repetições.
* Tais polimorfismos são multialélicos, ou seja, apresentam diversos números de
repetições possíveis dentro de uma população.
Exemplo
Alelo 1: 14 repetições
TGCCCCCCAATGGTACAGGTTTCTATTACATCTACTGTGCCTTCCTGTAGGGTATTATTATACGAGCTTTAAA
AGATAGTTCCAAACG CACACACACACACACACACACACACACATGGATTTGATTTTGTGTTGTAAGAATAAAAT
CAATTGTGAATGTCTGAATATTATTATGACAGCTATAATTATAACAGCTAAGTTTTAAACAAATAATGAAATA
TTTAAAATGTAA

Microssatélites ou STRs (short tandem repeats): trechos de DNA formados
por 2-4 nucleotídeos (TA, CAG, AAAT) que se repetem na sequência de DNA.
Alelo 2: 16 repetições
TGCCCCCCAATGGTACAGGTTTCTATTACATCTACTGTGCCTTCCTGTAGGGTATTATTATACGAGCTTTAAA
AGATAGTTCCAAACA CACACACACACACACACACACACACACACACATGGATTTGATTTTGTGTTGTAAGAATA
AAATCAATTGTGAATGTCTGAATATTATTATGACAGCTATAATTATAACAGCTAAGTTTTAAACAAATAATGA
AATATTTAAAATGTAA

Minissatélites ou VNTRs (variable number of tandem repeats): unidades de Genótipo do indivíduo:

repetição com até 100 nucleotídeos de comprimento. 14/16

Amplificação do trecho utilizando iniciadores externos ao polimorfismo

DIAGNÓSTICO MOLECULAR:
MICROSSATÉLITES Iniciador para PCR
TGCCCCCCAATGGTACAGGTTTCTATTACATCTACTGTGCCTTCCTGTAGGGTATTATTATACGAGCTTTAAAA
GATAGTTCCAAACG CACACACACACACACACACACACACACA TGGATTTGATTTTGTGTTGTAAGAATAAAAT
CAATTGTGAATGTCTGAATATTATTATGACAGCTATAATTATAACAGCTAAGTTTTAAA CAAATAATGAAATAT
TTAAAATGTAA
Iniciador para PCR
Alelo 1: 14 repetições
TGCCCCCCAATGGTACAGGTTTCTATTACATCTACTGTGCCTTCCTGTAGGGTATTATTATACGAGCTTTAAA
AGATAGTTCCAAACG CACACACACACACACACACACACACACA TGGATTTGATTTTGTGTTGTAAGAATAAAA Iniciador para PCR
TCAATTGTGAATGTCTGAATATTATTATGACAGCTATAATTATAACAGCTAAGTTTTAAACAAATAATGAAAT TGCCCCCCAATGGTACAGGTTTCTATTACATCTACTGTGCCTTCCTGTAGGGTATTATTATACGAGCTTTAAAA
ATTTAAAATGTAA GATAGTTCCAAACA CACACACACACACACACACACACACACACACA TGGATTTGATTTTGTGTTGTAAGAATA
AAATCAATTGTGAATGTCTGAATATTATTATGACAGCTATAATTATAACAGCTAAGTTTTAAA CAAATAATGAA
Alelo 2: 16 repetições ATATTTAAAATGTAA
TGCCCCCCAATGGTACAGGTTTCTATTACATCTACTGTGCCTTCCTGTAGGGTATTATTATACGAGCTTTAAA Iniciador para PCR
AGATAGTTCCAAACA CACACACACACACACACACACACACACACACA TGGATTTGATTTTGTGTTGTAAGAAT
AAAATCAATTGTGAATGTCTGAATATTATTATGACAGCTATAATTATAACAGCTAAGTTTTAAACAAATAATG
AAATATTTAAAATGTAA

Amplificação do trecho utilizando iniciadores externos ao polimorfismo

Sequenciamento de DNA:
Iniciador para PCR O Método de Sanger
TGCCCCCCAATGGTACAGGTTTCTATTACATCTACTGTGCCTTCCTGTAGGGTATTATTATACGAGCTTTAAAA
GATAGTTCCAAACG CACACACACACACACACACACACACACA TGGATTTGATTTTGTGTTGTAAGAATAAAAT
CAATTGTGAATGTCTGAATATTATTATGACAGCTATAATTATAACAGCTAAGTTTTAAA CAAATAATGAAATAT
TTAAAATGTAA
Iniciador para PCR

Iniciador para PCR

TGCCCCCCAATGGTACAGGTTTCTATTACATCTACTGTGCCTTCCTGTAGGGTATTATTATACGAGCTTTAAAA
GATAGTTCCAAACA CACACACACACACACACACACACACACACACA TGGATTTGATTTTGTGTTGTAAGAATA
AAATCAATTGTGAATGTCTGAATATTATTATGACAGCTATAATTATAACAGCTAAGTTTTAAA CAAATAATGAA
ATATTTAAAATGTAA
Iniciador para PCR

Eletroforese em gel após o

PCR

16/16 16/14 14/14

A diferença natural no tamanho dos

fragmentos elimina a necessidade do
uso de enzimas de restrição
 Lembrando... Deoxinucleotídeos
Polimerização Vs

5’ Dideoxinucleotídeos

3’

Nucleotídeo

Seqüenciamento passo a passo...

Amplificação da amostra utilizando um primer de 20 nucleotídeos e nucleotídeos

com diferentes marcações fluorescentes.

Reação de
sequenciamento
dNTPs
• Template ou DNA molde
+ Termociclador
ddATP + ddCTP + ddGTP + + ddTTP • 1 primer
• Tampão
• Água nuclease free
✔dNTPs
✔ddNTPs
O dideoxinucleotídeo vai competir com o seu deoxinucleotídeo correspondente.
✔Taq DNA pol
Os dideoxi serão incorporados aleatoriamente, gerando fragmentos de tamanhos diferentes.

Método de Sanger ou Dideoxi ou de Terminalização Método de Sanger ou Dideoxi ou de Terminalização

Método de Sanger ou Dideoxi ou de Terminalização Método de Sanger ou Dideoxi ou de Terminalização

Fim da polimerização pela Taq DNApol

Sequenciamento de Sanger SEQUENCIAMENTO AUTOMÁTICO

“Manual”
primer polimerase DNA molde
dNTPs F-ddNTPs

• Sequenciadores de capilares ⇨ mais rápidos devido a maior voltagem aplicada

• Capilares preenchidos com gel
• Sistema de detecção por meio de fluorescência confocal excitada por laser
• Elimina etapa de montagem da placa e preparação do gel
• Aplicação das amostras por eletroinjeção
• Alta velocidade e resolução na separação das amostras

Sequenciador Automático

AB 3100
 Sequenciador com capilar internamente Eletroferogramas

Câmera
Capilares (4)
CCD
Laser

Placa contendo as amostras

Polímero
Anodo Catodo (pólo negativo)
(pólo positivo)
Vídeo: http://www.eaulas.usp.br/portal/video.action?idItem=1966

Doenças Genéticas analisadas por sequenciamento Distrofia Muscular de Duchenne

nucleotídico
Mutações nos genes BRCA1 e BRCA2
Aumentam a predisposição para cânceres de mama e ovário. Neste exemplo são
analisadas mutações nos s exons 2, 11 e 20.
BRCA1-185delAG
BRCA1-5382insC
BRCA2-6174delT
Indicações:
• Mulheres com história pessoal de câncer ou parentes próximos com câncer de mama.
• Famílias com múltiplos indivíduos com câncer de mama ou ovário.
• Mulher jovem com câncer de mama bilateral ou câncer de ovário e mama.
• Homens com história pessoal ou familiar de câncer de mama masculino.
• Mulheres com história pessoal ou familiar de câncer de ovário.
• Mulheres descendentes de judeus Ashkenazi.
• Doença muscular progressiva causada por mutações no gene da distrofina, localizado no
cromossomo X. É o maior gene descrito para humanos com 79 éxons, seu RNA é
processado alternativamente, produzindo vários transcritos.
• A criança nasce aparentemente saudável, com o aparecimento gradual e progressivo dos
sintomas desde o primeiro ano de vida. A perda da habilidade de caminhar se dá entre os
sete e 12 anos de idade, com sobrevivência rara acima dos 30 anos. Ocorre disfunção da
musculatura lisa, insuficiência respiratória e miocárdia.
• A incidência de DMD é bastante alta, chegando a 1 afetado em cada 3.500 nascimentos.
• Padrão ouro de diagnóstico = sequenciamento dos 79
éxons;
• Atualmente são conhecidos 29 microssatélites (STRs)
do tipo dinucleotídeo que são analisados por PCR.

Sequenciamento de Sanger
Tópicos da aula

1) DNA genômico vs. DNA mitocondrial

2) PCR
3) Eletroforese em gel
4) RFLP
5) Sequenciamento de Sanger