BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA

2. Isolamento de ácidos nucleicos

•DNA genómico
•RNA total e RNA mensageiro

1
Porquê isolar DNA?

• Isolamento de DNA - o 1º passo antes de

uma análise posterior, que pode ser:

- perfil forense de DNA

- clonagem (de um gene)
- sequenciação de DNA para diagnóstico de uma doença
(pesquisa direta da mutação)
- sequenciação de DNA para pesquisa de um
polimorfismo
- identificação organismo geneticamente modificado…

• Em geral, todas estas análises requerem um passo inicial

2
com PCR (Polymerase Chain Reaction)
Isolamento de DNA genómico

•A qualidade do DNA determina a eficiência do PCR (ex: perfil

forense) e, consequentemente, a falibilidade e sensibilidade do
teste

•A eficiência do PCR é afetada por:

-Concentração de impurezas:
■inibidores da enzima Taq polimerase
■impurezas ligadas ao DNA e o
tornam indisponível para a reação enzimática

-Estado de integridade do DNA

3
DNA genómico – integridade e pureza

-Integridade do DNA :

Poços 1, 3 e 5- DNA genómico íntegro

Poços 2, 4 e 6- DNA genómico degradado
M- Marcador de peso molecular

-As impurezas e a degradação afetam a quantificação, o que se

pode traduzir em falha do PCR

-A quantidade de DNA define representação e pode originar erros!

O SUCESSO GERAL DO TESTE DEPENDE DO ISOLAMENTO

DO DNA!!!!
4
Porquê isolar RNA?

• Estudos de expressão: as funções celulares/tecidulares estão

sempre relacionadas com expressão génica  análise e
caracterização do RNAm:

-Quais os genes expressos num tipo particular de células

de um organismo?

-Quais os genes expressos num dado momento?

-Quais os genes expressos após administração de droga?

-Quais as diferenças de expressão génica entre células

normais e células doentes (ex: cancerosas).
5
Porquê isolar RNA?

• Estudo da sequência de genes (transcritos), o que pode

estar ligado a doenças:

Buée et al. Brain Research, Reviews 33. 95-130 , 2000

• Deteção de infeções:

-identificação do RNA viral

(Sida, Covid19…)

6
http://www.bioteach.ubc.ca/Biomedicine/
Viruses/viralreplication.gif
Síntese de cDNA a partir de mRNA

• As quantidades de mRNA numa célula são sempre

muito baixas e o RNA é difícil de manipular

• Como não se consegue fazer amplificação do RNA,

faz-se primeiro:

A síntese de cDNA
(a partir de mRNA ou de RNA total)

O que é o cDNA?
7
cDNA= DNA complementar
• O RNA purificado é usado como molde, para a transcrição
reversa, originando o cDNA:

• O cDNA pode ser amplificado, por PCR, com ≠s fins:

•quantitativos (Real-time PCR; microarrays)
•qualitativos (sequenciação)
•clonagem num vetor para estudos posteriores,….

8
Como detetar RNA viral numa amostra biológica

Ex: O PCR convencional (ou PCR em tempo real) pode ser utilizado para
detetar a presença de um genoma de vírus, neste caso de RNA
convertido em cDNA, numa amostra de sangue ou qualquer outro tecido
do organismo em causa

9
Isolar ácidos nucleicos

Eucariotas
DNA
-Núcleo
-Mitocndria
-Cloroplasto
RNA
-Núcleo
-Citoplasma

Procariotas(todos no mesmo
compartimento)

DNA
-Cromossómico
-Plasmídico
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RNA
Isolar ácidos nucleicos

Tipos de amostra:
-Sangue
-Urina
-células/tecidos
- Cabelo
-Plantas
-Alimentos
-Bactérias
-Leveduras
….

11
Isolar ácidos nucleicos

Estrutura da célula

• Membrana plasmática, nuclear e dos

organelos

• >% DNA localiza-se no núcleo (ligado a

proteínas - cromatina)

• DNA mitocondrial – mitocôndria

(no cloroplasto, células de plantas)

• RNA localiza-se no núcleo e no

citoplasma 12
Isolar ácidos nucleicos

O isolamento de DNA e/ou RNA - a partir de tecidos ou

células - para posterior manipulação ou analise,
envolve as etapas:

1- Trituração mecânica: disrupção do tecido (quebra

das paredes celulares, no caso de leveduras, plantas,
sementes)
2- Dissolução das membranas
3- Separação das impurezas
4- Purificação
13
5- Quantificação
1- Trituração mecânica (omitida em alguns casos)

- Quanto < o tamanho das partículas, > a área de superfície e a

exposição ao tampão de extração  > a eficiência de
extração do ácido nucleico

- A escolha do método de disrupção depende do tipo de

amostra biológica (do tipo de membranas, se têm parede
celular, se são células individualizadas ou tecidos)

Nota: A quebra das paredes celulares nas leveduras e plantas, pode ser realizada por um processo enzimático ou mecânico

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Processos de disrupção tecidular/celular
Processo Condições Tipo de células/tecido Comentário
típicas Método de
MECÂNICOS eleição *
Homogeneizador de Instruções A maioria dos tecidos
lâminas*(Polytron) equipamento
animais, plantas
Lise celular 2vol água para1 vol Eritrócitos, periplasma E.coli
(Choque osmótico) células pré-lavadas

Potter** Instruções Fígado, cultura células

equipamento
Maceração músculo
/trituração Almofariz/pilão **
French-press Instruções Bactérias, leveduras,
equipamento
células de plantas
BIOQUÍMICOS/
QUÍMICOS
Detergentes 0,1 a 1%para Bactérias, cultura cél.
suspensão
cél./tecidos
Digestão Lisozima Bactérias, leveduras Combinado com 15
enzimática 0,2mg/mL, 37ºC, disrupção
15’ mecânica
Homogeneizador de laminas

-Método de eleição: Homogeneizador de laminas

(Polytron) como método de homogeneização

(Mergulhar em tampão de lise entre amostras)

-A seringa com agulha é outra técnica

de homogeneização (muito utilizado em
cultura de células)

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Tipos de amostra
Congelada

• Disrupção por trituração com almofariz e pilão e

homogeneização em tampão de lise

• Manter o tecido e o material no frio

Dura (osso)

• Deve ser congelado e submetido a trituração com

almofariz e pilão
• Homogeneização em tampão de lise
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Fibrosa (coração, músculo esquelético)

• O rendimento melhora congelando a amostra em

azoto líquido

• Pulverização enquanto congelado

• Homogeneização em tampão de lise

Rica em nucleases (baço, timo)

• A homogeneização rápida e eficiente é critica

• Congelação e pulverização
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• Armazenamento em solução de estabilização
Fixada em formalina, embebida em parafina
• Há kits específicos
• Desparafinação
• Digestão com proteinase K
• Extração com um solvente orgânico

Células em cultura
• Fácil disrupção
• Ressuspensão em solução de lise, por vortex,
sonicação ou pipetagens vigorosas

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Sangue
• Há kits específicos
• Lise dos eritrócitos
• Recolha dos leucócitos e disrupção em
tampão de lise

Bactérias e leveduras
• Há kits específicos
• Necessidade de degradar a parede celular
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1- Trituração mecânica: disrupção do tecido

2- Dissolução das membranas

3- Separação das impurezas

4- Purificação

5- Quantificação

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2- Dissolução das membranas citoplasmática e nuclear

• A lise das membranas faz-se com um tampão de lise

contendo:

-detergentes
-sais
-pH alcalino (~8)

• A lise das células e núcleos resulta numa “sopa” de:

restos celulares + conteúdos do citoplasma e do núcleo

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Ex. de um tampão de lise:

• 50 mM Tris-HCI, pH 8.0 - mantem o pH da solução a um CH3

CH2
nível onde o DNA é estável CH2
CH2
• 1% SDS - lisa as membranas celular e nuclear, permitindo a CH2
CH2
libertação do DNA para a solução (detergente que também CH2
desnatura proteínas, tornando-as mais suscetíveis a clivagem CH2
por proteases) CH2
CH2
CH2
CH2
o
Porque se utilizam proteases? o S o
O-
SDS
• degradar as proteínas nucleares associadas ao
DNA (cromatina) e enzimas citoplasmáticas que
poderão degradar o DNA.
23
1- Trituração mecânica: disrupção do tecido

2- Dissolução das membranas

3- Separação das impurezas

4- Purificação

5- Quantificação

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3- Separação das impurezas
Separar o solúvel (DNA ou RNA) do insolúvel (restos celulares
e proteínas desnaturadas) por:

– Centrifugação
ou
– Filtração

4- Purificação
os ácidos nucleicos ainda estão associados a restos proteicos
e/ou sais:
– solventes orgânicos(fenol, clorofórmio) e
precipitação com álcool e sal
– colunas (base dos kits)
– processos magnéticos
– processos enzimáticos 25
Solventes orgânicos e precipitação com álcool e sal

•Extração orgânica (fenol/clorofórmio) seguida de precipitação

com etanol frio+ sal
(NaCl ou CH3COONa)

desnatura e extrai proteínas precipita o DNA e o RNA

(proteínas desnaturadas ficam na interfase,
após centrifugação, ácidos nucleicos na fase aquosa)

Método:
-Demorado; trabalhoso; difícil de automatizar; reagentes tóxicos
-Rendimento e pureza inferiores aos dos kits comerciais

26
Porque força iónica precipita os ác. nucl. em etanol?

-Os iões Na+ ligam-se aos grupos fosfato do DNA e do RNA, neutralizando
a carga elétrica das moléculas

-DNA e RNA não são solúveis em álcool: aglomeram-se, em vez de se

repelirem, facilitando a sua precipitação

-As moléculas de DNA genómico precipitadas aparecem como

longos pedaços de cotão, fibrosas, tipo teia de aranha

-formam-se bolhas de oxigénio, microscópicas, à medida que o DNA precipita

NOTA: Os ácidos nucleicos podem conservar-se íntegros, precipitados
em álcool, a -80ºC, durante anos. 27
Outros métodos para purificar ácidos nucleicos:

• Colunas (de sílica)

– O DNA e RNA ligam-se à sílica a altas concentrações de sal

– Impurezas são lavadas (tampões com etanol)
– Eluição com uma solução aquosa de baixa força iónica

Rendimento e pureza superiores (kits comerciais - NucleoSpin,

DNeasy, GenElute)

• Processos Magnéticos
- Esferas magnéticas revestidas
– Sílica
Grande rendimento e pureza (kits comerciais – Charge Switch,
Wizard, MagAttract) 28
•Processos enzimáticos

-Extratos celulares - digestão com proteinase K para eliminar

todas as proteínas

-isolamento de DNA- tratamento com RNase, livre de DNase,

para eliminar o RNA

-isolamento de RNA- tratamento com DNase

-nos procedimentos de isolamento usam-se inibidores das

nucleases (ex: agentes quelantes como o EDTA que inibe as DNAses)
para se manterem os ácidos nucleicos intactos

29
Lavagem dos ácidos nucleicos e eluição:

• Lavagem com etanol 70% para remoção de sais e outras

impurezas

• Eluição ou dissolução:
-DNA em TE (Tris-EDTA) ou outro tampão de baixa força
iónica,
-RNA em água (livre de nucleases, tratada com DEPC) ou
um tampão de baixa força iónica

Pronto para quantificação e análise….

30
5- Quantificação de ácidos nucleicos

• Espectrofotometria (+ comum)
– Absorvância a 260 nm

• Fluorímetria
– Hoechst Dye
– PicoGreen

31
Espectrofotometria

• Quantificação

DO260=bc (=20cmmgml-1 para DNAcd; =25cmmgml-1 para RNA e DNAcs)

[DNAcd] = DO260 *50 μg/ml * fator de diluição

• Avaliação da Pureza

1.8<DO260/DO280< 2 (DNAcd mais próximo de 1,8; RNA mais

próximo de 2)

Nota: método simples; limitado a uma gama de 5 μg/ml a 90 μg/ml; fácil de

sobre-estimar devido aos contaminantes (RNA, DNAcs, nucleótidos, fenol,
proteínas) 32
Fluorimetria

-Aumento de fluorescência após ligação do corante ao DNAcd

-Hoechst 33258 – Quantifica até 10ng/ml

-PicoGreen – Quantifica até 25pg/ml, menos sensível à

presença de contaminantes (RNA, proteínas,
detergentes).

33
Extração de RNA: cuidados dobrados
• É difícil trabalhar com RNA:
-quimica e biologicamente mais lábil que o DNA
-instável; RNases ubíquas
-não há maneira de o amplificar

• O RNA de uma célula:

• RNA ribossómico (rRNA)- o + abundante
• RNA de transferência (tRNA)
• RNA nuclear heterogéneo (hnRNA)
• RNA mensageiro (mRNA)- o menos abundante

…e outras espécies de RNA pouco abundantes 34

(ex: micro RNAs)
Como manter a amostra para isolamento de RNA
Amostras frescas:

• Manter o tecido fresco no frio

• Homogeneizar em solução de lise.

Congelar as amostras em azoto

http://www.abc.net.au/science/news/img/health/cryo090304.jpg
líquido:

• Submergir os tecidos em azoto líquido

• Guardar indefinidamente em azoto

35
líquido ou a -80°C.
OU guardar em soluções que estabilizam o RNA
( Ex: RNAlater – Ambion)

http://www.ambion.com/catalog/CatNum.php?7020

• Não é necessário processar ou congelar imediatamente

• Mais fácil processar se não for congelado

• Mantém a qualidade e a quantidade do RNA

36
Métodos de isolamento de RNA total
• Extração orgânica e precipitação com etanol+sal

-fenol e clorofórmio para remover

proteínas, lípidos e DNA

-recuperação do RNA por

precipitação com etanol e sal

http://www.biochem.arizona.edu/classes/bioc471/pages/Lecture9/AMG5.1a.gif

vantagens:
-para amostras de grande ou pequena dimensão
-pode ser modificado para amostras/ tecidos particulares.

desvantagens:
-fenol e clorofórmio: tóxicos
-se ficarem como contaminantes, o fenol e o clorofórmio podem
37
comprometer passos subsequentes.
•Purificação em fase sólida (Kits comerciais):

- colunas de sílica ligam o RNA enquanto

outros componentes celulares são lavados

- o RNA é eluído no estado puro.

Vantagens:
- procedimento rápido

- não são necessários solventes orgânicos

- não é necessária precipitação alcoólica

- a maioria das soluções e material de

plástico é fornecida com o kit.

38
http://www.eandkscientific.com/files/images/Nucleospin_RNAII.gif
Inativação das RNases no isolamento de RNA

Todos os procedimentos têm necessidade de inativação

de RNases, porque:

• Estão presentes nas células vivas

• Ativas numa gama larga de pH

• Não requerem iões metálicos como co-fatores

• A autoclavagem não as inativa

39
Fontes de RNases

•Contaminantes provenientes do ar
• Mãos sem luvas
• Água e tampões autoclavados
• Células vivas, tecidos
• Pontas e tubos
• Superfícies do laboratório
• Amostras de RNA
• preps de plasmídeos
• Pipetas usadas em procedimentos
que usaram RNase

40
Como evitar RNases
• Manter os recipientes fechados
•Usar água tratada com DEPC
• Usar luvas
• Manter áreas só para trabalhar com RNA
• Usar material estéril de plástico, descartável,
livre de RNases
• Colocar o material de vidro a 180°C, 8h ou
tratá-lo com 0.1% dietil-pirocarbonato (DEPC)

• Pode também tratar-se o material de vidro e

de plástico com:
- 3% H2O2 durante 10’.
- 1N NaOH ,1h a 37°C.
41
 Dietil-pirocarbonato (DEPC)

• Agente alquilante: suspeita-se que seja carcinogénico

• Funciona, modificando os resíduos de histidina da RNase A

• Após tratamento, o DEPC que não tenha reagido deve

destruir-se (por autoclavagem), porque vai reagir com outras
proteínas e com as purinas (dATP e dGTP) da molécula de RNA

• Reage com acrílico, policarbonato e poliestireno: usar vidro!

•Não pode ser usado com tampões com grupos amina, porque
reage com estas (Tris etc.)

42
 Outros inibidores das RNases (menos tóxicos)

• RNaseZap (Ambion), RNasin (Promega) e RNAguard (Amersham

Pharmacia Biotech);

• Isolados da placenta humana

M- Marcador de PM

C- RNA total humano

Quantidades de RNase A
1 - RNA total humano +RNase A
2-5 - RNA total humano +RiboLock RNase Inhibitor +RNase A
43
http://www.fermentas.com/catalog/modifyingenzymes/img/ribolock_inhib.jpg
Remoção contaminantes do RNA: DNA
O DNA deve ser removido com DNase, se este for para:

-Transcrição reversa e PCR para análise de expressão génica

Antes do tratamento com DNase

Como remover a DNase:

- Inativação por calor

-Proteinase K e extracção orgânica

- Muito demorado
- Perde-se amostra
44
Isolamento de RNA total vs mRNA

• Isolamento de RNA poli-A : deteção e quantificação de mRNAs

raros

1 g tecido ou 5 x 108 células

1 célula = 1 x 10-5 g de RNA
2 mg de RNA total:
mRNA = 1-5%
rRNA = 80-85% ▪ 1.6 mg é rRNA
tRNA = 15-20%
▪ 60 g é mRNA
- 60 ng moderadamente
abundante
- 2 pg-2 ng raro

45
Isolamento de mRNA poli-A: só para mRNA eucariótico!

• A cauda é suficientemente grande para permitir que os mRNAs

sejam purificados por cromatografia de afinidade em oligo (dT)
celulose
1 2 3a 4 5 6 7
AAAAAAAAAAA Poly-A tail

• Usar altas concentrações de sal para a ligação à matriz e

baixar a concentração para a eluição do mRNA

•Há kits comerciais para isolamento de mRNA poli-A

46
NOTA: O RNA poli-A/mRNA pode ser isolado a partir de preps de RNA total
Kits comerciais para isolar RNA
mRNA
•Kit Qiagen: com oligotex
Pequenos RNAs:
• miRNA, siRNA, snRNA, e snoRNA

RNA Viral
• extracção de amostras biológicas livres de células(lise das
partículas virais)

RNA Total
• Plantas, Fungos, Bactérias;
• Sangue total, saliva;
•tecidos fixados em formaldeído ou
paraformaldeido ou parafinados;
• Tecidos ricos em fibra ou tecidos gordos.

Reagente Trizol (contem fenol)

• Isolar RNA, DNA e proteína.
47
 Quantificação do RNA

• Espectrofotometria
- Absorvância a 260 nm e A260/A280
- Requer espectrofotómetro (pode ser nanodrop)
- DNA, proteínas, nucleótidos livres também absorvem a 260nm
- Menos sensível que outros métodos.
• Fluorimetria
- Corante especial (RiboGreen, Sondas Moleculares)
- Mais sensível que a espectrofotometria
- Menos sensível a proteína e nucleótidos livres
- Contaminação com DNA pode dar leituras falsas
- Requer fluorímetro.

48
Avaliação da qualidade do RNA

• Eletroforese em gel de agarose :

-Requer grandes quantidades de RNA

-a banda do RNA 28S deve ter 2x a intensidade da 18S

49
Quantificação/avaliação da qualidade do RNA

• Eletroforese capilar (Bioanalizador Agilent 2100)

- Corante específico do RNA

- Compara a fluorescência da amostra com a de um padrão
- Requer pequenas quantidades de RNA
- Quantifica e verifica a integridade do RNA, simultaneamente
- Não é afetado pela presença de contaminantes
- Aparelho específico

Agilent 2100 Bioanalyzer Electropherogram 50

of RNA Sample.
http://www.ambion.com/techlib/tn/94/949.html
Contudo…..
• Alguns ensaios toleram RNA parcialmente
degradado:

- RT-PCR qualitativo
- Ensaios de proteção à ribonuclease

• Necessidade de alta integridade:

- análise de Northern blotting http://www.ambion.com

- construção de uma biblioteca de cDNA

- análise de microarrays

Armazenamento
• -80°C ou azoto liq.
• Mais estável em NH4OAc/etanol.
51
• Aliquotar as soluções de RNA .
Bibliografia recomendada:

[1] José Luque, Angel Herraez “Biologia Molecular e Ingenieria Genética”-

Conceptos, técnicas y Aplicaciones en Ciencias de la Salud. Elsevier, 2006 (Tema
11)

•[2] Gautam, Akash. author.; Springer Link (Online service)” DNA and RNA Is
olation Techniques for Non-Experts”2022; Springer Nature eBook
(https://rmit.alma.exlibrisgroup.com/discovery/fulldisplay?docid=alma9922096428001341&context=L&vid=61RMIT_INST:RMITU
&lang=en&search_scope=EverythingNOTresearch&adaptor=Local%20Search%20Engine&tab=AllNOTresearch&query=sub,exa
ct,Molecular%20biology,AND&mode=advanced&offset=50)

52