Genética Molecular e

Humana

Aula Teórico-Prática

Joana Liberal
Teresa Coelho
 Material biológico para
isolamento de ácidos nucleicos
 Extracção de ácidos nucleicos
Isolamento das células (exemplos)

Isolamento de células para extracção de DNA/RNA de sangue periférico:

1. Colher o sangue em tubos contendo EDTA
(tubos de hemograma);
2. A 8-10 mL de sangue periférico adicionar o
reagente de lise de eritócitos até perfazer
50 mL. Agitar suavemente invertendo os
tubos;
3. Manter os tubos em gelo 30 min;
4. Centrifugar a 1500 rpm/4ºC/10 min;
5. Rejeitar o sobrenadante;
6. Voltar adicionar o reagente de lise de
eritrócitos ao pellet e ressuspender;
7. Centrifugar a 1500 rpm/4ºC/10 min;
8. Rejeitar o sobrenadante;
Nota: Precauções com o anticoagulante escolhido → heparina é um inibidor
da amplificação por PCR
9. Adicionar tampão fosfato-salino até 50 ml e
ressuspender o pellet;
10. Centrifugar a 1500 rpm/4ºC/10 min;
11. Rejeitar sobrenadante;
12. Dividir o pellet em duas partes e transferir
para tubos de eppendorf;
13. A um dos tubos adicionar o reagente de
extracção e preservação de DNA e
congelar a -80 ºC;
14. Outro tubo congelar directamente a -20 ºC
ou a -80 ºC;

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 Extracção de ácidos nucleicos
Isolamento das células (exemplos)
Isolamento de células para extracção de DNA/RNA de tecidos preservados em parafina:

1. Usar 2-3 cortes de 7-10 µm de tecido fixado em formol tamponado e preservado em parafina
2. Colocar os cortes em eppendorfs de 1,5 mL
3. Desparafinar com 1 mL de xilol/37 ºC/30 min;
4. Centrifugar a 15000 rpm durante 5 min;
5. Rejeitar o sobrenadante;
6. Repetir o tratamento com xilol durante 15 min e centrifugar a 15000 rpm durante 5 min;
7. Lavar 2x com 500 µL de EtOH absoluto;
8. Centrifugar a 15000 rpm durante 5 min;
9. Remover o máximo de etanol com uma pipeta;
10. Iniciar de imediato a extracção

O micrótomo deve ser limpo entre o processamento de cada caso e as facas mudadas – Evitar
contaminação de DNA/RNA

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 Extracção de ácidos nucleicos
Isolamento das células (exemplos)
Isolamento de células para extracção de DNA/RNA a partir de exfoliados:

1. Colocar a zaragatoa num tubo de 50 mL (falcon);

- Se tiver vestígios de sangue adicionar o reagente de lise de eritócitos;
- Manter o tubo no gelo durante 30º min;
- Centrifugar a 2000rpm/4ºC/10 min; Mantém pH
constante
- Rejeitar sobrenadante;
isotónico e não
Ou tóxico para células

- Se não tiver vestígios de sangue adicionar PBS (tampão fosfato salino) (até 50 mL;
- Centrifugar a 2000rpm/4ºC/10 min;
- Rejeitar sobrenadante;

2. Dividir o pellet para dois eppendorfs;

3. A um dos tubos adicionar o reagente de extracção e preservação de DNA e congelar a -80ºC a
outro congelar directamente a -20ºC ou -80 ºC.

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 Extracção de ácidos nucleicos
Uma vez isoladas as células…

A extração de DNA consiste em três etapas fundamentais:

1) Lise ou ruptura (física e/ou química) das membranas celulares para liberação do
material genético:
- Aquecimento, digestão enzimática, detergente e solução salina

2) Purificação - Separação do DNA dos demais componentes celulares:

- Coluna, solvente orgânico e NaCl

3) Precipitação DNA
- Etanol e acetona

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 Extracção de ácidos nucleicos
DNA de qualidade elevada
Método de extracção
Elevada pureza
enzimático Sem contaminantes

1) Colher o sangue em tubos contendo *EDTA (tubos de hemograma);

2) A 10ml de sangue total adicionar três volumes de solução de lise de glóbulos vermelhos;
3) Após homogenização, centrifugar a 2500 rpm, durante 15 minutos, a 4ºC;
4) Ressuspender o pellet em dois volumes de solução de lise de glóbulos vermelhos;
5) Centrifugação a 2800 rpm, durante 15 minutos a 4ºC;
6) Ao sedimento de leucócitos (pellet), adicionar 3 ml de um tampão de lise de glóbulos brancos,
350 µl de SDS (dodecil sulfato de sódio) a 10% e 60 µl de proteínase K (10 mg/ml);
7) Incubar as amostras num shaker a 42ºC, em agitação contínua, durante a noite;
8) Adicionar uma solução saturada de NaCl 6 mM;
9) Centrifugar a 3750 rpm, durante 30 minutos, à temperatura ambiente;
10) Adicionar ao sobrenadante recolhido dois volumes de etanol absoluto frio para precipitação do
DNA genómico;
11) Lavar com uma solução de etanol a 70% e ressuspender numa solução de Tris-EDTA (Tris-HCl 10
mM, Na2EDTA.2H2O 1 mM, pH 8);
12) Preservar as amostras foram conservadas a 4ºC.

*EDTA (sal dihidratado dissódico) impede degradação de DNA, inibindo a ação de DNases
 Extracção de ácidos nucleicos
DNA de qualidade elevada
Método de extracção
Elevada pureza
enzimático Sem contaminantes

Solução de Lise Celular (expor o DNA)

▪ SDS (dodecil sulfato de sódio) – detergente
iónico que dissolve as membranas celulares e
desnatura proteínas de modo a que fiquem
mais susceptíveis à clivagem com proteases;
▪ Proteínase K – elimina as proteínas nucleares
que estão ligadas ao DNA e as enzimas
citoplasmáticas que destroem o DNA
(nucleases); a temperatura (55-60ºC) auxilia a
digestão.

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 Extracção de ácidos nucleicos
DNA de qualidade elevada
Método de extracção
Elevada pureza
enzimático Sem contaminantes

NaCL

▪ Na+ – liga-se aos grupos fosfatos do DNA,

neutralizando a sua carga eléctrica;
▪ NACL – faz com que as proteínas se agreguem,
facilitando o processo de precipitação do DNA.

EtOH absoluto frio

▪ O DNA não se dissolve em álcool;
▪ O DNA quando em contacto com o EtOH, forma
um novelo e precipita em solução;
▪ As moléculas de DNA precipitado parecem longos
fios em rede.

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 Quantificação de
ácidos nucleicos
(Espectrofotometria)

✓ As bases azotadas que constituem o DNA absorvem a um

comprimento de onda de 260 nm;
✓ considerando que uma unidade de densidade óptica (a 260
nm) corresponde a 50 µg/ml de DNA em cadeia dupla e 40
µg/ml de DNA ou RNA de cadeia simples:

[DNA] (μg/ml) = D.O. 260 nm X 50 x fator de diluição

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 Determinação da pureza
ácidos nucleicos
As bases azotadas que Os resíduos de aminoácidos
constituem o DNA das proteínas absorvem
absorvem 260 nm a 280 nm

A pureza do DNA é calculada efectuando a

razão entre a densidade óptica a 260 nm e
a densidade óptica a 280 nm.

✓ 1.8 e 2.0 são referenciados os valores óptimos da mesma

✓ Valores abaixo deste intervalo indicam contaminação com

proteínas ou solventes orgânicos (dependendo do método de
extracção)

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 PCR
Polymerase Chain Reaction

1983 – Inventa o processo de amplificação de DNA in

vitro – PCR

1985 – Publica o trabalho

1993 – Ganhou o Prémio Nobel da Química

Atualmente é uma das técnicas mais utilizadas em

laboratórios de Biologia Molecular

Kary Mullis

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 PCR
Polymerase Chain Reaction

É uma técnica in vitro que tem como princípio básico a amplificação

exponencial de um fragmento de DNA genómico de uma cadeia molde

Permite a produção de mais de 10 milhões de cópias da sequência alvo

• Detecção de infecções patogénicas em limites

baixos
Alta especificidade
• Amplificação de uma molécula rara numa Elevada sensibilidade
mistura de moléculas de DNA/RNA
• Identificação de sequências de DNA a nível Rápida
individual
Simples

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 PCR
Polymerase Chain Reaction

DNA molde

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 PCR
Polymerase Chain Reaction
Tampão • Essencial para manter o pH da mistura da reacção

• Os iões Mg formam complexos com os dNTPs, primers e DNA

MgCL2 molde sendo co-factores enzimáticos da DNA polimerase

• Os 4 desoxinucleótidos (dATP, sCTP, dGTP e dTTP) devem estar

*dNTPS presentes em igual concentração e são os blocos de construção
das cadeias de DNA nascentes

• Enzima isolada da bactéria Thermus aquaticus

Taq polimerase • Enzima termoestável que catalisa a reacção adicionando dNTPS à
cadeia complementar que está a ser sintetizada
•Pequenas moléculas sintéticas de DNA de cadeia simples que
Primers flanqueiam a região do DNA molde a ser copiada
•Necessita de uma temperatura específica para a ligação
•dATP (desoxiAdenosina Trifosfatada)
•dCTP (desoxiCitidina Trifosfatada) *Desoxirribonucleotídeos Fosfatados dNTP’s são nucleotídeos do DNA
•dGTP (desoxiGuanosina Trifosfatada)
•dTTP (desoxiTimidina Trifosfatada)
 PCR
Polymerase Chain Reaction

✓ A reação é efetuada num termociclador,

que permite controlar a temperatura,
aquecendo e arrefecendo os tubos que
contêm a mistura de reacção de forma
eficiente e rápida

✓ Na reação de PCR existem 3 etapas

fundamentais:
desnaturação, annealing e extensão,
que são repetidas habitualmente entre 30
a 40 vezes – Ciclos de temperatura

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 PCR
Polymerase Chain Reaction

1. Desnaturação
- Incubação do DNA a uma temperatura de cerca de 95ºC para separar a
cadeias dupla, obtendo-se duas cadeias simples;
- ~ 1 a 2 minutos

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 PCR
Polymerase Chain Reaction
Algumas regras para o desenho de primers:

• Devem ter entre 17-28 bases de comprimento;

• A composição de bases deve ser de aproximadamente 50-60% (G+C)
• Devem terminar a 3’ numa C ou G (CG ou GC): maior estabilidade das pontes
de hidrogénio e aumenta a eficiência da interação;
• Temperatura de melting entre 55º-80ºC
• Devem ser evitadas sequências de 3 ou mais Cs e Gs nas extremidades 3’ dos
primers - podem induzir um emparelhamento incorrecto
• As extremidades 3’ não devem ser complementares – pode conduzir à
formação de dímeros de primers (primer dimers)
• A autocomplementaridade dos primers deve ser evitada – pode levar à
formação de estruturas do tipo hairpins

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 PCR
Polymerase Chain Reaction
2. Annealing (~50-60ºC)
- Emparelhamento dos primers à molécula de DNA molde

- Temperatura específica para cada par de primers – Temperatura de annealing

- A temperatura de annealing depende, entre outros fatores, do tamanho do
primer e de sua sequência de nucleotídeos:
- Se um primer tem um comprimento não muito superior a 25 nucleotídeos:
(A, T, G e C são as quantidades
Temperatura de *melting (Tm) = 4(G + C) + 2(A + T) de cada base componente do
primer)

Temperatura de annealing = Tm - 5ºC

*Temperatura em que metade das cadeias estão na forma de dupla hélice e a outra metade estão em cadeias simples
 PCR
Polymerase Chain Reaction
3. Extensão (72ºC)

- Síntese de novo DNA através do

emparelhamente dos dNTPs no
DNA molde
- A enzima Taq polimerase faz a
elongação dos primers, usando
como molde a cadeia que cada
primer está emparelhado
- A Taq DNA polimerase é uma
enzima termoestável, que actua à
temperatura óptima de 72ºC e que
permanece estável ao longo dos
vários ciclos.

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 PCR
Polymerase Chain Reaction

• Etapa inicial de desnaturação e etapa final de extensão mais longas

→ optimização da reacção

Desnaturação (5-10 min)

Desnaturação (1-2 min)
Annealing (1-2 min) 30 a 40 ciclos → elevadíssimo número de cópias
Extensão (1-2 min)
Extensão (7-10 min)

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 PCR
Polymerase Chain Reaction

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 PCR
Polymerase Chain Reaction
Deteção da amplificação
A electroforese dos produtos de amplificação

1 2 3 4 5 6

200pb

Electroforese, em gel de agarose a 2%, dos produtos de amplificação referente ao polimorfismo 267C/T do
gene 5-HT6. De 1 a 4 estão representadas as bandas de amplificação de 3 amostras de DNA estudadas. Em 5
está indicado o controlo negativo da reacção de amplificação e 6 representa o marcador de peso molecular
Gene RulerTM 100 bp DNA ladder . fragmento de amplificação é de 200 pb.

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 PCR
Polymerase Chain Reaction

Fatores que influenciam a eficiência da reação:

• Tempo e temperatura de desnaturação

• Tempo e temperatura da extensão
• Temperatura de annealing
• Número de ciclos
• Desenho dos primers

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 PCR
Polymerase Chain Reaction
Variações da técnica de PCR

➢ Hot-start PCR
➢ Touch-down PCR
➢ Nested-PCR
➢ Multiplex-PCR
➢ RT-PCR
➢ Real-time PCR

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 Hot-start PCR

• Permite obter produtos de

amplificação mais específicos;

• A polimerase está associada a

um anticorpo que se desnatura
e ativa a enzima ao atingir a
temperatura de 960C.

Quando a reação de PCR é conduzida com DNA

molde de baixa cópia em condições reacionais
complexas ou quando a preparação da reação
(temperatura ambiente) é demasiadamente
prolongada.
A atividade da polimerase é bloqueada a
temperatura ambiente e reestabelecida
automaticamente durante o primeiro passo de
desnaturação.
 Touch-down PCR

• A temperatura de annealing é programada para diminuir 1-3ºC em cada

ciclo;

• Elevada especificidade e óptima amplificação – menos tempo de

optimização

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 Nested PCR

• São usados dois primers para amplificar

um único locus

• O primeiro par amplifica o locus como um

PCR normal

• O segundo par, amplifica uma região mais

pequena dentro da primeira região
amplificada

• Se um locus errado for amplificado a

probabilidade de voltar a ser amplificado
com um segundo par de primers é muito
reduzida

• Maior especificidade
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 Multiplex PCR

• São utilizados mais do que um

par de primers na primeira
reação

• O uso de primers com

temperaturas de annealing
semelhantes permite a
amplificação de mais do que um
locus na mesma reação de PCR

• Amplificação na mesma reacção

de mais do que um fragmento –
poupança de tempo

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 RT-PCR

RT-PCR – Reverse-transcriptase
PCR

• Deteção e quantificação de mRNA

• Permite estudar a expressão dos

genes

• É fundamental obter RNA sem

contaminação com DNA

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 Real time PCR

▪ Permite a quantificação dos produtos de

amplificação à medida que ocorrem os
ciclos de PCR

▪ Deteção e quantificação de uma sonda ou

repórter fluorescente, cujo sinal aumenta em
proporção directa com a quantidade de
produto de PCR da reacção

▪ Técnica com elevada especificidade e

sensibilidade; pode-se quantificar o produto
de PCR em cada ciclo; não requer análises
posteriores à reação e amplificação

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