Purificação de DNA a

partir de Células Vivas

 https://learn.genetics.utah.edu/content/labs/
extraction/
Quando Extrair....
Tipos de DNA

 Celular Total

 Plasmidial puro

 Partículas virais
Principais Etapas
Principais Etapas
Extração de DNA Total
1- Cultivo celular: Crescimento da cultura
bacteriana
 Meios específicos que atendem às necessidades de cada organismo.

Meio M9
6,0 g/L Na2HPO4
3,0G/L NH2PO4 LB (Luria-Bertani) :
0,5 g/L NaCl
1,0 g/L NH4CL 10,0 g/L Triptona
0,5 g/L MgSO4
2,0 g/L Glicose
0,015 g/L de CaCl2 5,0 g/L
Extrato de Levedura
+ elementos traços e vitaminas
Meio indefinido
10,0 g/L NaCl
Meio Definido
Extração de DNA Total

 Crescimento E. coli :
 LB,
 37ºC
 sob aeração (150 a 250 rpm)
 Densidade máxima 2 a 3 x 109 células/mL
 D.O.600 entre 2,5 e 4

 Concentração de células
 Centrifugação em velocidades moderadas, para
criação do precipitado (pellet)
Sedimentação das células via
centrifugação
Extração de DNA Total

2- Rompimento Celular

 Rompimento de :
 Membrana plasmática
 Parede celular

 Métodos Físicos
 Forças mecânicas - Sonicação, Nitrogênio líquido,
maceração Gral.
Extração de DNA Total
 Métodos Químicos
 Dependem da bactéria em questão.
 E. coli:
 Lisozima: enzima capaz de destruir compostos
poliméricos que conferem rigidez a parede.
 Tetracetato de etileno diamina (EDTA): remove íons
de Mg desestabilizando o envoltório celular e também
inibe enzimas capazes de degradar o DNA
 Dodecil sulfato de sódio(SDS): Detergente que auxilia
na remoção de molécula de lipídio.
Extração de DNA Total

3- Remoção dos constituintes celulares

 Remoção de proteínas:
 Proteinase K
 Solução de fenol ou fenol/clorofórmio 1:1
 Remoção de RNA
 Fenol (remove
apenas parte)
 Ribonuclease (RNAse)

Remoção de proteínas com fenol

Extração de DNA Total

4- Concentração das soluções de DNA

 Precipitação com etanol na presença de NaCl à -
20ºC
 Centrifugação
 Ressuspensão em volume adequado.
 Medição da concentração do DNA em D.O260 em
luz ultra-violeta (U.V.). Absorbância de 1= 50g
de DNA fita dupla/uL.
Extração de DNA plasmidial
 Preparação semelhante ao DNA total.
 Passo adicional: separação do DNA
cromossômico do DNA plasmidial.
 Separação baseadas na diferenças dos
DNAs
 Tamanho
 Conformação
Extração de DNA plasmidial
 Separação baseada no tamanho.

 Acontece durante a lise celular

 Rompimento brando das células com EDTA,
lisozimana e sacarose(impede o rompimento
imediato das células)
Extração de DNA plasmidial
 Separação baseada no tamanho.

 Indução da lise usando detergentes não-iônicos

(Triton X-100)
 Ocorrem quebras de cromossomos, podendo
estes permaneceram no sobrenadante.
 Outros métodos auxiliares para remoção dos
contaminantes
Extração de DNA plasmidial
 Separação baseada na conformação

 Faixa de pH(12,0 a 12,5) onde o DNA

cromossômico é desnaturado, mas o plasmidial
não. (Desnaturação alcalina).

 Add de NaOH, as moléculas de DNA não super-

helicoidizada é desnaturada.
Extração de DNA plasmidial
 Separação baseada na conformação

 Add ácido para neutralizar a solução, (pH7,0) e o

DNA desnaturato se agrega desorganizadamente
formando uma massa, que é sedimentada e
removida.

 Lise SDS e neutralização com Acetato de sódio,

 a maior parte das proteínas e do RNA podem ser
removidos por centrifugação, sem necessidade de
fenol e ribonuclease.
Extração de DNA plasmidial
Visualização DNA
Separação por Eletroforese
COMO EU VISUALIZO O DNA EXTRAÍDO?
 ELETROFORESE

Fragmentos
maiores de
DNA

DNA sempre migra do polo

negativo para o polo Fragmentos
menores de

positivo!
DNA se
movem mais
rápido e
chegam mais
longe
SISTEMA DE ELETROFORESE

Fragmento de DNA

+
ELETROFORESE
ANÁLISE DO RESULTADO

ou 23,130 Kbp
GEL DE ELETROFORESE

http://www.dnalc.org/resources/animations/gelelectrophoresis.htm
l
Eletroforese
• Separação de macromoléculas com tamanhos e cargas diferentes.
• Agarose ou acrilamida