Técnicas de Genética Molecular Guia das Aulas Práticas, 2ª ed.

4 Purificação de DNA plasmídico de Escherichia coli

4.1 Introdução
Os plasmídeos são moléculas extra-cromossómicas de DNA de cadeia dupla (dsDNA), que
ocorrem naturalmente em bactérias e algumas leveduras, existindo numa forma parasítica ou
simbiótica dentro da célula hospedeira. Tal como o DNA genómico (gDNA) do hospedeiro, o
pDNA é duplicado antes de cada divisão celular. Durante a divisão celular, cópias do pDNA são
segregadas para cada célula-filha, assegurando a propagação do plasmídeo às sucessivas gerações
da célula hospedeira. Uma vez que os plasmídeos podem ser utilizados como vetores de
clonagem, a purificação de pDNA surge como um processo fulcral na tecnologia de DNA
recombinante, tanto para a preparação de vetores como para a análise de clones recombinantes.

A purificação de DNA plasmídico (pDNA) implica a utilização de um método que permita reter
o pDNA e descartar o gDNA. O método mais utilizado para purificação de pDNA é o método
da lise alcalina, desenvolvido em 1979, por Birnboim e Doyle. Este método baseia-se nas
seguintes etapas:

1. Cultura e recolha de células

O procedimento começa com o crescimento de cultura bacteriana contendo o plasmídeo de

interesse. Quando o crescimento necessário é atingido, as células são recolhidas por
centrifugação, de modo a remover o meio de cultura.

2. Ressuspensão

As células são então ressuspendidas numa solução contendo Tris, EDTA, glucose e RNase A. A
presença de catiões divalentes (Mg2+ ou Ca2+) promove a atividade das DNases e ajuda a
manter a integridade da parede celular bacteriana. O EDTA forma quelatos com os catiões
divalentes, prevenindo assim a degradação do plasmídeo pelas DNases e ajuda a destabilizar a
parede celular. A glucose mantém a pressão osmótica, evitando que as células rebentem,
enquanto que a RNase A degrada o RNA.

3. Lise

O tampão de lise contém hidróxido de sódio e SDS. O SDS ajuda a solubilizar a membrana e
também desnatura a maioria das proteínas celulares, o que auxilia a separação do pDNA das
proteínas existentes em solução numa fase posterior do processo. Além de ajudar a quebrar a
parede celular, o NaOH quebra as ligações de hidrogénio entre as bases de DNA, convertendo
o DNA de cadeia dupla (dsDNA), incluindo o gDNA e o pDNA, em DNA de cadeia simples
(ssDNA). Esta desnaturação é a parte central do processo de purificação. É importante que a
lise seja realizada de forma gentil, de modo a não fragmentar o gDNA.

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4. Neutralização

A adição de acetato de potássio diminui a alcalinidade da mistura. Nestas condições, são

restabelecidas as ligações de hidrogénio entre as bases de DNA, de forma a que o ssDNA possa
renaturar e formar dsDNA. No entanto, esta renaturação é seletiva: enquanto que moléculas
de pequenas dimensões como o pDNA renaturam facilmente, para moléculas grandes como o
gDNA a renaturação de forma correta é virtualmente impossível. É por esta razão que a lise
deve ser feita de forma gentil, garantindo que não existem fragmentos de gDNA de pequenas
dimensões que possam renaturar com sucesso, contaminando a purificação do pDNA. Enquanto
que o pDNA de cadeia dupla é facilmente solubilizado, o gDNA de cadeia simples, o DAS e as
proteínas desnaturadas mantém-se juntas através de interações hidrofóbicas, formando um
precipitado branco. Este precipitado pode ser facilmente separado da solução contendo pDNA
por centrifugação.

5. Lavagem e concentração

Após os passos descritos, o pDNA encontra-se numa solução contendo elevadas concentrações
de sal, EDTA, RNase e resíduos celulares, pelo que não pode ser diretamente utilizado. Existem
várias formas de limpar e concentrar o DNA purificado, incluindo a extração por
fenol/clorofórmio seguida de precipitação com etanol ou através da utilização de métodos
baseados em cromatografia.

Tal como outros métodos tradicionais para purificação de ácidos nucleicos, o método da lise
alcalina resulta na purificação de pDNA de elevada qualidade de forma relativamente barata. No
entanto, a utilização deste método para purificar pDNA a partir de um grande número de
amostras pode tornar-se moroso e pouco conveniente.

Por esta razão existem kits comerciais, alternativas bastante eficientes e muito mais rápidas, que
combinam os princípios da purificação por lise alcalina com os princípios da adsorção seletiva
do DNA a membranas de sílica. As colunas utilizadas por este tipo de kit, possuem uma
membrana de sílica. Na presença de elevadas concentrações de sal, o DNA liga-se à membrana.
Os contaminantes são eliminados na presença de sal e /ou etanol, de forma a que o DNA se
mantenha ligado à membrana de sílica. Para recuperar o DNA, a eluição é efetuada na presença
de um tampão com baixas concentrações de sal ou na presença de água, havendo assim quebra
das ligações entre o DNA e a membrana de sílica.

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Figura 4.1-1 Principio de funcionamento das colunas de sílica com afinidade para ácidos nucleicos.

Nesta aula prática será utilizado para a purificação de pDNA o kit NZYMiniprep, cujo
protocolo está graficamente representado na figura 3-2.

Figura 4.1-2 Purificação de pDNA, utilizando o kit NZYMiniprep.

4.2 Reagentes e equipamentos

 Meio LB
 Estirpes E. coli (com plasmídeo)
 Kit NZYMiniprep (NZYtech, MB01001)
 Microcentrifuga
 Micropipetas e pontas
 Microtubos
 Vortex

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Cuidados a ter em relação ao kit de Miniprep:

Até ser usado pela primeira vez, todos os components do kit podem ser armazenados à
temperatura ambiente (20-25 °C).

Na primeira utilização do kit:

 Antes de usar pela primeira vez, adicionar 1 mL do Buffer A1 ao vial de RNase A vial e
vortex. Transferir essa solução para o recipient do Buffer A1 e agitar cuidadosamente.
A partir deste momento o Buffer A1 deve ser armazenado a 4 °C para uso frequente
ou a -20 °C se o uso é mais infrequente.
 Adicionar 32 mL (MB01001) de etanol 100%, de grau P.A. ou para Biologia Molecular
ao Buffer A4.

Sempre:

 O Buffer A2 tende a formar precipitados. Se necessário, aquecer a solução a 37ºC

para dissolver os sais.
 Os Buffers A3 and AY contém “guanidine hydrochloride” ou hidrocloreto de
guanidina, que é perigoso. Use luvas quando usar o kit.

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4.3 Procedimento experimental

Preparação do inóculo – Realizado pelo docente no dia 18/11/2018

A preparação do inóculo de células a partir do qual vai ser purificado o DNA plasmídico deve
ser feita no dia anterior à purificação.

1. Inocular à chama um erlenmeyer de 250 ml contendo 100 ml de meio LB com células

de E. coli transformadas com o plasmídeo a purificar, conservadas a -80°C ou de placa
fresca.
2. Incubar o inóculo a 37ºC e 180 rpm, numa incubadora orbital durante cerca de 16 h.

Extração de DNA plasmídico - 19/11/2018

1. Recolha de células de E. coli

1.1. Transferir 1.5 ml de inóculo para um microtubo de 2mL.

1.2. Centrifugar à velocidade máxima durante 5 minutos.
1.3. Descartar o sobrenadante, mantendo o pellet celular.
1.4. Transferir mais 1.5 ml de inóculo para o mesmo microtubo (que contém o pellet celular
anterior)
1.5. Centrifugar à velocidade máxima durante 5 minutos.
1.6. Descartar novamente o sobrenadante, mantendo o pellet celular.
2. Lise Celular
2.1. Ressuspender o pellet celular em 250µL Tampão A1, usando o vortex vigorosamente.
2.2. Adicionar 250µL de Tampão A2, misturando por inversão do tubo 6-8 vezes. NÃO
usar o vortex.
2.3. Incubar à temperatura ambiente, durante um máximo de 4 minutos.
2.4. Adicionar 300µL de Tampão A3, misturando por inversão do tubo 6-8 vezes. NÃO
usar o vortex.
3. Clarificação do lisado
3.1. Centrifugar durante 10 min a 11 000 x g, à temperatura ambiente.
4. Ligação do DNA à coluna
4.1. Colocar uma coluna num tubo coletor de 2mL.
4.2. Carregar o tubo coletor com o sobrenadante resultante do passo 3
4.3. Centrifugar a 11 000 x g durante 1 min, descartando o conteúdo do tubo coletor.
5. Limpeza da membrana de sílica

5.1. Adicionar 500μL de Tampão AY à coluna. Centrifugar a 11 000 x g durante 1 minuto.

Descartar o conteúdo do tubo coletor.

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5.2. Adicionar 600µL de Tampão A4 à coluna. Centrifugar a 11 000 x g durante 1 minuto.

Descartar o conteúdo do tubo coletor.
6. Secagem da membrana de sílica
6.1. Inserir a coluna no tubo coletor vazio. Centrifugar a 11 000 x g durante 2 minutos.
7. Eluição do DNA plasmídico
7.1. Colocar a coluna num microtubo de 1.5mL (novo) e adicionar 50 µL de tampão AE (1).
7.2. Incubar durante 1 minuto à temperatura ambiente. Centrifugar durante 1 minuto.
7.3. Repetir os passos 7.1 e 7.2 para aumentar o rendimento (usar o mesmo microtubo,
reunindo os 2 eluidos para o mesmo tubo).

NOTA: É extremamente importante que o tampão de eluição seja adicionado na zona central
da coluna. A incubação da coluna a temperaturas mais elevadas(37-50°C) pode aumentar o
rendimento no caso de plasmídeos de grandes dimensões (>10.000bp). Aquecer previamente o
tampão de eluição (55-80°C) também pode aumentar ligeiramente a eficiência da eluição. Se for
utilizada água para a eluição, o seu pH deve estar entre 7.0 e 8.5. A eficiência de eluição está
dependente do pH; um pH<7.0 pode diminuir o rendimento.

8. Medir a absorvância de uma solução de DNA purificado a 260nm, 230nm e 280nm, tendo o
cuidado de utilizar como branco o tampão em que foi realizada a eluição do pDNA. Calcular
a concentração e as razões indicadoras de pureza para a solução de DNA purificado.

4.4 Referências bibliográficas

NZYMiniprep User Brochure (EN)

Engebrecht, J., Brent, R., Kaderbhai, M. Minipreps of plasmid DNA. Current Protocols in
Molecular Biology (1991) 1.6.1-1.6.10.

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