AULA PRÁTICA

EXTRAÇÃOE E PURIFICAÇÃO DE DNA GENÔMICO

Aline Sampaio Cremonesi

PRINCÍPIO
Talvez o mais básico de todos os procedimentos em clonagem molecular seja a extração e
purificação de DNA, tanto cromossomas quanto o plasmidial. O protocolo abaixo se destina a
extração de DNA cromossômico de células procariontes gram-negativas. Neste caso, a simples
combinação de detergentes tônicos e substâncias alcalinas é suficiente par o rompimento da parede
celular. O RNA pode ser removido pelo uso de enzimas RNAses puras ou por ultracentrifugação
isopícnica em gradiente de cloreto de césio (CsCl) que garante alta qualidade e pureza da amostra
de DNA. Já as proteínas são removidas com o uso de solventes como fenol, clorofórmio e álcool
isoamílico. Este método permite amostras suficientemente puras para serem digeridas por enzimas
de restrição, usados em reações de PCR e, posteriormente, seguirem os procedimentos de clonagem.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- extrair DNA genômico de cepas de E. coli;
- Conhecer os princípios básicos da técnicas de extração de DNA genômico;

REAGENTES
As minipreparações de DNA são geralmente realizadas a partir de colônias de bactérias que
foram obtidas em manipulações recentes, ou seja, no máximo há cerca de uma semana. Não há
necessidade de material estéril para realização deste protocolo.
A minipreparação é um procedimento simples e eficiente para o isolamento de DNA
genômico. Os reagente utilizados e suas aplicações na minipreparação são:

* Solução GTE (Glicose/Tris/EDTA): a glicose funciona para manter a pressão osmótico,

enquanto o Tris tampona as células em pH 8.0. O EDTA liga-se a cátions divalente da bicamada
lipídica, fragilizando-a. Em seguida o EDTA evita a degradação do DNA, ligando-se a íons
Mg2+, que são cofator necessários para a ação das nucleares bacterianas. Preparar as soluções
separadamente:
50 mM Glicose
25 mM Tris HCl pH 8,0
10 mM EDTA

 * Solução SDS/NaOH: Esta mistura alcalina lisa as células bacterianas. O detergente SDS dissolve
os componentes lipídicos do envelope celular. O NaOH degrada a parede celular e desnatura os
DNAs plasmidial e cromossômico em cadeias simples; os círculos intactos do DNA plasmidial
permanecem concatenados.
200 mM NaOH
1% SDS
NÃO JUNTAR OS REAGENTES ANTES DA AULA. Fazer estoque 1M de NaOH e
20% SDS. O SDS pode dissolver melhor se a água for aquecida, não fervida. Quando for juntar, a
água deve ser colocada antes ou entre um e outro reagente, NUNCA depois, se não precipita.

* Acetato de Sódio 5M: Precipita o SDS da suspensão celular, juntamente com os lipídeos e
proteínas associados. O DNA cromossômico parcialmente renaturalização fica preso ao
precipitado SDS/lipídeo/proteína. Apenas os DNAs plasmidial menores, fragmentos do DNA
cromossômico e moléculas de RNA escapam ao precipitado e permanecem em solução.

* Isopropanol gelado: o isoprapanol rapidamente precipta os ácidos nucleicos, enquanto as

proteínas precipitam mais lentamente.Portanto, uma precipitação rápida leva para baixo
preferencialmente os ácido nucleicos.

* Etanol 70% gelado: a água presente no etanol 70% remove alguns sais e o SDS remanescente da
preparação.

* Solução TE (Tris/EDTA): o Tris tampona a solução de EDTA protege o DNA da degradação por
DNAses, ligando-se aos cátions divalentes (especialmente Mg2+), que são cofatores necessários
para a atividade da DNase.
10 mM Tris HCl pH 8,0
1,0 mM EDTA

DETALHES DA TÉCNICA: Tenha cuidado para não agitar em excesso a preparação; a

manipulação excessiva provoca a fragmentação tanto do DNA cromossômico quanto do plasmidial.
O sucesso deste protocolo depende muito da preservação do DNA cromossômico. A fragmentação
mecânica diminui o rendimento de DNA, de alta qualidade, e aumenta a contaminação. Certifique-
se de que a microcentrífuga estará imediatamente disponível após a precipitação com etanol
absoluto (passo 13). Se você estiver compartilhando a microcentrífuga, combine com os outros
colegas para iniciar os passos 12 e 13 juntos.

 MATERIAL
* cultura líquida de E. coli * solução desinfetante (Lysoform)
* micropipetadores P100, P200 e P1000 + * Centrífuga/microcentrífuga
ponteiras * toalhas de papel
* microtubos de 1,5 ml * Caneta marcadora
* recipiente com gelo moído (banho de gelo) * Suporte para tubos de eppendorf.
* recipiente para descarte das ponteiras * Becker de descarte
utilizadas

PROCEDIMENTO: ISOLAMENTO DO DNA CROMOSSÔMICO

Cada grupo fará uma preparação.
1. Cada grupo receberá 5 mL de cultivo bacteriano. Bata com os dedos nas laterais do tubo de
cultura para ressuspender as células de E. coli.
2. Marque um tubo com a letra da turma e número do grupo.
3. Feche a tampa e coloque o tubo em uma configuração equilibrada no rotor da centrífuga.
Centrifugue por 8 minutos a 8.000 rpm para precipitar as células.
4. Descarte o sobrenadante em um becker de descarte para posterior autoclavagem. Tome cuidado
para não ressuspender os precipitados de células. Inverta o tubo e toque sua borda com uma
toalha de papel limpa, para secar o melhor possível os restos do sobrenadante.
5. Adicione ao tubo 500 µL da solução GTE gelada. Ressuspenda o precipitado pipetando a
solução várias vezes. Olhe o tubo contra a luz para verificar se a suspensão está homogênea, ou
seja, se não há grumos de células visíveis.
6. Adicione ao tubo 200 µL da solução de SDS/NaOH à temperatura ambiente. Feche a tampa e
misture as soluções invertendo o tubo cerca de 5 vezes.
7. Coloque o tubo no gelo por 5 minutos. A suspensão vai se tornar relativamente transparente.
8. Adicione ao tubo 100 µL da solução de acetato de sódio gelada. Feche a tampa e misture as
soluções invertendo o tubo por 5 vezes. Um precipitado branco aparecerá imediatamente.
9. Coloque o tubo no gelo por 15 minutos.
10. Adicione ao tubo contendo o sobrenadante, 600 µl de isopropanol. CUIDADO! Coloque pela
parede do tubo.
11. Feche a tampa e misture as soluções invertendo o tubo por 5 vezes GENTILMENTE. Deixe o
tubo à temperatura ambiente por apenas dois minutos.
12. Coloque o tubo em uma configuração equilibrada no rotor da microcentrífuga e centrifugue por
5 minutos, 12.000 rpm para precipitar os ácidos nucleicos. Alinhe o tubo no rotor de modo que a
alça da tampa fique voltada para fora. O resíduo de ácido nucléico, visível ou não, ficará no
fundo do tubo sob a alça, durante a centrifugação.

13. Descarte o sobrenadante do tubo. Tome cuidado para não ressuspender o precipitado de ácidos
nucleicos. Retire o máximo possível do isopropanol remanescente com uma toalha de papel.
14. Adicione ao tubo 200 µL de etanol 70% e feche a tampa. Bata com os dedos na lateral do tubo
por várias vezes para lavar os precipitados. Coloque o tubo em uma configuração equilibrada no
rotor da microcentrífuga e centrifugue por 5 minutos, 12.000 rpm para coletar de novo o
precipitado de ácidos nucleicos.
15. Descarte o sobrenadante do tubo. Tome cuidado para não ressuspender o precipitado. Retire o
máximo possível do álcool remanescente com uma toalha de papel e deixe o tubo virado sobre o
papel na bancada.
16. Assegure-se de que o precipitado de ácidos nucleicos está seco e que todo o etanol evaporou,
antes de prosseguir com o próximo passo.
17. Segure o tubo contra a luz e confirme que não restam gotas de etanol, e que o precipitado de
ácidos nucleicos, se visível, aparece como um floco esbranquiçado. Cheire a boca do tubo, se o
etanol ainda estiver evaporando, um cheiro de álcool será detectado.
18. Adicione 40 µL da solução TE a cada tubo. Ressuspenda o precipitado pipetando várias vezes a
solução. Lave as paredes do tubo várias vezes, principalmente na área em que o precipitado deve
ter-se formado durante a centrifugação (abaixo da alça da tampa). Certifique-se de que todo o
DNA está dissolvido e de que não restam partículas na ponteira ou na parede do tubo.
19. Faça uma limpeza em sua bancada:
a. Coloque os tubos de cultura, tolhas de papel e ponteiras que tenham entrado em contato com
E. coli no recipiente designado para descarte.
b. Limpe a bancada com álcool.
c. Lave as mãos antes de deixar o laboratório.