EXTRAÇÃO DE DNA DE CÉLULAS NA MUCOSA /BIOLOGIA MOLECULAR

O objetivo desta prática é mostrar os procedimentos e cuidados necessários para a extração de DNA
usando método de coleta pouco invasiva de células da mucosa oral. O DNA gerado neste procedimento
é limpo, permitindo procedimentos moleculares como clivagem de DNA e reação de polimerização em
cadeia.

Os reagentes e procedimentos têm as seguintes funções:

- Tris: manter o pH da solução evitando quebras do DNA,
- SDS: ação detergente,
- EDTA: quelante, sequestra íons cofatores de enzimas, como DNAse, inativando-as
- Proteinase k: quebra proteínas e enzimas, deixando o DNA limpo e protegendo-o de enzimas
digestivas.
- Temperatura de 42º C: temperatura de ação da proteinase K além de potencializar a ação do SDS.
- Cloreto de sódio: neutraliza as cargas negativas do DNA promovendo a sua precipitação.
- Álcool etílico 98%: cria duas fases polares permitindo a precipitação do DNA.
- Álcool etílico 70%: é utilizado após a formação do pellet de DNA, pois ele mantém o pellet
enquanto a porcentagem de água faz a eluição do sal.

Material e métodos

Materiais Reagentes
- Espátula de plástico (cafezinho) - Solução de lise: - Tris HCl 10mM pH 7,6
- Tubo de microcentrífuga de 1 ml - EDTA 1mM
- Micropipetas de volumes variáveis - SDS 0,6%
- Ponteiras para micropipetas - 250µg/ml de proteinase K
- Banho-maria 42oC - NaCl 6M
- Caixa com gelo - Álcool etílico 98%
- Microcentrífuga - Álcool etílico 70%
- Água destilada autoclavada

Org an i zad o re s : In s titu to d e Bi olo gi a – U FP el

Professores: Monica L. Blauth; Fábio R. P. de Souza; Juliana Cordeiro De p art a me n to d e E co lo gia,
Acadêmicos: Daniele S. Souza, João H. F. de Oliveira, Carolina Pedriger Zool og ia e G en éti ca
Metodologia

1.1 Beber um pouco de água ou fazer bochecho para limpar a boca;

1.2 Fazer uma raspagem das células da mucosa com a espátula de plástico
(espátula para mexer cafezinho) e colocar em um tubo de microcentrífuga;
1.3 Aos tubos contendo a espátula de plástico, adicionar 200 µl de solução de lise e 5 µl de
proteinase K 10mg/ml;
1.4 Incubar 2h à 42oC;
1.5 Retirar a espátula e adicionar 42µl NaCl 6M;
1.6 Centrifugar por 1 min a 15.000 x g*;
1.7 Transferir o sobrenadante para um novo tubo e adicionar 2 vezes o volume de etanol 98%;
1.8 Agitar tubos e centrifugados por 1 min a 15.000 x g;
1.9 Descartar o etanol e lavar o pellet com 1ml de etanol 70%;
1.10 Centrifugar por 1min a 15.000 x g;
1.11 Repetir lavagem e centrifugação;
1.12 Manter os tubos abertos por 30min para evaporação do etanol;
1.13 Eluir em 60µl de água.

* A “velocidade” de centrifugação pode ser expresso em rpm, que significa rotações por minuto e
significa a quantidade de voltas que a centrífuga dá em um minuto. Ou, pode ser expressa em RCF
(Força Centrífuga Relativa) ou Força G (Força Gravitacional) que é a força exercida durante a
centrifugação. Algumas centrífugas podem expressar sua “velocidade” tanto em rpm quanto em g.
Para algumas centrífugas é necessário fazer a conversão, conforme a relação abaixo:
RCF ou Força G = 1,12 x R x (RPM/1000)² onde R é o raio do rotor da centrífuga em milímetros.

Referência bibliográfica

Abrão MG, Billerbeck AE, Nishi MY, Marui S, Mendonça BB (2005) Padronização da Técnica de extração de DNA de células
de mucosa oral com NaCl: aplicação no estudo do gene PROP1. Arq Bras Endocrinol Metab. 49: 978-982.

Laboratório Multiusuário de Estudos em Biologia I. Disponível em: http://lameb.ccb.ufsc.br/files/2012/09/A-

rela%C3%A7%C3%A3o-entre-RPM-e- RCF-ou-For%C3%A7a-G.pdf