MATERIAIS

AGUA DEPC

Microtubos , tesouras e pinças autoclavadas

Isopropanol gelado

Álcool 70 % gelado (feito com agua DEPC)

Beads magneticas

EXTRAÇÃO DE RNA TECIDUAL TRIZOL

1. Adicionar beads magnéticas (ver marcação verde na conchaespecifica para pegar beads)
em microtubos de 2 ml.

2. Adicionar 500 ul de Trizol ao microtubo.

3. Retirar o tecido do RNA later usando pinça e coloca-lo nos microtubos contendo as
beads e Trizol.

4. Homogeneizar as amostras usando precellys.

5. Incubar as amostras por 10 min a temperatura ambiente.

6. Adicionar 100 ul de clorofórmio e misturar vagarosamente usando vortex.

7. Centrifugar a 12000 x g por 15 min a 4º C.

8. Após a centrifugação a amostra é separada em 3 fases: um fase inferior (rosa), uma fase
intermediaria (branca) e uma fase aquosa superior (transparente). Transferir a fase
aquosa para tubos de 1,5 ml.

9. Precipitar o RNA da fase aquosa adicionando 250 ul de isopropanol gelado.

Homogeneizar bem em vortex.

10. Centrifugar a 12 000 x g por 10 min 4 ºC.

11. Descartar o sobrenandante, adicionar 500 ul de etanol 70 % gelado e misturar

vagarosamente no vortex. Centrifugar a 12 000 x g por 10 min a 4 ºC.

12. Descartar o sobrenandante, adicionar 500 ul de etanol 70 % gelado e misturar

vagarosamente no vortex. Centrifugar a 12 000 x g por 10 min a 4 ºC.

13. Descartar o sobrenadante e em seguida deixar o pellet secando (atentar para não deixar
o pellet secar totalmente).

14. Ressuspender o pellet em 50 ul de Agua DEPC. Quantificar o RNA em nanodrop.

Correr um gel de agarose 1,5 %.

15. Armazenar as amostras em -80 º C.