PROTOCOLO PARA ALICOTAR AS AMOSTRAS PARA EXTRAÇÃO DE DNA – SABURRA

LINGUAL
1. Separar os materiais e testar equipamentos
• Luvas
• Estante para eppendorfs
• Pipetas de 200 ul
• Ponteiras para pipetas de 200 ul esterilizadas.
• Eppendorfs esterilizados.
• Lixinho
• Caneta

• Gelo
• Isopor

• Máquina de gelo
• Vortex
• Fluxo.

2. Limpar o fluxo e ligar no UV com os materiais por 15 min

3. Retirar as amostras do freezer e colocar em um isopor com gelo

4. Após os 15 min, desligar o UV e vortexar as amostras por 10 segundos.

5. Identificar os eppendorfs

6. Aliquotar 100 ul de cada amostra e transferir para os eppendorfs novos,

identificados e esterilizados. Trocando sempre as ponteiras.

7. Guardar as amostras no freezer.

PROTOCOLO PARA EXTRAÇÃO DE DNA - SABURRA LINGUAL

Parte 1
1. Separar os materiais e verificar se os aparelhos estão funcionando.
• Luvas
• Estante para eppendorfs
• Pipetas de 200 ul
• Ponteiras para pipetas de 200 ul esterilizadas.
• Lixinho
• Caneta.

• Gelo
• Isopor

• Máquina de gelo
• Vortex
• Fluxo.
• Centrífuga

2. Retirar as amostras do freezer e colocar em um isopor com gelo

3. Ligar a centrífuga a 10.000 rpm / 4oC / 10min.

4. Limpar o fluxo e ligar no UV com os materiais por 15 min

5. Após os 15 min, desligar o UV

6. Vortexar as amostras por 10 segundos.

7. Centrifugar as amostras a 10.000 rpm / 4oC / 10min.

a. *Não esquecer de sempre distribuir as amostras na centrífuga de forma
balanceada e com as tampinhas viradas para o centro.
b. *Não esquecer de fechar a centrífuga com a tampa do rotor.

8. Descartar o sobrenadante (75 ul), deixando cerca de 25 ul de amostra.

9. Vortexar por 10 segundos para ressuspender o pellet.

10. Guardar as amostras no freezer.

Parte 2
Separar os materiais e testar equipamentos:

- eppendorf estéreis
- estantes para os eppendorf
- estantes para os tubos falcon, sendo:
• Tubo para mistura TCL+PK
• PK
• TCL
• MPC
• Isopropanol
• Etanol 70%
• TE
- ponteiras estéreis para micropipetas (200 μL e 1000 μL)
- micropipetas 200 μL e 1000 μL
- isopor
- gelo
- luvas sem talco
- canetas permanentes
- papel
- fita crepe
- lixo para descarte de ponteiras e líquido

- fluxo
- vortex
- centrífuga
- Banho Maria
- Máquina de gelo

1. Limpar o fluxo e ligar no UV com os materiais por 15 min

2. Após os 15 min, inverter a chave do fluxo para a posição “Luz”.

1. Ligar a centrífuga (colocar o rotor, ajustar a temperatura para 4oC, 12.000 rpm,
10 min).

1. Ligar o banho-maria na chave localizada atrás do equipamento. Ligar o

interruptor “Power” localizado na frente do equipamento. Verificar se a
temperatura está ajustada para 65oC. Após atingir 65oC ligar o interruptor
“Cooling”.

1. Buscar gelo nos isopores.

1. Separar as amostras que serão extraídas (as mesmas devem estar no -80oC).
Fotografar as amostras na estante.
ATENÇÃO: não colocar as amostras dentro do fluxo (se a luz UV estiver ligada).
1. Preparar a mistura de TCL (300 ul) + PK (2 ul) em tubo Falcon de 50ml
Cálculo para a mistura:
PK= (no de amostras + 2) x 2
TCL= (no de amostras + 2) x 300.

1. Adicionar 300 ul da mistura TCL+PK em cada amostra.

1. Vortexar as amostras por 3 segundos.

1. Colocar as amostras em banho-maria a 65oC por 5 minutos, retirar, secar,

vortexar por 5 segundos e retornar ao banho-maria. Fazer esse processo 3
vezes, totalizando 15 min de banho-maria.

1. Desligar o banho-maria.

1. Colocar as amostras no gelo por 5 min.

1. Adicionar 150 ul de MPC em cada amostra e vortexar por 10 segundos.

1. Centrifugar a 12.000 rpm / 4oC / 10min.

1. Preparar novos tubos estéreis para transferir o sobrenadante das amostras.

Identificar os tubos (com caneta permanente) com os mesmos nomes das
amostras (usar a foto inicial).

1. Após a centrifugação transferir 400 ul do sobrenadante para os tubos novos e

descartar o pellet. Obs.: usar uma ponteira para cada amostra.

1. Adicionar 500 ul de isopropanol e misturar vertendo os tubos fechados por 40

vezes (sanduíche de estantes).

1. Centrifugar a 10.000 rpm / 4oC / 10min.

1. Retirar os sobrenadantes vertendo os tubos em uma cubeta (plástica). Manter

os pellets.

1. Adicionar 200 ul de etanol 70%.

1. Centrifugar a 10.000 rpm / 4oC / 3min.

1. Retirar o etanol vertendo os tubos.

1. Adicionar 200 ul de etanol 70%.

1. Centrifugar a 10.000 rpm / 4oC / 3min.

1. Retirar o etanol vertendo os tubos e secar com papel toalha (só virar e
encostar os tubos no papel).

1. Deixar os tubos secando invertidos por 30 min (técnica com papel e fita crepe).

1. Desligar, retirar o rotor e higienizar a centrífuga.

1. Eluir as amostras com 20 ul de TE (se o tubo estiver seco).

1. Congelar no - 20 oC e no dia seguinte quantificar no nanodrop.

1. Higienizar com álcool, desligar o fluxo no botão vermelho e deixar o

interruptor no meio para desligar a lâmpada.

1. Descartar lixos e resíduos adequadamente.

1. Guardar materiais utilizados.