PROTOCOLO EXPERIMENTAL

Extração de DNA de Plantas e Fungos KIT NORGEN

NORGEN- Biotek

Orientações:

- Todos os materiais descritos fora do kit devem estar devidamente autoclavados

autoclavados.

- Ponteiras de 100, 200, 1000 µL;

- Bisturi

- Tubos do tipo eppendorf

- Beats

1° Etapa: Preparando o kit

- Diluir os reagentes com etanol conforme a descrição do fabricante:

- Solução WN- Adicionar 24 mL de etanol 96

96-100%.

- Solução A- 90 mL de etanol 96-100%

2° Etapa: Extração de DNA

1. Usa aproximadamente
ximadamente 100 mg de micélio de Fungo e colocar em um falcons de
fundo redondo e colocar as beats. Logo os tubos embebidos no nitrogênio líquido
até que as amostras fiquem completamente congeladas.
2. Adicionar 500 µL de tampão de lise e 1µL RNAse
se e colocar no
vórtex por 20 segundos
segundos.
3. Incubar a 65°C por 10 minutos homogeneiza
homogeneizarr de 2 a 3 vezes durante o banho.
4. 100 µL de bufferr de ligação homogeneização e incubar por 5 minutos.
minutos
5. Montar a coluna de filtro e (ubos sem tampa) e centrifugar
ifugar por 2 minutos a 20.000
g ou 14.000 rpm.
6. Retirar o filtro e colocar no sobrenadante a mesma quantidade de volume
vol com
etanol 70% e levar ao vó
vórtex
3° Etapa:
7. Montar a coluna com o anel cinza adicionar 650 µL utilizados na coluna
colu de
centrifugação por 1 minuto a 10.000 g ou 10.000 RPM
8. Descartar o sobrenadante
renadante se ainda houver sobre
sobrenadante na coluna e centrifugar
mais uma vez por um minuto
4° Etapa
9. Adicionar 500 µL de solução WN e centrifugar por um minuto a
10.000 g ou 10.000 rpm.
10. Descartar o sobrenadante e reconfigurar a coluna com o tubo de coleta.
coleta
11. Adicionar 500 µL da solução de lavagem A e centrifugar por um minuto.
minuto
12. Descartar o sobrenadante e reconfigurar a coluna de centrífuga com tubo de coleta
13. Repita o penúltimo e o último passo.
5° Etapa:: Eluição do DNA
14. Centrifugar a coluna A 20.000g ou 14.000 RPM para secar a resina e descartar
o tubo de coleta.
15. Colocar
olocar a coluna em um tub
tubo de 2 ml e adicionar o buffer B incubar por um minuto
em temperatura ambiente
16. Centrifugar
fugar a 10.000 g ou 10.000 rpm por um minuto.
17. Observação:: fazer a eluição adicional e repetir o passo
asso 4B e 4c usando 50 µL
de buffer (aumenta a qualidade entre 20
20-30%).
18. Para o armazenamento do DNA no tubo armazenar a 2 a 8 graus por alguns dias em
longo prazo é necessário armazenar – 20.