Protocolo extração DNA

1. Coloque até 50 mg de insetos em um tubo de micro centrífuga de 1,5 ml;

2. Adicione 180 μl de PBS e homogeneíze a amostra usando um homogeneizador
elétrico
Obs: sempre que for trocar de amostra, é necessário trocar a ponteira utilizada para
homogeneizar, a sonda deve ser cuidadosamente limpa entre as amostras;
3. Adicionar 20 μl de proteinase K e 200 μl de Tampão AL (sem adição de etanol).
Misture bem no vórtex
Incubar a 56°C por 10 min.
4. Adicione 200 μl de etanol (96–100%) à amostra e misture bem em vórtice.
5. Pipete a mistura da etapa 4 (incluindo qualquer precipitado) no DNeasy Mini Spin,
sobre a coluna com o tubo coletor de 2 ml (fornecido no kit).
Centrífuga a ≥6000 x g (8000 rpm) por 1 minuto.
Descarte a parte de baixo do tudo, mantenha a coluna.
6. Coloque a coluna de rotação DNeasy Mini em um novo tubo de coleta de 2 ml
(fornecido no kit), adicione 500 μl do tampão AW1
Centrifugar durante 1 min a ≥6000 x g (8000 rpm).
Descarte a parte de baixo do tudo, mantenha a coluna.
7. Coloque a coluna de rotação DNeasy Mini em um novo tubo de coleta de 2 ml
(fornecido no kit), adicione 500 μl d tampão AW2
Centrifugar durante 3 min a 20.000 x g (14.000 rpm)
Descarte a parte de baixo do tudo, mantenha a coluna.
Repita a etapa 7 se necessário.
Obs: A etapa 7 é para secar o DNeasy membrana. É importante secar a membrana da
coluna de centrifugação DNeasy Mini, pois o etanol residual pode interferir nas
reações subsequentes. Remova cuidadosamente a coluna de centrifugação DNeasy
Mini para que o coluna não entra em contato com o tubo, pois isso resultará em
transporte de etanol. Se ocorrer transferência de etanol, esvazie o tubo de coleta e
reutilize-o em outro centrifugação por 1 min a 20.000 x g (14.000 rpm).
8. Coloque a coluna de rotação DNeasy Mini em um tubo de microcentrífuga limpo de
1,5 ml ou 2 ml (não fornecido) e pipetar 100 μl de Tampão AE diretamente na
membrana DNeasy.
Incubar em temperatura ambiente por 1 min
Centrifugar por 1 min a ≥6000 x g (8000 rpm) para eluir.