SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO.............................................................................................................. 3
2. PROTOCOLO DE AMOSTRAS .................................................................................. 4
3. HOMOGIENIZAÇÃO E SEPARAÇÃO ....................................................................... 4
4. EXTRAÇÃO DE NEMATOIDES EM AMOSTRAS DE SOLO .................................. 4
4.1. Extração de Nematoides em Amostras de Solo pela Metodologia da
Flotação – Centrifugação (JENKINS, 1964) ................................................................ 4
Procedimentos: ............................................................................................................... 5
5. EXTRAÇÃO DE NEMATOIDES EM AMOSTRAS DE RAIZ .................................... 6
5.1. Extração de Nematoides por Trituração Seguida de Flotação e
Centrifugação (COOLEN & D’HERDE, 1972) .............................................................. 6
Procedimentos: ............................................................................................................... 6
6. IDENTIFICAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DOS NEMATOIDES PRESENTES NA
AMOSTRA ........................................................................................................................ 7
7. EXTRAÇÃO DE HETERODERA GLYCINES (CISTO DO SOLO)........................... 8
7.1. Flotação seguida de Peneiramento – Extração de Cisto a partir de
amostras de solo seco (MACHADO & SILVA, 2019) ................................................. 8
8. RESULTADOS ............................................................................................................. 8
CHAVE DE IDENTIFICAÇÃO DE NEMATOIDES .......................................................10
Nematoide endoparasita sedentário: Meloidogyne ..............................................10
Ciclo de vida Meloidogyne ..........................................................................................12
Nematoide endoparasita migrador: Pratylenchus ................................................13
Pratylenchus penetrans ..............................................................................................14
Ciclo de Vida Pratylenchus brachyurus ...................................................................18
Nematoide do Cisto: Heterodera glycines................................................................19
Ciclo de vida Heterodera glycines .............................................................................21
Nematoide Reniforme: Rotylenchulus reniformis...................................................22
Ciclo de vida Rotylenchulus reniformis....................................................................24
Nematoide: Helicotylenchus ....................................................................................25
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1. INTRODUÇÃO

O Mato Grosso tem grande destaque na produção nacional de grãos,

produzindo mais de 60% da produção brasileira do grão. Apesar dessa grande
produção, ainda existe vários fatores que limitam sua produtividade, como os
nematoides que são importantes fitoparasitas de planta.
Os nematoides estão entre os principais problemas fitossanitários das
lavouras, que quando em alta população e sem o adequado manejo, reduz
drasticamente a produtividade da soja. Os primeiros registros de nematoide se deu
no Cerrado, na década de 1980, desde então vem se disseminando para vários
estados produtores, atingindo milhões de hectares. Os nematoides têm como
característica o rápido aumento da população e sua fácil disseminação, com
permanência viável no solo de 6 a 8 anos, no caso do nematoide do cisto da soja
(Heterodera glycines).
Devido ao seu eficiente mecanismo de sobrevivência e os grandes danos
causados nas culturas, quando ocorre infestação de uma área, o manejo adequado
é a principal estratégia para o controle dos nematoides. Por ser facilmente
confundido com outros problemas na lavoura, ainda existem limitações quanto ao
manejo dos nematoides, sendo de suma importância a sua identificação por meio de
analise nematologica.
Assim, o treinamento tem como objetivo apresentar as metodologias de
análises dos cinco principais nematoides, desde o protocolo de amostras a
identificação morfológica de nematoides, por meio de microscopia.
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2. PROTOCOLO DE AMOSTRAS

Ao chegar ao laboratório, a amostra deve ser protocolada em sistema, conforme

a solicitação do teste pelo cliente e identificada com número de protocolo interno,
pelo colaborador responsável, este organiza as embalagens nas prateleiras e deixa
disponível para o trabalho posterior.

3. HOMOGIENIZAÇÃO E SEPARAÇÃO

Na sequência o colaborador auxiliar técnico leva a amostra devidamente

identificada para a sala de homogeneização e separação e depositada em uma
bandeja de plástico ou outro recipiente (bacia de alumínio), para homogeneizar e
separar em três porções, que se tornaram a amostra de trabalho.
Cada subamostra é colocada em um Gerbox ou recipiente de plástico com a
identificação do número da amostra, sendo uma porção de 200 cm3 de solo, escrito
em cor azul, outra porção de 100 cm3 de solo em cor preta e outra porção de raiz na
cor vermelha. São escritas de cores diferentes para melhor controle de processo das
amostras. Após a separação das porções de analise, as amostras são levadas para
uma bancada identificada e depois para a extração dos nematoides, seguindo as
técnicas descritas abaixo.

4. EXTRAÇÃO DE NEMATOIDES EM AMOSTRAS DE SOLO

4.1. Extração de Nematoides em Amostras de Solo pela Metodologia da

Flotação – Centrifugação (JENKINS, 1964)

Esta metodologia é utilizada para extração de nematoides presentes em

amostras de solo ou substrato e baseia-se nas diferenças de densidade entre água
(1,0), nematoides (1,02 a 1,09), solução de sacarose (1,15 a 1,18) e solo (1,2) para
separação dos nematoides do solo.
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Procedimentos:

1. Colocar uma alíquota de 200 cm3 de solo em um recipiente e

adicionar 2 Litros de água aproximadamente, mexer com a espátula
para desmanchar eventuais torrões que estejam presentes,
liberando os nematoides para a suspensão.
2. Verter lentamente o liquido através de uma peneira de malha 20/25
Mesh sobre outra de malha de 400 ou 500 Mesh.
3. Para auxiliar na passagem mais rápida da água pela peneira e
assim concentrar os nematoides com as impurezas na peneira,
deve-se manter as mesmas levemente inclinadas e bater
suavemente nas laterais. Tomar cuidado para não passar excesso
de solo deixando o solo no fundo do recipiente. Esse processo deve
ser realizado por três vezes.
4. Com auxílio de pisseta, e com jatos fortes de água, recolher o todo
material da peneira de malha 400 ou 500 Mesh para um béquer e
em seguida transferir para tubos de centrífugas de até 100 mL de
capacidade. Evitar encher os tubos até a borda para que não
transborde. Verificar se os tubos estão balanceados e centrifugar
por cinco (5) minutos, com água. A centrifuga deve estar
programada para 550 G (gravidade) que vai equivaler a 1800 RPM.
5. Deixar a centrifuga parar completamente. Retirar os tubos e eliminar
cuidadosamente o líquido sobrenadante. Limpar as bordas dos
tubos, para retirar possível acúmulo de impurezas. Adicionar à
solução de sacarose (454 gramas de açúcar, completar com água
até dar um litro, (densidade de 1,15 até 1,18)) até aproximadamente
um dedo abaixo da borda ou na marca do tubo, misturando bem os
sedimentos com um bastão de vidro. Não se esquecer de balancear
os tubos e centrifugar novamente à mesma velocidade por 1
minuto, a 1800 RPM. É preciso ter muito cuidado de centrifugação
desta fase.
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6. Retirar os tubos da centrífuga e verter o sobrenadante através da

peneira de malha 500 Mesh, que deve ser mantida inclinada para
ser lavada com água diversas vezes, para retirar o excesso de
sacarose. Deve-se tomar muito cuidado nesta última fase, ela não
pode demorar mais de 5 minutos, caso contrário os nematoides
sofrerão alterações na morfologia, dificultando a identificação.
7. Com auxílio de jatos fortes de água de uma pisseta recolher os
nematoides para um recipiente plástico ou de vidro com capacidade
para até 20 ml.
8. Os nematoides extraídos podem ser visualizados imediatamente ou
armazenados após morte (aquecimento a 55 ºC em banho-maria
por 5 minutos).

5. EXTRAÇÃO DE NEMATOIDES EM AMOSTRAS DE RAIZ

5.1. Extração de Nematoides por Trituração Seguida de Flotação e

Centrifugação (COOLEN & D’HERDE, 1972)

Procedimentos:

1. Coletar as raízes infestadas (ou outro tipo de tecido vegetal ou

sementes), lavá-las cuidadosamente e cortar em pedaços de
aproximadamente 1 cm. Homogeneizar os pedaços e pesar 5
gramas, no caso de tecido vegetal, quando for sementes pesar a
quantidade descrito nas RAS.
2. Transferir as raízes para o copo do liquidificador e adicionar água,
até cobri-las. Triturar as raízes no liquidificador doméstico por cerca
de 30 segundos na velocidade máxima.
3. Findo o tempo, passar os restos vegetais com líquido em uma
peneira de malha 25 Mesh, sobre outra peneira de malha 500
Mesh.
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4. Com auxílio de pisseta, e com jatos fortes de água, recolher a

suspensão de nematoides mais o tecido vegetal da peneira de
malha 500 Mesh para um béquer, (ou diretamente nos tubos da
centrifuga) e adicionar 2 cm3 de caulim, misturar bem com um
bastão de vidro e transferir para tubos de centrífugas de até 100 ml
de capacidade, tomando o cuidado para balanceá-los. Colocar na
centrífuga por 5 minutos a 1800 RPM, com água. Após o tempo,
retirar os tubos da centrífuga, eliminar cuidadosamente o líquido
sobrenadante e limpar as bordas do tubo. Adicionar a solução de
sacarose até um dedo abaixo da borda ou na marca do tubo (454
gramas de açúcar completar com água até dar um litro, (densidade
de 1,15 até 1,18)). Misturar bem com um bastão de vidro, para que
o “pelet” seja diluído.
5. Voltar os tubos para a centrífuga por 1 minuto a 1800
RPM. Cuidado com o tempo de centrifugação nessa fase, para não
causar osmose e morte dos ovos e nematoides.
6. Findo o tempo, retirar os tubos da centrífuga e verter o
sobrenadante sobre uma peneira de 500 Mesh, que deverá estar
levemente inclinada. Derramar bastante água da torneira para
eliminar o excesso da sacarose e, com auxílio de jatos fortes de
água da pisseta, recolher a suspensão para um recipiente plástico
ou de vidro com capacidade para até 20 ml.
7. Os nematoides extraídos podem ser visualizados imediatamente ou
armazenados após morte (aquecimento a 55 ºC em banho-maria
por 5 minutos).

6. IDENTIFICAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DOS NEMATOIDES PRESENTES

NA AMOSTRA

Caso não seja possível proceder com a leitura os tubos de plástico ou de vidros
são guardados na geladeira para posterior contagem. Para a identificação e
quantificação é retirado um 1 mL dessa suspensão final e colocado em uma câmara
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de Peters, que será feita a quantificação e identificação morfológica dos nematoides

fitoparasitas presentes na amostra, sob o uso do microscópio estereoscópico. Na
sequência é registrado os nematoides encontrados no sistema. Os nematoides são
quantificados e identificados morfologicamente por técnicos.

7. EXTRAÇÃO DE HETERODERA GLYCINES (CISTO DO SOLO)

7.1. Flotação seguida de Peneiramento – Extração de Cisto a partir de

amostras de solo seco (MACHADO & SILVA, 2019)

1. A alíquota de 100 cm3 da amostra de solo deve secar à sombra por

24 a 48 horas, após a homogeneização e separação.
2. Essa alíquota de solo de 100 cm3 do solo deve ser colocada em um
béquer de 2 litros de capacidade, colocar água até próximo a borda,
tomando cuidado para não derramar, e agitar vigorosamente.
3. O béquer deve ser cheio até próximo a sua boca e após a agitação
G verter vagarosamente a solução nas peneiras de 25 sobre a de 100
Mesh, verter devagar, para ir o mínimo de solo e impurezas
possível. Os cistos presentes irão flutuar para a superfície.
4. O processo do item 3 deve ser repetido por três vezes, para que se
consiga recuperar a quantidade maior possível de cistos.
5. A suspensão da peneira de 100 Mesh deve ser recolhida em um
recipiente e passada em um papel-filtro para ser examinado sob
microscópio estereoscópico, contando-se os cistos viáveis e
inviáveis com auxílio de contadores e pinças e ou sonda de ponta
fina.

8. RESULTADOS
O Analista faz as leituras e registra os dados no sistema eletrônico. O RT
realiza a análise crítica observando a possibilidade da ocorrência de dados
discrepantes. A emissão de resultados é realizada. Se constatadas divergências,
são realizados re-testes, e nova análise é realizada conforme estabelecido.
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9. REFERÊNCIAS

COOLEN, W. A. & D’HERDE, C.J. A Method for the Quantitative Extraction of

Nematodes from Plant Tissue. Ghent, Bélgica. State Nematology and Entomology
Research Station, 1972, 77p.

JENKINS, W.R. A rapid centrifugal-flotation technique for separating nematodes from

soil. Plant Disease Reporter 48:692, 1964.

MACHADO, A. C. Z. & SILVA, S. A. Extração de Nematoides. In: MACHADO, A. C.

Z.; SILVA, S. A.; FERRAZ, L. C. C. B. (eds). Métodos em Nematologia Agrícola.
Sociedade Brasileira de Nematologia, Piracicaba, p. 9-35, 2019.
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CHAVE DE IDENTIFICAÇÃO DE NEMATOIDES

Nematoide endoparasita sedentário: Meloidogyne

Estágio: Juvenil J2
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Ciclo de vida Meloidogyne

Filo
Nematoda Rudolphi, 1808 Classe Chromadorea
Gênero Meloidogyne Goeldi, 1892 (Perry e Moens, 2006)
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Nematoide endoparasita migrador: Pratylenchus

Pratylenchus. A - Parte anterior achatada, esclerosada e região labial anelada; B – Vulva

perto da cauda com saco pós-vulvar
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Pratylenchus penetrans
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Ciclo de Vida Pratylenchus brachyurus

Filo Nematoda Rudolphi, 1808 Classe Chromadorea

Género Pratylenchus Filipjev, 1936 (Perry e Moens, 2006)
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Nematoide do Cisto: Heterodera glycines

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Ciclo de vida Heterodera glycines

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Nematoide Reniforme: Rotylenchulus reniformis

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Ciclo de vida Rotylenchulus reniformis

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Nematoide: Helicotylenchus

Filo Nematoda Rudolphi, 1808 Classe

Chromadorea
Gênero Helicotylenchus Steiner, 1945 (Perry e Moens, 2006)