UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA

FACULDADE DE FARMÁCIA

Laboratório de Hematologia
Clínica

Agosto/2022
 Sumário

PREPARO DO MATERIAL DE COLETA................................................................................................................ 1

COLETA DE SANGUE CAPILAR............................................................................................................................4
COLETA DE SANGUE VENOSO............................................................................................................................ 5
CONFECÇÃO DE LÂMINAS...................................................................................................................................6
COLORAÇÃO DE ESFREGAÇOS...........................................................................................................................7
COLORAÇÃO DE RETICULÓCITOS..................................................................................................................... 9
CONTAGEM DE RETICULÓCITOS......................................................................................................................10
HEMATÓCRITO...................................................................................................................................................... 11
DOSAGEM DE HEMOGLOBINA..........................................................................................................................12
CONTAGEM DE ERITRÓCITOS........................................................................................................................... 13
CONTAGEM DE LEUCÓCITOS............................................................................................................................ 16
CONTAGEM DE PLAQUETAS.............................................................................................................................. 17
PROVA DO LAÇO (RESISTÊNCIA CAPILAR) RUMPEL – LEEDE..................................................................20
DETERMINAÇÃO DO TEMPO DE PROTROMBINA.........................................................................................21
DETERMINAÇÃO DO TEMPO DE PROTROMBINA E TROMBOPLASTINA PARCIAL ATIVADA (TP E
TTPA)........................................................................................................................................................................22
DETERMINAÇÃO DO GRUPO SANGUÍNEO (ABO) E FATOR Rh.................................................................. 25
COOMBS DIRETO (PESQUISA DE ANTÍGENOS)............................................................................................. 26
COOMBS INDIRETO.............................................................................................................................................. 27

1
 PREPARO DO MATERIAL DE COLETA

A) TUBOS DE COLETA:

1. A proporção de anticoagulante é de 50 μL (1 gota) para 5 mL de sangue total, preparado

na proporção de 10%.
2. Os tubos devem ser rotulados antes de irem para a sala de coleta, convenientemente
fechados com tampas.
3. A quantidade de sangue não precisa ser exata e sim aproximada. A homogeneização
deve ser imediata.

1
 Obs: Nos casos de avaliação de plaquetas em testes laboratoriais tais como, agregação
plaquetária ou citometria de fluxo, o tubo de citrato de sódio deverá ser o segundo a ser coletando. Logo,
nessas situações, o primeiro tubo coletado deverá ser um tubo seco para posterior descarte pois, em
testes específicos de avaliação plaquetária a coleta é um fator importante de interferência.

B) LÂMINAS – ESFREGAÇOS:

1. Deverão estar rigorosamente desengorduradas (com álcool e/ou gaze estéril), sem corrosão
ou mofo e secas.
2. Uma ou duas lâminas novas, de preferência laminadas, com bordos íntegros e marcados
com uma fita adesiva para fazer os esfregaços ou lâminas extensoras.
3. Após a confecção dos esfregaços, secá-los imediatamente e colocar o nome do paciente
com lápis no extremo oposto à franja.

C) AGULHAS:

As agulhas devem ser descartáveis, 25/8 ou 30/9.

D) PUNÇÃO DIGITAL:

Para a coleta de punção digital, usar lancetas descartáveis.

2
E) PAPEL FILTRO:

O papel de filtro usado para o tempo de sangramento deverá estar dividido em pequenas
tiras e guardados em caixa limpa com tampa ou placa de PETRI.

F) ALGODÃO OU GAZE:

O algodão ou gaze para a coleta deverá estar cortado em pequenos pedaços em vasilhame
próprio com tampa.

G) ANTISSEPSIA:

Deverá ser feita com algodão embebido em álcool etílico a 70% ou álcool isopropílico a
70%.

H) GARROTE:

O garrote deverá estar limpo (lavado) após cada coleta diária. A laçada é a última coisa a
ser feita antes da coleta. Retirar o garrote antes de retirar a agulha.

3
 COLETA DE SANGUE CAPILAR

1. O sangue capilar pode ser utilizado para a preparação de esfregaços e também em alguns
casos para a obtenção de pequena quantidade de sangue destinada à execução de exames
isolados como contagem de glóbulos ou hematócrito ou ainda dosagem de hemoglobina.
2. O sangue capilar é obtido da face lateral da polpa digital, do lóbulo da orelha ou ainda,
em recém-nascidos, do calcanhar.
3. A região não deve apresentar cianose ou edema.
4. Feita a assepsia da região, friccioná-la superficialmente evitando o traumatismo intenso.
Puncionar com lanceta descartável. Enxugar a primeira gota, utilizando as seguintes para
a confecção de esfregaços ou para as dosagens.
5. É necessário que o sangue flua facilmente qualquer que seja a região escolhida.

São possíveis para a coleta de sangue capilar:

4
 COLETA DE SANGUE VENOSO

1. O paciente deve estar bem acomodado e psiquicamente preparado.

2. O material a ser utilizado deve ser limpo (esterilizado), e se possível descartável.
3. A escolha do local para a punção deve ser feita em função da quantidade necessária, do
material a ser utilizado e do calibre do vaso a ser puncionado.
4. Colocar o garrote de tal maneira que possa ser solto facilmente e aperte o suficiente para
bloquear o retorno venoso sem bloquear o fluxo arterial. A estase prolongada altera o
material colhido provocando hemoconcentração e ativação da cascata da coagulação.
5. Realizar a assepsia da região e puncionar com o bisel da agulha voltado para cima
procurando fazer a penetração com golpe seco, evitando movimentos de rotação ou
lateral da agulha para não dilacerar tecidos. A penetração da agulha traumatizando em
excesso os tecidos possibilita a aspiração de suco tissular junto ao sangue facilitando a
sua coagulação, mesmo que parcial.
6. Manter a seringa imóvel e aspirar lentamente o sangue sem provocar espuma. A espuma
formada durante a coleta ou durante a colocação no tubo provoca hemólise e agregação
das plaquetas, alterando a sua concentração no sangue colhido.
7. O garrote deve ser solto logo após a punção, mas sempre antes do término da coleta.
8. Após a retirada da agulha, comprimir a região com algodão durante alguns minutos.
9. Antes da distribuição do sangue em frascos ou tubos, colocar gotas em lâminas
destinadas à confecção dos esfregaços. As gotas são colocadas com a seringa, com
auxílio da agulha.
10. O material deve ser transferido imediatamente da seringa para o frasco contendo
anticoagulante sem agulha e deixando correr suavemente o sangue pela parede do frasco,
evitando sempre a formação de espuma. Em seguida, distribuir o restante de sangue para
os demais frascos, se forem requisitados. Todos os frascos e tubos devem estar
previamente identificados com as iniciais e número de registro do paciente.

5
 CONFECÇÃO DE ESFREGAÇOS

TÉCNICA:

1. Após a punção, desprezar as primeiras gotas e colocar uma pequena gota na extremidade
da lâmina.
2. Tocar o rebordo de uma lâmina de bordo íntegro, de preferência lapidada, na gota de
sangue, formando um ângulo de 45o, deixando o sangue se espalhar por capilaridade.
3. Impelir a lâmina, guardando sempre o mesmo ângulo, da direita para a esquerda com um
movimento firme e uniforme sem separar uma lâmina da outra. Forma-se então uma
delgada camada de sangue. Secar. Identificar a lâmina.

OBSERVAÇÃO:
a) O esfregaço deve ser feito rapidamente para se evitar a formação de coágulos.
b) A rapidez do deslizamento: quanto mais lento, mais fino.
c) Variação do ângulo: quanto menor, mais fino.
d) Uma pressão excessiva ou qualquer movimento de parada durante o processo pode
comprometer o esfregaço.

6
 COLORAÇÃO DE ESFREGAÇOS

COLORAÇÃO:

Corante: WRIGHT

Wright pó 2,4 g
Álcool metílico 1000 mL

1. As lâminas devem estar perfeitamente secas, quando forem coradas.

2. Quando guardadas, devem ficar em lugar seco e arejado e distante de emanações
químicas.
3. A maioria dos corantes são alcoólicos servindo como fixadores, não havendo
necessidade de fixação prévia.
4. Após decorrido o tempo inicial de fixação, o corante é diluído com água destilada
colocada sobre a lâmina. O sopro é desaconselhável por provocar em excesso de
evaporação do metanol com a consequente precipitação do corante.

TÉCNICA:

1. Cobrir o esfregaço com corante por 2 a 3 minutos (observar o tempo do corante). Fase de
fixação.
2. Colocar o mesmo volume de água destilada, gotejando sobre a lâmina sem derramar.
Marcar tempo de 8 a 9 minutos. Fase de coloração.
3. Lavar com água corrente.
4. Limpar o fundo da lâmina e deixar secar.
5. Observar ao microscópio.

7
CARACTERÍSTICAS DA BOA COLORAÇÃO:

1. Para a contagem específica ou diferencial dos leucócitos, é necessário se obter resultados

reprodutíveis, que os esfregaços estejam tecnicamente perfeitos e que a coloração seja
nítida.
2. O esfregaço não deve ser excessivamente fino e a franja deve ser homogênea,
proporcionando uma área ampla entre o corpo e a franja
3. Normalmente na área do corpo da lâmina encontramos uma concentração maior de
linfócitos e nas bordas e na franja mais neutrófilos e monócitos. Em lâminas finas
realizadas com lâminas de bordos irregulares, aumenta o acúmulo de neutrófilos e
monócitos na periferia.
4. A contagem deverá ser feita na área entre o corpo e a franja, onde existem ligeiro
empilhamento das hemácias, seguindo um curso em zigue-zague (preferencialmente
vertical) sempre orientando em função das hemácias devendo-se evitar áreas onde as
hemácias estiverem empilhadas ou completamente isoladas.
5. Deve ser feito obrigatoriamente uma inspeção em toda a lâmina para uma apreciação das
condições técnicas do esfregaço, evidenciando os elementos anômalos, estimativa do
número global de leucócitos e localização de eosinófilos ou basófilos que por seu baixo
número podem faltar na contagem das células.
6. Recomenda-se a contagem de 100 células, lembrando que um aumento da amostra
contada a tornará mais significante.

8
 COLORAÇÃO DE RETICULÓCITOS

COLORAÇÃO SUPRAVITAL: Consiste na coloração de células, após a morte somática e

antes da ocorrência da morte celular, ou seja, depois de removidas do organismo vivo, mas antes de
cessarem as atividades celulares.
Os reticulócitos são eritrócitos jovens (intermediários entre eritrócitos nucleados e os não
nucleados), cuja estrutura reticulofilamentosa, remanescente do ácido ribonucléico, só é revelada
pela coloração supravital.
O corante mais usado é o azul-de-cresil brilhante, usado em soluções diversas nas numerosas
variações técnicas. Ultimamente, vem-se utilizando o novo azul-de-metileno N, com a mesma
finalidade.
Com esses métodos, a substância reticulofilamentosa dos reticulócitos cora-se de azul ou
vermelho-violáceo.

CORANTES:

1. Solução de azul-de-cresil brilhante

Azul-de-cresil brilhante 1,0 g

Citrato de sódio 0,4 g
Salina 0,85% 100 mL
Obs.: Em lugar do azul-de-cresil brilhante, pode ser usado o novo azul-de-metileno N.

2. Solução alcoólica de azul-de-cresil brilhante

Azul-de-cresil brilhante 1,0 g

Álcool a 96 graus q.s.p 100 mL

TÉCNICA - Corante salino:

1. Colocar partes iguais de corante e sangue em tubos de ensaio (gotas).

2. Agitar e colocar em banho-maria á 37o C por 15 minutos
3. Agitar e retirar uma gota para fazer os esfregaços.
4. Aguardar a secagem. Contra corar ou não. Se quiser que a preparação demore mais de 24
horas, sempre contra corar.

9
 CONTAGEM DE RETICULÓCITOS
(Método indireto)

1. Levar a lâmina ao microscópio na objetiva 4x, focar; mudar para a objetiva de 10x, focar;
mudar para a objetiva de 40x, focar; adicionar uma gota do óleo de imersão sobre a lâmina
e trocar para a objetiva de 100x.
2. Dividir mentalmente o campo em 4 quadrantes.
3. Contar o número de eritrócitos de um dos 4 quadrantes do campo
4. Multiplicar o número de eritrócitos por 4
5. Contar o número de reticulócitos em todo o campo
6. Mudar aleatoriamente de campo
7. Contar vários campos até que obtenha 1.000 eritrócitos e anotar o no de reticulócitos
encontrados nestes campos.
OBSERVAÇÃO: O quadrante escolhido para a contagem de eritrócitos deve ser sempre
o mesmo.

CÁLCULOS:

100×𝑛𝑢𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑡𝑖𝑐𝑢𝑙ó𝑐𝑖𝑡𝑜𝑠
𝑃𝑒𝑟𝑐𝑒𝑛𝑡𝑢𝑎𝑙 = 𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 ℎ𝑒𝑚á𝑐𝑖𝑎𝑠 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑎𝑑𝑎𝑠

𝐻𝑇 𝑝𝑎𝑐𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒
𝐶𝑜𝑛𝑡𝑎𝑔𝑒𝑚 𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑡 𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑔𝑖𝑑𝑎 = %𝑟𝑒𝑡 × 𝐻𝑇 𝑛𝑜𝑟𝑚𝑎𝑙

10
 HEMATÓCRITO

TÉCNICA MICRO:

● Homogeneizar o sangue e encher o tubo capilar, vedar com massa. Centrifugar na

microcentrífuga por 5 minutos. Fazer a leitura com o auxílio do cartão de leitura.

VALORES DE REFERÊNCIA:

● HOMEM: 45 a 50%
● MULHER: 40 a 45%

11
 DOSAGEM DE HEMOGLOBINA

MÉTODO DA CIANOMETAHEMOGLOBINA

● PRINCÍPIO: Consiste este método em adicionar sangue total a uma solução contendo
ferricianeto de potássio (Reativo de Drabkin). O ferricianeto transforma o ferro da
hemoglobina de estado ferroso (bivalente) ao estado férrico (trivalente), formando
metahemoglobina, que por sua vez, combina com o cianeto de potássio, para produzir
um pigmento estável, a cianometahemoglobina. A intensidade da cor é medida
espectrofotometricamente.

DILUENTE:

Reativo de DRABKIN

Bicarbonato de sódio 1,0 g

Cianureto de potássio 0,05 g
Ferricianeto de potássio 0,2 g
Água destilada qsp 1000 mL

TÉCNICA:

1. Colocar em tubo de ensaio 5 mL do reativo de DRABKIN.

2. Colocar 20 μL de sangue total, devidamente homogeneizado, lavando a pipeta com o

próprio reativo.
3. Homogeneizar, deixar em repouso por 3 a 5 minutos e ler contra o tubo branco de água

destilada, em 540 ηm ou filtro verde.

4. Multiplicar a densidade ótica pelo fator = conc. de Hb na amostra (Hb g / 100mL)

DETERMINAÇÃO DO FATOR:

Obs.: O padrão de hemoglobina deve ter uma concentração conhecida.

A média da densidade ótica do padrão é obtida realizando-se pelo menos 3 dosagens consecutivas
pelo método da cianometahemoglobina, usando o padrão no lugar do sangue.

12
 CONTAGEM DE ERITRÓCITOS

Consiste numa diluição precisa do sangue (com anticoagulante) que é colocada numa
câmara de contagem de volume determinado e contado através do microscópio.

MATERIAL:

1. Pipeta automática
2. Câmara de contagem do tipo Neubauer
3. Microscópio óptico comum

DILUENTE:

Reagente de GOWER

Sulfato de sódio anidro 62,5 g

Ác. Acético glacial 166,5 mL
Água destilada qsp 1000 mL

TÉCNICA:

1. Em um tubo longo, adicionar 4 mL de líquido diluidor (GOWER).

2. Adicionar 20 μL de sangue (bem homogeneizado), com pipeta automática, ao tubo

contendo o líquido diluidor.

3. Ter atenção na homogeneização, ajuste e limpeza da pipeta.
4. Encher a câmara por capilaridade, deixando-a repousar durante 3 a 5 minutos para a
sedimentação.
5. Colocar no microscópio e realizar a contagem de pelo menos 1/5 de mm2 (80
quadradinhos) da área central da câmara de Neubauer e multiplicar por 10.000 e será
obtido o número de hemácias.

13
 CÁLCULO:

3
𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 ℎ𝑒𝑚á𝑐𝑖𝑎𝑠/𝑚𝑚 = 𝑛 ×5×𝑣×𝑑

n = No de hemácias encontradas na contagem

5 = área contada: 1/5 mm2
v = altura da câmara
d = diluição

CAUSAS DE ERRO:

1. Devido à coleta – sangue capilar:

● Excesso de pressão local (fluxo espontâneo).

● Massagem excessiva.
● Edema e cianose.

2. Devido à coleta – sangue venoso:

● Estase prolongada devido ao garrote.

● Edema, cianose.
● Aglutinação das células ou pequeno coágulo devido á demora na mistura com o
anticoagulante.
● Mistura inadequada da amostra sanguínea.

3. Hemólise devido a trauma na agitação.Erro técnico:

● Falta de limpeza do material (pipeta e câmara).

● Aglutinação das células, na diluição.
● Diluição mal feita.
● Falha por não limpar a ponta da pipeta.
● Partículas em suspensão no líquido diluidor.
● Homogeneização mal feita da diluição na hora do enchimento da câmara.
● Enchimento incorreto da câmara.
● Evaporação do líquido da câmara.
● Colocação incorreta da lamínula, mudando a profundidade da câmara.
● Erro na contagem.

14
 Enchimento da câmara de Neubauer.

Distribuição de células sobre o retículo.

4. Erro do equipamento:

● Pipeta
● Lamínula
● Câmara de contagem

15
 CONTAGEM DE LEUCÓCITOS

Consiste numa diluição precisa do sangue (com anticoagulante) em um diluente, que destrói
as hemácias, sendo depois colocada na câmara de contagem de volume determinado e contado
através de microscópio ótico.

MATERIAL:

1. Pipeta automática
2. Câmara de contagem do tipo Neubauer
3. Microscópio óptico comum

DILUENTE:

Reagente de TURK

Violeta de genciana 1% gotas

Ác. Acético glacial 1,0 mL
Água destilada qsp 100 mL

TÉCNICA:

1. Em um tubo longo, pipetar 0,4 mL de líquido diluidor (TURK).

2. Adicionar 20 μL de sangue, com pipeta automática, ao tubo contendo o líquido diluidor.
3. Ter atenção na homogeneização, ajuste e limpeza da pipeta.
4. Encher a câmara por capilaridade, deixando-a repousar durante 3 a 5 minutos para a
sedimentação.
5. Colocar no microscópio e realizar a contagem em 4 mm2 (área lateral) da câmara e o
resultado multiplicado por 50, fornecerá o número de leucócitos por mm3.

CÁLCULO:
3 1
𝑁𝑢𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑒𝑢𝑐ó𝑐𝑖𝑡𝑜𝑠 /𝑚𝑚 = 𝑛 × 4
×𝑣 × 𝑑

16
 CONTAGEM DE PLAQUETAS
(Método de Fônio)

Os métodos para contagem de plaquetas dividem-se em diretos e indiretos:

1. DIRETO: Empregam-se o hemotímetro, contando-se as plaquetas diretamente na

câmara de contagem.
2. INDIRETO: Consiste em verificar a proporção entre plaquetas e os eritrócitos em um
esfregaço de sangue corado e relacionar estes dados com o número de eritrócitos /
mm3 de sangue.

Entre os métodos indiretos o mais usado é o de Fônio, devido a sua simplicidade e exatidão
para as necessidades clínicas habituais. O número aproximado de plaquetas pode ser avaliado pelo
exame do esfregaço corado, embora seja sujeito a erros permitindo revelar se estes elementos se
acham em um número normal, aumentado ou diminuído.
Os esfregaços são feitos normalmente, de maneira imediata, com a finalidade de se evitar
agregação plaquetária. Pode-se usar uma solução de sulfato de magnésio a 14% (que evita a
agregação plaquetária).

TÉCNICA:

1. Corar os esfregaços normalmente, deixar secar e examinar com objetiva de imersão. As

plaquetas devem apresentar-se isoladas e mais uniformemente distribuídas.
2. Contar 1.000 eritrócitos em vários campos de esfregaço, anotando o número de plaquetas
encontradas nos diferentes campos.

CÁLCULO:
3 𝑛ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑝𝑙𝑎𝑞𝑒𝑡𝑎𝑠 𝑒𝑛𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑎𝑑𝑎𝑠 ×𝑛ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑒𝑟𝑖𝑡𝑟ó𝑐𝑖𝑡𝑜𝑠
𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑝𝑙𝑎𝑞𝑢𝑒𝑡𝑎𝑠 𝑚𝑚 = 1000

OBSERVAÇÕES FEITAS EM RELAÇÃO AO ESFREGAÇO:

1. Avaliar de modo aproximado o número de plaquetas.

2. Na presença de satelitismo, as plaquetas ficam aderidas à superfície dos leucócitos, na
presença de EDTA, por isso no método automatizado, poderá ocorrer falsa
17
 plaquetopenia. No método de Fônio, as plaquetas aderidas ao leucóicto devrão ser
contadas.
3. Coloração das plaquetas: as plaquetas devem exibir uma porção central mais corada.
Plaquetas pálidas, quase invisíveis são observadas em condições trombocitopáticas
familiares.
4. No caso de agregado de plaquetas na lâmina, todas as plaquetas que formam este
agregado deverão ser contadas.
5. Volume plaquetário: plaquetas volumosas surgem nos estados de solicitação excessiva,
com nas hemorragias e principalmente em condições mieloproliferativas, especialmente
na metaplasia mielóide agnogênica e na trombocitopenia hemorrágica. Nos indivíduos
esplenectomizados os aspectos patológicos plaquetários tornam-se ainda mais nítidos

18
 TEMPO DE SANGRAMENTO (TS) DUKE

TÉCNICA:

1. Fazer a assepsia do lóbulo da orelha do paciente.

2. Fazer uma incisão com lanceta (3mm).
3. Disparar o cronômetro quando surgir o sangramento.
4. Coletar de 30 em 30 segundos a gota de sangue formada.
5. Parar o cronômetro quando cessar o fluxo.
6. Observar o tempo (TS).

VALORES DE REFERÊNCIA:

Até 3 minutos.

O TS PODE SE ACHAR AUMENTADO:

a) No de plaquetas inferior a 100.000 / mm3.

b) Alteração na atividade funcional das plaquetas (Doença de von Willebrand) Pacientes em
uso de ácido acetil salicílico.

19
 PROVA DO LAÇO (RESISTÊNCIA CAPILAR)
RUMPEL – LEEDE

TÉCNICA:

1. Verificar se existem petéquias no braço do paciente (marcá-las).

2. Colocar manguito do tensiômetro em pressão diastólica, mantendo inflado por cinco
minutos.
3. Retirar o manguito.
4. Observar o aparecimento de petéquias.
5. Fazer nova observação após 30 minutos (petéquias tardias).

VALORES DE REFERÊNCIA:

Menos de 10, de tamanho inferior a 1 mm.

INTERPRETAÇÃO:

Positivo + : 10 a 50 petéquias de 1 a 2 mm (região cubital).

Positivo ++ : mais de 50 petéquias de 2 mm (região cubital, antebraço, dorso da mão).
Positivo +++ : mais de 70 petéquias de 2 a 4 mm (idem).
Positivo ++++ : incontáveis petéquias de 5 ou mais mm.
Obs.: Trombocitopenias intensas, tromboastenia hemorrágica hereditária de Glanzmann,
trombopatia constitucional (von Willebrand), púrpura vasculares, púrpuras alérgicas
(Schoelein – Henoch), púrpura senil, escorbuto, síndrome hemorrágica vascular hereditária
(Ehlers-Danlos).

20
 DETERMINAÇÃO DO TEMPO DE PROTROMBINA
(Técnica manual)

É a prova de escolha para a investigação do sistema extrínseco da coagulação sanguínea,

permitindo revelar deficiências dos fatores que tomam parte neste sistema. O extrato de tecido
(tromboplastina extrínseca), ao lado dos fatores VII, V, IX, na presença dos íons cálcio, age sobre a
protombina para formar a trombina, que, por sua vez, conduz à formação do coágulo de fibrina.
A prova é insensível ao fator IX (que é um dos fatores do grupo da protrombina dependente
da vitamina K) e os fatores que tomam parte na formação da tromboplastina intrínseca.
Como o fator V é instável no plasma oxalatado, recomenda-se usar como anticoagulante o
citrato de sódio. No qual este é relativamente estável.

TÉCNICA:

1. Colher por punção venosa 3,0 mL de sangue do paciente e colocar em um tubo de

centrífuga já contendo 0,3 mL de citrato de sódio 0,1 M. Misturar bem. Obs.: Dê
preferência ao tubo de plástico.
2. Centrifugar o tubo a 2.000rpm, durante 10 minutos, para separar o plasma.
3. Colocar o tubo no banho-maria a 37o – 4 tubos – 2 para o plasma citratado do paciente e
2 para o plasma citratado normal.
4. Colocar 0,1 mL do plasma citratado do paciente em cada um dos 2 primeiros tubos e 0,1
mL do plasma normal nos outros dois.
5. Acrescentar 0,1 mL da suspensão de tromboplastina em cada um dos 4 tubos e agitá-los
bem, para misturar o seu conteúdo.
6. Deixar os tubos em banho-maria a 37o durante 2 minutos para estabilizar a temperatura
no seu interior. Não deixar mais de 10 minutos.
7. Adicionar rapidamente 0,1 mL da solução de clorato de cálcio 0,025 M ao primeiro tubo,
soprando a pipeta, neste momento, por o cronômetro a funcionar.
8. Depois de 5 a 10 segundos, retirar o tubo do banho-maria e agitá-lo suavemente, de 2 em
2 segundos, até o aparecimento do coágulo, parando simultaneamente o cronômetro.
Anotar o número gasto em segundos.
9. Repetir a técnica com outros 3 tubos. Tirar a média dos resultados obtidos no plasma do
paciente e no plasma normal.

21
 DETERMINAÇÃO DO TEMPO DE PROTROMBINA E
TROMBOPLASTINA PARCIAL ATIVADA (TP E TTPA)
(Técnica semi-automatizada)

PRINCÍPIO:

O Thrombotimer é um coagulômetro operado manualmente, baseado no método de medição

ótico-mecânico. Suas funções são controladas por um microprocessador.
Sistema de medição: Uma bilha de metal é colocada em movimento pela circulação de um
ímã magnético abaixo da estação de leitura. O resultado da mistura da amostra favorece a formação
de uma rede de fibrina homogênea, quando a coagulação inicia. Este método permite um sinal
seguro de detecção, mesmo nos casos em que há baixa concentração de fibrinogênio.

EQUIPAMENTO:

▪ Thrombotimer

Thrombotimer. Thrombotimer – Elementos funcionais.

Dispensador de bilhas. Cubetas – Reagentes (à esquerda)

e amostras (à direita).

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TÉCNICA PARA TP (TEMPO DE PROTOMBINA):

1. Na posição reservada ao reagente, colocar o reativo de tromboplastina para aquecer por

pelo menos 10 minutos antes de iniciar o teste. Somente colocar a quantidade suficiente
para os testes, pois depois de aquecido, este não poderá ser reutilizado.
2. Colocar as cubetas de amostra na posição de incubação (até 2 testes).
3. Acrescentar uma bilha em cada cubeta, com o auxílio do dispensador.
4. Apertar a tecla TEST até aparecer o teste PT. Esperar parar de piscar o display “Adjust”.
5. Pipetar 100µL do primeiro plasma na cubeta.
6. Apertar a cubeta com o plasma – a luz vermelha se acende, iniciando a cronometragem
do tempo de incubação.
7. Pipetar, sucessivamente os outros plasmas.
8. Ao término do tempo, a luz vermelha pisca e apaga, indicando o final da incubação.
9. Colocar a cubeta na posição de leitura (no centro), apertar e zerar.
10. Pipetar 200µL da tromboplastina já aquecida na cubeta com o plasma (Pipetar de forma
firme, sem introduzir a pipeta no orifício além de 10mm).
11. Apertar repetidamente a tecla TEST para obter os valores de % e INR.

PARA O EQUIPAMENTO LIBERAR OS RESULTADOS DA ATIVIDADE E DO INR,

DEVE-SE ELABORAR A CURVA DE CALIBRAÇÃO.

▪ Como programar a curva de calibração:

Preparar um pool de plasmas normais de pelo menos 5 doadores entre 20 e 40 anos. Um

exame preliminar deverá assegurar que os plasmas citratados forneçam valores na faixa
normal antes da mistura deles.

▪ Como preparar as diluições do pool de plasmas:

Preparar uma diluição do pool, da seguinte forma:

Tubo 1 – pool de plasma normal (100,0%)
Tubo 2 – 0,5mL do tubo 1 + 0,5mL de solução fisiológica (50,0%)
Tubo 3 – 0,1mL do tubo 1 + 0,2mL de sol. fisiológica (33,3%)
Tubo 4 – 0,5mL do tubo 2 + 0,5mL de sol. fisiológica (25,0%)

Testar cada uma destas diluições (em duplicata) como se fossem amostras, seguindo os
itens 1 a 10 do procedimento do teste. Anotar os resultados.

23
 ▪ Introdução da Curva do TP no equipamento:

Apertar simultaneamente as teclas RESET e TEST (ao mesmo tempo). Aparecerá

rapidamente no display “CALIBRAT” e em seguida o valor da primeira atividade. Caso
os valores estejam corretos e você deseja verificá-los, apertar a tecla “TEST”, e o
equipamento mostrará os valores memorizados.
Se os valores não estiverem corretos, ou no caso de uma nova calibração onde serão
introduzidos outros valores, deve-se apertar a tecla “RESET” até que o número que se
deseja modificar esteja piscando. Apertar então a tecla “TEST” para modificar o número
até aparecer o número que se deseja introduzir (este vai aumentando de 1 em 1).
Continuar o processo até introduzir todos os valores de atividade e de segundos.
Ao final, aparecerá os valores relativos ao tempo de normal (que deve ser igual ao
100% da curva de calibração) e do ISI (índice característico do lote de tromboplastina
que varia de 1 a 2 – acompanha o kit)
Estes valores podem ser utilizados para o lote da tromboplastina a qual foi calibrada,
devendo ser mudada sempre que houver mudança de lote. Ao final do procedimento,
aparecerá “SAVEDATA” indicando que os valores foram memorizados no equipamento.

TÉCNICA PARA TTPA (TEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ATIVADA):

1. Na posição reservada ao reagente, colocar o cloreto de cálcio para aquecer por pelo
menos 10 minutos antes de iniciar o teste. Somente colocar a quantidade suficiente para
os teste, pois depois de aquecido, este não poderá ser reutilizado.
2. Colocar as cubetas de amostra na posição de incubação (até 2 testes).
3. Acrescentar uma bilha em cada cubeta, com o auxílio do dispensador.
4. Apertar a tecla TEST até aparecer o teste PTT. Esperar parar de piscar o display
“Adjust”.
5. Pipetar 100µL dos plasmas na cubeta.
6. Apertar a cubeta com o plasma – a luz vermelha se acende, iniciando a cronometragem
do tempo de incubação. Esperar que esta se apague.
7. Acrescentar 100µL de cefalina ativada (Não utilizar reagentes com ativador Kaolin, pois
este impede a leitura foto-ótica do equipamento devido à sua intensa turbidez).
8. Apertar a cubeta novamente – a luz vermelha se acende, iniciando a cronometragem do
tempo de incubação. Esperar que esta se apague.
9. Colocar a cubeta na posição de leitura (no centro), apertar e zerar.
10. Pipetar 100µL do cloreto de cálcio já aquecido na cubeta com o plasma (Pipetar de
forma firme, sem introduzir a pipeta no orifício além de 10mm).
11. O equipamento mostrará o resultado em segundos.

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 DETERMINAÇÃO DO GRUPO SANGUÍNEO (ABO) E FATOR Rh

TÉCNICA EM TUBO:

1. Lavar os glóbulos 3 vezes com salina (0,85%). Usar 2 gotas de sangue e +/- 2 mL de
salina, centrifugar durante 3 minutos a 2.000 rpm (cada etapa).
2. Após a última lavagem, desprezar o sobrenadante.
3. Preparar uma suspensão a 5%, sobre a gota que sobrou (hemácia), adicionando 19 gotas
de salina.
4. Colocar nos tubos devidamente marcados ( A, B, Rh) uma gota da suspensão à 5%.
5. Colocar os anti-soros A,B,Rh nos respectivos tubos (1 gota em cada) e centrifugar a
2.000 rpm durante 2 a 3 minutos.
6. Observar a aglutinação após delicada agitação.

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 COOMBS DIRETO (PESQUISA DE ANTÍGENOS)

TÉCNICA:

1. Lavar as hemácias por 3 vezes com salina (0,85%). Usar 2 gotas de sangue e +/- 2 mL de
salina, centrifugar durante 3 minutos a 2.000 rpm (cada etapa).
2. Após a última lavagem, desprezar o sobrenadante.
3. Preparar uma suspensão a 5%, sobre a gota que sobrou (hemácias), adicionando 19 gotas
de salina.
4. Colocar nos tubos, devidamente marcados, uma gota da suspensão a 5%.
5. Em cada tubo adicionar 02 gotas de soro anti-humano. Homogeneizar bem.
6. Centrifugar a 1.500 rpm por 1 minuto e fazer a leitura.
7. Agitar suavemente os tubos para pesquisar aglutinação.
8. Se não houver aglutinação ou hemólise visíveis a olho nu, será necessária a observação
ao microscópio.

RESULTADO:

Se houver aglutinação ou hemólise: POSITIVO

Se não houver aglutinação ou hemólise: NEGATIVO

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 COOMBS INDIRETO

TÉCNICA:

FASE PRELIMINAR – PREPARAÇÃO DOS TUBOS I E II:

1. Selecionar 2 indivíduos do grupo sanguíneo “O” Positivo. Identificar cada indivíduo

como Tubo I e Tubo II.
2. Lavar as hemácias por 3 vezes com salina (0,85%). Usar 2 gotas de sangue e +/- 2 mL de
salina, centrifugar durante 3 minutos a 2.000 rpm (cada etapa).
3. Após a última lavagem, desprezar o sobrenadante.
4. Preparar uma suspensão a 5%, sobre a gota que sobrou (hemácias), adicionando 19 gotas
de salina.
5. Colocar em novos tubos, devidamente marcados (I e II), uma gota da suspensão a 5%.

1° ETAPA: MEIO SALINO À TEMPERATURA AMBIENTE

Esta etapa visa detectar anticorpos salinos (aglutininas salinas da classe IgM) reativos à temperatura
ambiente (23°C)

6. Adicionar, em cada um dos dois tubos de ensaio previamente identificados I e II, duas
gotas do soro sob triagem para anticorpos irregulares. Homogeneizar bem, com o
cuidado para não formar espuma.
7. Centrifugar ambos os tubos durante 15 segundos a 3400 rpm ou 1 minuto a 1000 rpm.
8. Ressuspender delicadamente o botão de hemácias, em cada tubo, observando a presença
ou não de hemólise e/ou aglutinação.

2ª ETAPA: MEIO PROTÉICO À TEMPERATURA AMBIENTE

Esta etapa visa detectar anticorpos salinos (IgM) que têm sua ação intensificada em meio protéico e
anticorpos incompletos albumínicos mais potentes (anticorpos da classe IgG)

9. Adicionar em cada tubo 2 gotas de albumina bovina a 22%. MISTURAR BEM.

10. Proceder como nas passagens 7 e 8.

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3ª ETAPA: MEIO PROTÉICO À TEMPERATURA DE 37°C

Esta etapa visa detectar anticorpos incompletos albumínicos reativos a 37°C, como os
anticorpos do sistema Rh.

11. Incubar ambos os tubos em banho-maria a 37°C durante 45 minutos.

12. Proceder como nas passagens 7 e 8.

4ª ETAPA: TESTE DA ANTIGLOBULINA HUMANA (COOMBS INDIRETO)

Esta etapa visa detectar anticorpos incompletos reativos pelo teste de coombs indireto
(Anticorpos de classe IgG das imunoglobulinas e anticorpos fixadores de componentes
do complemento à membrana celular

13. Lavar o conteúdo dos tubos I e II com solução salina por 3 vezes consecutivas.
Decantar completamente a solução salina após a última lavagem.
14. Adicionar a ambos os tubos 2 gotas de soro anti-humano monoespecífico (anti
IgG humana).
15. Proceder como nas passagens 7 e 8.
16. Se não houver aglutinação ou hemólise visíveis a olho nu, será necessária a
observação ao microscópio.
17. Confirmando a positividade, realizar a titulação seriada do soro sob triagem,
repetindo todas as etapas do teste (a partir do item 6).

RESULTADO:

Se houver aglutinação ou hemólise: POSITIVO,

TITULAÇÃO 1/X Se não houver aglutinação ou
hemólise: NEGATIVO

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A titulação deverá ser realizada até que o teste seja negativo. Entretanto, títulos superiores a 1/16 são
considerados críticos e apresentam a mesma significância clínica, elevado risco de hidropsia fetal; portanto, não
há necessidade de diluição, acima de 1/32. Nestes casos, o resultado deverá ser liberado como: Coombs Indireto:
Positivo, Título > 1:16.

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