MÉTODO SMWW 9213 – B : Staphylococcus aureus ( presença e ausência)

1-Materiais necessários

2-Preparo da amostra

3-Execução do método

4- Expressão dos resultado

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MÉTODO SMWW 9213 – E : Pseudomonas Aeruginosas ( Presença e ausência)- Substrato

enzimático

1-Materiais necessários

2-Preparo da amostra

3-Execução do método

4- Expressão dos resultados

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MÉTODO SMWW 9213 – G : Pseudomonas Aeruginosas ( Substrato enzimático e fluorogênico)

1-Materiais necessários

2-Preparo da amostra

3-Execução do método

4- Expressão dos resultados

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MÉTODO SMWW 9230 D : Enterococcus Faecalis ( Presença e ausência) – Substrato Enzimático

1-Materiais necessários

2-Preparo da amostra

3-Execução do método

4- Expressão dos resultados

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MÉTODO SMWW 9218 B : Endósporos aeróbicos

1-Materiais necessários

2-Preparo da amostra

3-Execução do método

4- Expressão dos resultados

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9215 E. Enzyme Substrate Method PAGINA1134

MÉTODO SMWW 9215 E - Método de substrato enzimático

1- Objetivo

O objetivo desta técnica de semeadura é obter colônias isoladas.

A contagem de placas heterotróficas (HPC), anteriormente conhecida como contagem
de placas padrão, é um procedimento para estimar o número de heterótrofos vivos e
cultiváveis em uma amostra de água e medir as mudanças durante o tratamento e
distribuição da água ou em piscinas. As colônias podem surgir de pares, cadeias,
aglomerados ou células únicas, todas incluídas no termo “unidades formadoras de
colônias” (UFC). Esta é uma das técnicas mais utilizada para o isolamento de bactérias.

1-Materiais necessários

a. Pipetas de 0,1, 1,0 e 10 mL, estéreis, graduadas, de vidro ou plástico descartável ou

micropipetas com pontas descartáveis estéreis.

b. Incubadora regulada para 35 ± 0,5 °C.

c. Fonte de luz ultravioleta, comprimento de onda longo, 6 W, 365–366 nm.

d. Placas de amostra, SimPlate.

4- Amostra e Preparação da amostra

Amostra 9060 A.

Inicie a análise o mais rápido possível após a coleta para minimizar alterações na
população bacteriana. O tempo máximo recomendado entre a coleta e a análise da
amostra é de 8 horas. Quando a análise não puder começar dentro de 8 horas, mantenha
a amostra a uma temperatura inferior a 4°C, mas não congele. O tempo máximo
decorrido entre a coleta e a análise não deve exceder 24 horas.
3- Amostragem
1. Para águas cloradas utilizar o Tiossulfato de Sódio a 10% colocado nos frascos
de coleta para neutralizar a ação do cloro; colocar duas gotas (0,1 ml) de
Tiossulfato de Sódio a 10% dentro do frasco;
 2. Colocar uma tira de papel-alumínio entre a boca e a tampa do frasco;
3. Envolver a boca e tampa do frasco em papel-alumínio.

4- Amostra e Preparação da amostra

Amostra 9060 A.

Inicie a análise o mais rápido possível após a coleta para minimizar alterações na
população bacteriana. O tempo máximo recomendado entre a coleta e a análise da
amostra é de 8 horas. Quando a análise não puder começar dentro de 8 horas, mantenha
a amostra a uma temperatura inferior a 4°C, mas não congele. O tempo máximo
decorrido entre a coleta e a análise não deve exceder 24 horas.

4.1- Preparação da amostra

Marque cada placa com o número da amostra, diluição, data e qualquer outra
informação necessária antes de iniciar a análise. Para métodos de derramar ou espalhar
em placa, use placas de Petri de vidro estéril (65 cm 2) ou plástico descartável pré-
esterilizado (57 cm2. Misture completamente todas as amostras ou diluições agitando
vigorosamente durante 7 s manualmente (aproximadamente 25 vezes) ou através de um
agitador mecânico durante 15 s a baixa velocidade. Os resultados analíticos dependem
da mistura adequada das amostras; se a amostra não for agitada adequadamente antes da
remoção das alíquotas, a densidade bacteriana real poderá ser sub ou superestimada.

4.2- Diluição da amostra

4.2.1- Cuidados a serem observados durante o procedimento de diluição

1. Utilize uma pipeta estéril para transferências iniciais e subsequentes de cada

recipiente. Se a pipeta ficar contaminada antes da conclusão das transferências,
substitua-a por uma pipeta estéril.
2. Use uma pipeta separada para transferências de cada diluição diferente.
3. Não prepare diluições e coloque as placas sob luz solar direta.
4. Tenha cuidado ao remover pipetas estéreis do recipiente;
5. Para evitar contaminação, não arraste a ponta da pipeta pelas extremidades
expostas das pipetas no recipiente de pipetas ou pelas bordas e gargalos dos
frascos de diluição. Ao remover a amostra, não insira pipetas mais de 2 a 3 cm
abaixo da superfície da mesma ou da diluição.

4.2.2- Como obter uma diluição inicial de 1:10 (10-1)

A diluição inicial recomendada para a maioria das amostras é de 1:10 (10 -1)
adicionando-se m gramas ou mililitros da amostra para 9 x m mililitros do diluente. Por
exemplo, para 25g de amostra, adicionar 9x25 ml de diluente (225 ml).

Homogeneizar amostra com o diluente por agitação, invertendo a embalagem 25 vezes.

Para permitir a homogeneização, utilizar tubos ou frascos com tampas de rosca. O
tamanho deve ser suficiente para que não mais do que 2/3 da capacidade seja preenchida
pela unidade analítica + diluente.

4.2.3- Como obter uma diluição inicial diferente de 1:10

Há casos especiais em que a primeira diluição diferente de 1:10. Para definir o volume
de diluente necessário para obter uma determinada diluição 1:k da amostra, usar a
relação v = [(k.m)-m]. Por exemplo, para obter a diluição 1:50 de uma unida de
analítica de 10g, adicionar [(50x10)-10] mililitros do diluente (490 ml). Para obter a
mesma diluição com uma unidade analítica de 20g, adicionar [(50x20)-20] mililitros do
diluente (980 ml).

Diluente: Água Peptonada 0,1 % (H2OP)

 Prepare adicionando 1 g de peptona a 1 L de água reagente.

 Dispense em volumes para fornecer 99 ± 2,0 mL ou 9 ± 0,2 mL após
autoclavagem por 15 min a 121 °C, ou em volumes maiores para uso como água
de enxágue.
 O pH final deve ser 7,0 ± 0,2 após a esterilização. Esterilize em autoclave por 15
minutos a 121 °C. A água peptonada preparada contida em frascos bem fechados
com tampa de rosca podem ser armazenada até 3 meses a <30 °C.
 Manuseie assepticamente e descarte se ocorrer turvação.
4.2.4- Seleção de diluições

Se possível, selecione diluições de forma que pelo menos uma placa de uma série
contenha 30 a 300 UFC (Figura 9215:1). Por exemplo, se a experiência indicar que a
contagem de placas heterotróficas pode chegar a 3.000 UFC, prepare as placas nas
diluições 10-1 e 10-2.

Para a maioria das amostras de água potável, plaquear 1 mL e 0,1 mL de amostra não
diluída e 1 mL da diluição 10-2 produz placas adequadas para contagem.

4.2.4.1- Medindo porções de amostra

 Não prepare diluições nem coloque as placas sob luz solar direta.
 Utilize uma pipeta estéril para todas as transferências de cada recipiente,
utilizando uma pipeta por diluição. Se alguma pipeta ficar contaminada antes da
conclusão das transferências, substitua-a por uma estéril.
 Tenha cuidado ao remover pipetas estéreis do recipiente. Para evitar
contaminação, não arraste a ponta da pipeta pelas extremidades expostas das
pipetas no recipiente de pipetas ou pelas bordas e gargalos dos frascos de
 diluição. Ao remover uma amostra, não insira a pipeta >2 a 3 cm abaixo da
superfície da amostra ou diluição.
4.2.4.2- Medição de diluições

1) Adicione a amostra a uma placa de Petri estéril antes de adicionar meio de

cultura derretido e temperado.
2) Ao descarregar porções de amostra, segure a ponta da pipeta ou micropipeta
em um ângulo de cerca de 45°, com a ponta tocando o fundo da placa de
Petri ou dentro do gargalo do frasco de diluição.
3) Levante a tampa da placa de Petri apenas o suficiente para inserir uma ponta
de pipeta ou micropipeta. Aguarde 2 a 4 s para que o líquido seja drenado da
marca de graduação de 1 mL até a ponta da pipeta.
4) Ao medir quantidades de 0,1 mL, deixe a amostra diluída drenar da
graduação de referência escolhida até que 0,1 mL tenha sido liberado.
5) Use diluições decimais ao preparar volumes de amostra <0,1 mL.
6) Ao examinar esgoto ou água turva, não meça um inóculo de 0,1 mL da
amostra original; em vez disso, prepare uma diluição apropriada (10 -2 a 10-5).
Prepare pelo menos duas réplicas de placas para cada volume de amostra ou
diluição examinada.
7) Se a pipeta não for do tipo soprada, toque a ponta da pipeta uma vez contra
um ponto seco no fundo da placa de Petri.
8) Se estiver usando uma pipeta do tipo soprada com tampão de algodão e um
bulbo de pipeta (menos preferível), sopre suavemente o volume restante da
diluição da amostra. Retire a pipeta sem tocá-la ainda mais no prato.
9) Misture completamente todas as amostras ou diluições agitando
vigorosamente durante 7 s manualmente (aproximadamente 25 vezes) ou
através de um agitador mecânico durante 15 s a baixa velocidade
10) Após depositar porções de teste para cada série de placas, despeje o meio de
cultura e misture cuidadosamente.
11) Não deixe passar mais de 20 minutos entre a adição da amostra e a adição do
ágar temperado às placas.

3. Meio

Use um meio comercialmente disponível, SimPlate (IDEXX Laboratories, Inc), em

recipientes estéreis para procedimentos multidose de 100 mL ou em tubos de ensaio
para procedimentos de dose unitária de 10 mL. O meio preparado comercialmente deve
ser adquirido do fabricante em recipientes estéreis para procedimentos multidose de 100
mL ou em tubos de ensaio para procedimentos de dose unitária de 10 mL. O pH deve
ser 7,0 ± 0,3. Composição de acordo com Standard 9215 A.6d..

Tabela 1. Composição do meio SimPlate (IDEXX Laboratories, Inc)

Constituinte Quantidade g/mL

Monossacarídeo 1,0g
 Fontes de carbono, nitrogênio, vitaminas e 5,1 g
minerais

Fontes de vitaminas, oligoelementos e 2,5 g

aminoácidos

Substrato indicador A (substrato indicador 0,025 g

de peptidase)

Substrato indicador B (para substrato 0,025 g

indicador de glicosidase)

Substrato indicador C (substrato indicador 0,025 g

de fosfatase) 0,025

Modo de preparo:

a. Multidose:

Reidratar o meio enchendo o recipiente do meio até a marca de 100 mL com diluente
estéril, tampando novamente e agitando até que o meio se dissolva.

b. Dose unitária:

Reidratar o meio adicionando 10 mL de amostra ou, se for esperado que a amostra seja
>73,8 MPN/mL, pipetar 9 mL de diluente estéril e 1 mL de amostra, recapitular e agitar
até que o meio se dissolva.

4. Diluente de amostra

Use água estéril de grau reagente, água tamponada ou peptona a 0,1% (consulte a Seção
9050 C.1).

Diluente: Água Peptonada 0,1 % (H2OP)

 Prepare adicionando 1 g de peptona a 1 L de água reagente.

 Dispense em volumes para fornecer 99 ± 2,0 mL ou 9 ± 0,2 mL após
autoclavagem por 15 min a 121 °C, ou em volumes maiores para uso como água
de enxágue.
  O pH final deve ser 7,0 ± 0,2 após a esterilização. Esterilize em autoclave por 15
minutos a 121 °C. A água peptonada preparada contida em frascos bem fechados
com tampa de rosca podem ser armazenada até 3 meses a <30 °C.
 Manuseie assepticamente e descarte se ocorrer turvação.

3-Execução do método

a. Multidose:

Pipete assepticamente 1,0 mL de amostra e depois 9 mL de meio reidratado no centro da

placa de amostra. Alternativamente, pipete assepticamente 0,1 mL de amostra e depois
9,9 mL de meio reidratado no centro da placa de amostra.

Nota: O volume final da amostra mais meio deve ser de 10 ± 0,2 mL.

Cubra o prato com uma tampa e agite suavemente para distribuir a mistura nos poços.
Incline a placa 90° a 120° para drenar o excesso de mistura para a almofada absorvente.
Inverter a placa e incubar a 35 ± 0,5 °C durante 45 a 72 h.

Se houver suspeita de que uma amostra tenha uma contagem >738 MPN/mL, dilua
adicionando 1 mL de amostra a um recipiente estéril contendo 99 mL de diluente estéril.
Faça diluições adicionais conforme necessário para manter as contagens <738 MPN/mL
na diluição final.

b. Dose unitária:

1) Após a preparação do meio com a amostra adicione todo o conteúdo ao centro do

prato. Nota: O volume final da amostra mais meio deve ser de 10 ± 0,2 mL.

Cubra o prato com uma tampa e agite suavemente para distribuir a mistura nos poços.
Incline a placa 90° a 120° para drenar o excesso de mistura para a almofada absorvente.

Inverter a placa e incubar a 35 ± 0,5 °C durante 45 a 72 h.

6. Contagem, Registro, Computação e Relatório Ver 9215 A.8c.

8- Registro e cálculo da contagem bacteriana

8.1- Contagem e registro

1) Despeje e espalhe as placas: conte todas as colônias nas placas selecionadas

imediatamente após a incubação. Se a contagem precisar ser adiada temporariamente,
armazene as placas refrigeradas por ≤24 h, mas evite isso como prática de rotina.

2) Registre os resultados dos controles de esterilidade para cada lote de amostras.

3) Conte as colônias manualmente usando um contador de colônias de campo escuro.
Estão disponíveis instrumentos automáticos de contagem de placas; eles geralmente
usam um programa de computador e um scanner e fornecem resultados computacionais.
A sua utilização é aceitável se, quando avaliada em paralelo com um método manual, os
resultados da contagem forem comparáveis.

4) Ao preparar placas, pipete volumes de amostra que produzam entre 30 e 300 colônias
por placa. O objetivo é ter pelo menos uma diluição que produza contagens de colónias
dentro destes limites, exceto conforme indicado abaixo. Normalmente, não pipete mais
de 2,0 mL de amostra; entretanto, se este volume de amostra produzir menos de 30
colônias, registre o resultado observado. Caso contrário, utilize apenas placas contendo
30 a 300 colónias ao determinar a contagem de placas. Calcule a contagem bacteriana
por mililitro da seguinte forma:

UFC/mL = _________ Colônias contadas ____________

Volume real da amostra plaqueada em mL
Ou

UFC/mL = ___________Colônias contadas _______________________

Diluição da placa contada x volume inoculado dessa diluição

Nota 1: Volume real da amostra = diluição da placa contada x volume inoculado dessa
diluição

 Se não houver nenhuma placa com 30 a 300 colônias e uma ou mais placas
tiverem mais de 300 colônias, use a(s) placa(s) com contagem mais próxima de
300 colônias. Calcule a contagem conforme a formula acima e relate como UFC
estimado por mililitro.
 Se as placas de todas as diluições de qualquer amostra não tiverem colônias,
relate a contagem como menor que um (1) dividido pelo maior volume de
amostra correspondente utilizado. Por exemplo, se nenhuma colônia se
desenvolver a partir do volume de amostra de 0,01 mL, relate a contagem como
inferior a 100 (100) UFC/mL.
 Se o número de colónias por placa exceder 300, não reportar resultados como
“numerosos demais para serem contados”.
 Se houver menos de 10 colônias/cm2 contam colônias em 13 quadrados (do
contador de colônias) com distribuição representativa de colônias. Se possível,
selecione sete quadrados consecutivos horizontalmente na placa e seis quadrados
consecutivos verticalmente, tomando cuidado para não contar um quadrado mais
de uma vez. Calcule as colônias estimadas por placa da seguinte forma:
 a) Quando a placa tiver 65 cm 2 (a área típica de uma placa de vidro), multiplique a
soma do número de colônias em 13 centímetros quadrados representativos por
5;
b) Quando a placa tiver 57 cm2 (a área típica de uma placa de plástico),
multiplique a soma do número de colônias em 19 centímetros quadrados
representativos por 3.
c) Quando houver mais de 10 colônias/cm2, conte 4 quadrados representativos,
calcule a contagem média por cm 2 e multiplique pelo fator apropriado (57 para
placas plásticas descartáveis e 65 para placas de vidro) para estimar as colônias
por placa.
d) Quando as contagens bacterianas em placas lotadas forem >100 colônias/cm 2,
relate os resultados como >6.500 dividido pelo menor volume de amostra
plaqueado para placas de vidro ou >5.700 dividido pelo menor volume de
amostra plaqueado para placas de plástico. Relatar como UFC/mL estimado.
Nota 2: O diâmetro nominal das placas descartáveis de plástico e de vidro não
descartáveis é de 100 mm. No entanto, o diâmetro interno das placas descartáveis é mais
próximo de 85 mm e o das placas não descartáveis é mais próximo de 90 mm.

 Se houver dispersão de colônias (espalhadores) encontrados nas placas

selecionadas, conte as colônias em porções representativas somente quando as
colônias estiverem bem distribuídas em áreas livres de espalhadores e a área
coberta pelos espalhadores não exceder metade da área da placa. Ao contar
colônias espalhadas, conte cada um dos seguintes tipos como um:
a) Uma cadeia de colônias que parece ser causada pela desintegração de um
aglomerado bacteriano quando o ágar e a amostra foram misturados
b) Um espalhador que se desenvolve como uma película ou crescimento entre o
ágar e o fundo da placa de Petri
c) Ou uma colônia que se forma em uma película de água na borda ou sobre a
superfície do ágar.
As colónias espalhadas desenvolvem-se devido à acumulação de humidade no ponto
de origem do espalhador.

 Se uma colónia em expansão cobrir mais de metade da placa, uma contagem

fiável poderá não ser possível e a amostra deverá ser invalidada.
a) Conte colônias adjacentes semelhantes como colônias individuais, desde que não
se toquem e a distância entre elas seja pelo menos igual ao diâmetro da menor
colônia. Conte colônias impactantes que diferem em aparência (por exemplo,
morfologia ou cor) como colônias individuais.
 Se as placas apresentarem crescimento excessivo do espalhador,
a) Reporte como “espalhador” (Spr.).
  Quando as placas forem incontáveis devido a perda de diluição, queda acidental
ou contaminação, ou então as placas de controle indicarem que o meio ou outro
material foi contaminado
a) Reportar como “acidente de laboratório” (AL).
9- Relatórios

O termo “unidade(s) formadora(s) de colônia” (UFC) é descritivo dos métodos

utilizados; portanto, relate todas as contagens como unidades formadoras de colônias.
Incluir no relatório o método utilizado, a temperatura e o tempo de incubação e o meio.
Por exemplo: UFC/mL, método de derramamento em placa, 35°C/48 h, ágar de
contagem em placa.

10- Controle de qualidade -viés analítico

Registre os resultados dos controles de esterilidade no relatório para cada lote de

amostras.
Evite imprecisões na contagem devido a descuido, óptica danificada ou suja que
prejudica a visão ou falha no reconhecimento de colônias. Os trabalhadores de
laboratório que não conseguem duplicar as suas próprias contagens na mesma placa
dentro de 5% e as contagens de outros analistas dentro de 10% devem descobrir a causa
e corrigir tais divergências.

11- Expressão dos resultados

Os resultados são expressos como nº de Colônias de bactérias/ ml ou Unidades

Formadoras de Colônias (UFC)/ml.