Anexos Provas Bioquímicas

Microbiologia Clínica – R592 Profa. Ângela Veras Unifor - 2021.
Farmácia
Anexos
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Microbiologia Clínica – R592 Profa. Ângela Veras Unifor - 2021.1
Normas de Biossegurança
A manipulação de micro-organismos no laboratório de microbiologia resulta em perigo potencial e

exige o emprego correto de técnicas assépticas e de todo o instrumental para evitar contaminação do
ambiente laboratorial, do operador e do material que está sendo processado.
As fontes de infecções mais comuns no laboratório são os aerossóis, minúsculas gotas d’água
formadas pelo esguicho de líquidos com a pipeta, pelo vibrar da alça de platina ou pela evaporação
brusca de uma suspensão, que podem carrear micro-organismos para o ambiente. Essas gotículas
permanecem suspensas no ar por longos períodos e podem, ocasionalmente, ser inaladas ou
depositadas na pele e mucosas causando infecções.
Durante as aulas práticas, serão utilizados micro-organismos, alguns deles, patogênicos para o
homem. Desta forma, a segurança no laboratório dependerá do grau de obediência aos seguintes
itens.
1. Use o jaleco ou bata sempre que estiver trabalhando no laboratório. Ele evitará contaminação da
roupa com culturas e protegerá contra respingos de corantes e outras substâncias químicas;
2. Evite mexer em qualquer objeto sem a permissão do professor;
3. Não coloque bolsas e livros sobre a bancada de trabalho;
4. Providencie para que o menor corte ou erosão da pele estejam protegidos antes de iniciar os
trabalhos;
5. Não leve a mão à boca, quer seja para comer, fumar, passar batom, atender celular; Mantenha
canetas, lápis e quaisquer objetos sem contato com a boca ou face. O manuseio de micro-
organismos poderá contaminar esses objetos, facilitando a contaminação do operador;
6. Tome cuidado com os olhos a fim de evitar respingos de material contaminado;
7. Cuidado ao acender o bico de Bunsen nas proximidades de produtos inflamáveis como álcool, éter,
etc. e cuide para que a chama não atinja os cabelos. Em caso de acidente, abafe imediatamente
com um pano;
8. Tubos e placas com meios de cultura ou cultura somente deverão ser abertos nas proximidades da
chama do bico de Bunsen, para evitar contaminação e somente pelo tempo necessário à realização
da operação.
9. Os tubos de culturas deverão ser colocados em estantes ou suportes adequados, nunca nos bolsos
do jaleco ou largados sobre a bancada;
10. Os tubos com meio de cultura e cultura deverão ser flambados após sua abertura e antes de serem
tampados novamente. Após a flambagem, a boca dos tubos ficará quente. Portanto, nunca segure
o tubo de ensaio pela boca, mas sempre do meio para a base;
11. O tampão de algodão pode pegar fogo durante a flambagem. Neste caso, segure o tubo pela base
e molhe a rolha incendiada. Caso o tampão esteja na sua mão, coloque-a no frasco destinado às
lâminas usadas; Jamais deixe os tampões largados sobre a bancada;
12. Em caso de queimaduras, comunique imediatamente ao professor. As queimaduras localizadas e
sem gravidade serão tratadas com água gelada imediatamente, a fim de não criar bolhas e aliviar a
dor. Gelo ou misturas refrigerantes não devem ser usados porque podem causar injúrias térmicas;
Comunique ao professor a quebra de qualquer utensílio de vidro, ou derramamento de líquidos
para que possa ser providenciada uma eventual desinfecção;
Não esguiche o conteúdo das pipetas. Deixe o líquido escorrer naturalmente ou com leve pressão
(o esguicho produzirá aerossóis).
13. Jamais se desloque de um lugar conduzindo objetos pontiagudos, tais como, pipetas, alças,
agulhas. Estes deverão ser deixados sobre uma estante ou suporte imediatamente após seu
uso;
14. Não permita que outra pessoa distraia sua atenção quando estiver manipulando micro-
organismos;
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15. Assegure-se de que a alça de platina ou agulha tenham sido adequadamente esterilizadas antes e
depois do seu uso. Flambe-as sempre na vertical e não na horizontal, primeiro na chama
redutora e depois na chama oxidante até o rubro. Isso evitará produção de aerossóis para o
ambiente;
16. Não cheire recipientes contendo culturas;
17. As pipetas, bastões lâminas, lamínulas e swabs contaminados deverão ser desprezados em
recipientes apropriados contendo hipoclorito, para posterior descontaminação, e nunca
largados sobre a bancada;
18. Nunca derrame culturas vivas no esgoto, esse material deverá ser submetido à esterilização antes
de ser descartado;
19. Identifique todo o material a ser utilizado com nome, data, turma, etc. Cada aluno será
responsável pelo material que receber;
20. Os microscópios devem ser manuseados com cuidado e após seu uso, limpar cuidadosamente a
objetiva de imersão com papel absorvente apropriado embebido em álcool a 70% ou
isopropílico;
Antes de deixar o laboratório, lave as mãos com sabão e em seguida com um antisséptico;
Certifique-se de que as torneiras de gás foram fechadas e de que os aparelhos elétricos estão
desligados.
Protocolo de biossegurança para o retorno gradual das

atividades no Campus desenvolvido pela UNIFOR
Confira o protocolo de Biossegurança acessando o Link.
https://www.unifor.br/documents/20143/3588468/Protocolo+de+Bioss
eguran%C3%A7a+da+Universidade+de+Fortaleza_2020.pdf
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Técnica de Preparo do Esfregaço para Coloração
Devem ser utilizadas, de preferência, lâminas novas colocadas em recipientes com álcool até o
momento do uso. As lâminas devem ser identificadas a lápis com as iniciais do paciente, número de
protocolo e outras informações, dependendo do caso. O esfregaço não deve ser nem muito escasso
e nem muito espesso, o que poderia corar demais as estruturas dificultando o reconhecimento e
avaliação das estruturas presentes. Se a amostra for escassa, demarcar a área do esfregaço.
1. Esfregaços a partir de crescimento bacteriano em cultura
 Colocar uma gota pequena de salina estéril.
 Flambar a alça bacteriológica, esperar esfriar, coletar um pouco do crescimento bacteriano
de 24 horas e espalhar na gota de salina distribuindo bem o material em uma área em torno
de 1-2cm no centro da lâmina. Esperar secar ao ar ou na estufa. Não haverá necessidade de
fixar em chama se algum dos reagentes (o cristal violeta ou a salina) já estiver com o fixador
(metanol) na formulação.
2. Esfregaço de amostras colhidas em “swab”
 Rolar delicadamente o swab sobre a superfície da lâmina.
 Em caso de apenas um swab ter sido usado na coleta, suspender o swab em salina estéril,
agitar, comprimir o swab contra a parede do tubo e a partir da suspensão obtida, preparar o
esfregaço colocando de 1 a 2 gotas em lâmina e semear nos meios de cultura apropriados a
partir da suspensão.
 Deixar secar ao ar e fixar passando 3-4 rapidamente sobre a chama (o aquecimento excessivo
pode alterar as estruturas e, consequentemente, o padrão de coloração).

 Sempre que possível, coletar dois “swabs”.
3. Esfregaços de aspirado, exsudatos e fezes
 Amostras recebidas em seringa devem ser transferidas para um frasco estéril,
homogeneizadas e retirada uma pequena porção para realização do esfregaço fino

espalhando-se o material em torno de 2-3 cm do centro da lâmina. Se a amostra for muito
espessa, fazer diluição com 1 gota de salina estéril na própria lâmina, como no esfregaço a
partir de material de cultura.
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 Amostras de exsudatos selecionar a parte mais purulenta para realizar o esfregaço. Na
amostra fecal, selecionar, preferencialmente a porção que tiver muco e sangue para
confeccionar o esfregaço e para a semeadura.
4. Esfregaço de escarro
 Selecionar a parte mais purulenta para realizar o esfregaço, separando da saliva e com auxílio
de uma alça bacteriológica estéril ou palito de madeira rolar o material para fazer um filme
delgado sobre a lâmina.
 Para coloração de Zielh-Neelsen o esfregaço deverá tomar toda a lâmina.
5. Esfregaço de meio de cultura líquido
 Com uma alça bacteriológica estéril coletar uma gota da suspensão homogeneizada e colocar
sobre a lâmina. Esperar secar ao ar ou na estufa e fixar rapidamente sobre a chama 3-4 vezes
. Se a suspensão estiver pouco densa, colocar mais de uma gota.
6. Urina de jato médio
 Com uma alça bacteriológica de 10µl e estéril, coletar verticalmente uma gota de urina
homogeneizada não centrifugada e colocar sobre a lâmina previamente limpa e seca sem
espalhar. Esperar secar e fixar.
7. Urina de 1o jato
 Centrifugar a urina a 2.000/10min. Desprezar o sobrenadante e dispensar uma gota do
sedimento em lâmina previamente limpa e seca sem fazer movimentos.
8. Biópsia ou fragmento de tecido
 Colocar o material em placa de Petri estéril fragmentando-o com o auxílio de um bisturi;
 Fazer imprints na lâmina e deixar secar.
Fonte: OPLUSTIL, C. P. et al. Procedimentos básicos em Microbiologia Clínica. Editora Sarvier. 3ª Ed. São
Paulo/SP. 2010.
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Coloração de Gram
Introdução
A coloração de Gram é um método de coloração diferencial usado para demonstrar as
propriedades morfotintoriais e o arranjo das bactérias, tendo em vista sua afinidade pelos corantes
derivados da anilina.
Este método foi desenvolvido pelo bacteriologista Christiam Gram e tem grande importância
na taxonomia bacteriana, pois classifica as bactérias em dois grupos, o das Gram-positivas e Gram-
negativas, além de fornecer informações valiosas para o diagnóstico e tratamento das doenças
bacterianas.
Reagentes utilizados
 Cristal Violeta ou Violeta de Metila (Corante primário).
 Lugol - Iodo metálico e iodeto de potássio (Mordente).
 Álcool absoluto, Álcool (Descorante)
 Fucsina ou safranina (Corante secundário-cora as bactérias Gram negativas).
Mecanismo da coloração de Gram

É baseado na composição química e nas diferenças de permeabilidade da parede celular das
bactérias.
Gram negativas – parede com uma fina

camada de peptideoglicano e uma membrana externa
rica em lipídios.
Gram positivas – parede mais espessa,

constituída principalmente por peptídeoglicano.
Após a adição do cristal violeta e do lugol (um mordente), forma-se um complexo CV-I, dentro
das células Gram-positivas e Gram-negativas. Este complexo é maior que a molécula de cristal violeta,
não podendo ser removido da camada espessa e intacta de peptideoglicano das Gram-positivas,
quando da adição do descorante. Estas células, portanto, permanecem coradas de azul-roxo (a cor do
CV-I). Entretanto, nas Gram-negativas, a lavagem com o descorante, desestrutura a camada externa de
lipídeos, aumentando a permeabilidade da parede, o que permite que o pelo álcool. Estas células
ficam incolores até serem coradas com a safranina ou fucsina, quando adquirem coloração rosa.
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Demonstração esquemática do Método
Iodopararrosanilina (CV-I)
Técnica para a Coloração de Gram
1. Preparar um esfregaço fino do material em estudo em salina estéril e secá-lo ao ar.
2. Fixar o esfregaço passando a lâmina rapidamente 3-4 vezes sobre a chama caso nenhum dos reagentes
apresente um fixador na formulação;
3. Colocar a lâmina sobre um suporte de coloração e cobrir a superfície com solução de Cristal Violeta.
4. Após 1 minuto, lavar com água destilada.
5. Cobrir o esfregaço com lugol/ 1min.
6. Descorar com álcool absoluto, até que a cor violeta não seja mais arrastada.
7. Lavar com água destilada.
8. Cobrir o esfregaço com o corante de contraste, fucsina ou safranina por 1 min. Lembrar que o
contraste proporcionado pela safranina é melhor que com a fucsina.
9. Lavar com água destilada.
10. Secar cuidadosamente com papel de filtro e examinar o esfregaço corado ao microscópio com objetiva
de imersão.
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Provas Bioquímicas para Identificação Bacteriana

Introdução
A identificação de bactérias requer a observação de várias características, entre elas,

morfológicas, culturais, metabólicas, bioquímicas, antigênicas, sorológicas, genéticas e ecológicas. No
entanto, nem sempre é necessário examinar todas essas características. Para cada grupo de bactérias
há, geralmente, certos dados relativos às suas características de maior importância em relação a
outros para a identificação de gêneros ou espécies.
O estudo das características bioquímicas é de especial importância para a identificação das
bactérias, já que suas características microscópicas e culturais (macroscópicas) podem se assemelhar,
mas suas reações metabólicas podem diferir.
Por meio das chamadas provas bioquímicas podem ser detectadas características do
metabolismo bacteriano referentes à capacidade que têm as bactérias de utilizar certos substratos
como açúcares, proteínas e lipídeos em função do tipo de enzimas vinculadas ao seu metabolismo.
Algumas provas pesquisam a capacidade de fermentação de alguns carboidratos, a via de
fermentação de carboidratos, ou a utilização do carboidrato por via fermentativa e/ou oxidativa.
Noutras provas são pesquisadas a presença de enzimas do metabolismo bacteriano por meio da
detecção da degradação dos seus substratos ou a sensibilidade/resistência a certos antimicrobianos.
Provas sorológicas para pesquisar determinados antígenos bacterianos também são utilizadas além
das provas moleculares, que detectam genes característicos das espécies bacterianas.
Neste capítulo, estudaremos as principais provas que são essenciais para a identificação dos
gêneros e espécies de bactérias mais comumente isoladas no laboratório clínico.
Prova da Catalase
Princípio
Esta prova pesquisa a presença da enzima catalase produzida por alguns micro-organismos. É usada no
laboratório principalmente para diferenciar o gênero Staphylococcus (positivo) dos Streptococcus
(negativos) ou auxiliar na caracterização de Neisserias e de espécies de bacilos Gram-positivos e
micobactérias.
O peróxido de hidrogênio se forma como um dos produtos finais do metabolismo oxidativo ou aeróbio
dos carboidratos. Se deixado acumular, é letal para as células bacterianas. A catalase transforma o
peróxido de hidrogênio em água e oxigênio, como demonstra a seguinte reação:
Catalase
H2O2 H2O + O2 (bolhas de O2)
Procedimento
- Com uma agulha ou alça bacteriológica, transferir 2-3

colônias bem isoladas para o centro de uma lâmina de
vidro previamente limpa e desengordurada fazendo
movimentos circulares; Teste positivo da Catalase
- Adicionar uma a duas gotas de peróxido de hidrogênio 3% e
observar a produção de bolhas.
- Caso seja usada alça ou agulha descartável, o reagente pode ser adicionado primeiro, seguido pelas
colônias. Entretanto, se a alça ou agulha contiver ferro, esta não deve tocar no reagente porque
pode produzir reações falso-positivas.
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- Se a bactéria tiver sido cultivada em agar sangue, ter o cuidado para não retirar partes do meio junto
com a colônia, pois pode resultar em uma reação falso positiva fraca, já que o sangue tem atividade
de catalase.
Reagente: Peróxido de hidrogênio a 3% mantido sob refrigeração.
A produção de bolhas indica reação positiva.
Prova da Coagulase
Princípio
A prova pesquisa a produção da coagulase, enzima produzida por Staphylococcus aureus que tem a
capacidade de coagular o plasma humano ou de coelho.
No laboratório, a prova da coagulase é utilizada para diferenciar S. aureus (coagulase-positivo) de
outros estafilococos (coagulase negativos) e micrococos.
A coagulase está presente nos Staphylococcus em duas formas: livre e conjugada.
A coagulase conjugada ou ligada, também chamada de fator “clumping” ou aglutinante é uma
substância associada à parede da célula, que reagindo com o plasma, causa a aglutinação do mesmo. A
prova é realiza em lâmina d detecta esse fator aglutinante.
A coagulase livre é produzida e liberada da célula. Ela reage com um fator plasmático, formando um
complexo que atua no fibrinogênio formando a fibrina. É detectada quando a prova é realizada em
tubo.
Mais de 95% das cepas de S. aureus produzem fator clumping que é detectado quando se faz a prova
em lâmina. Com exceção de S.lugdunensis que é fator clumping positivo e coagulase em tubo negativo,
todos os organismos fator “clumping” positivos e que também produzem coagulase livre são
identificados presuntivamente como S. aureus. S. intermedius, e S.hycus que são fator clumping
negativos podem apresentar coagulase livre (raramente), mas estas espécies são de baixa incidência
na clínica. Isolados que não produzem fator clumping devem ser testados quanto à habilidade de
produzir a coagulase livre (detectada quando se faz a prova em tubo), já que, nem todos os S. aureus
são positivos para fator clumping.
Reagente: Difco: Bacto plasma coagulase; BBL: Plasma coagulase de carneiro.
Procedimento
Prova em lâmina (coagulase conjugada-fator clumping)
- Colocar uma gota de salina estéril sobre uma lâmina de vidro previamente limpa;
- Emulsionar suavemente com movimentos circulares 3-4
colônias isoladas do organismo em estudo na salina
utilizando uma alça estéril;
- Colocar uma gota do plasma reconstituído junto à gota
da suspensão bacteriana e misturar bem;
- Inclinar a lâmina para um e outro lado, observando a
formação imediata de um precipitado granuloso ou de
grumos brancos;
A prova é positiva quando há formação de grumos e Coagulase em lâmina (Coagulase ligada). Reação
negativa quando não observa-se apenas a suspensão leitosa positiva.
inicial.
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Prova em tubo (coagulase livre)

- Colocar 0,2 mL de BHI em um tubo estéril;
- Preparar uma suspensão transferindo 3-4 colônias isoladas para o tubo com a salina;
- Colocar assepticamente 0,2 ml de plasma reconstituído no tubo de ensaio contendo a suspensão;
- Misturar por rotação e Incubar em estufa à 36 ± 1ºC de 1 a 4
horas;
- Verificar se há presença de coágulo gelatinoso;
- Se não houver presença de coágulo, incubar o tubo em
temperatura ambiente e repetir as leituras com 18 e 24 horas de
incubação.
A presença de um coágulo gelatinoso em qualquer grau indica

prova positiva.
A prova também pode ser realizada sem a salina. Coagulase em tubo (Coagulase livre). Reação
positiva no tubo inferior.
OBS: Durante a leitura inclinar o tubo delicadamente e não agitar, pois a agitação pode desmanchar os coágulos parcialmente formados;
Inóculos muito leves são causas frequentes de falso negativo. O inóculo deve ser “leitoso” e bem homogeneizado para não sobrarem grumos
que podem ser confundidos com prova positiva. Não utilizar colônias crescidas em meios com inibidores (agar manitol).
A prova da coagulase identifica presuntivamente S.aureus. Recomenda-se que as duas provas sejam
realizadas para diminuir o caráter presuntivo aumentando a probabilidade do isolado realmente ser
S.aureus. Ver a.tabela abaixo:
Resultado da Prova da coagulase Livre e Ligada para algumas espécies de Staphylococcus
Espécie de Coagulase ligada Coagulase livre

Staphylococcus (em lâmina) (em tubo)
S. aureus  95 % + +
S. lugdunensis + -
S. intermedius - -*
S. hycus - -*
* Raras cepas dessas espécies apresentam coagulase livre positiva, além da baixa prevalência na clínica humana.
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Prova da Oxidase
A prova da oxidase utiliza um reativo corante, o dicloridrato de p-fenilenodiamina, que é incolor no

estado reduzido, mas na presença da enzima citocromo-oxidase, é oxidado, formando um composto
de cor que varia do rosa a roxo chamado indofenol. Essa prova pesquisa a produção da enzima
citocromo-oxidase, enzima do grupo das hemoproteínas que contêm ferro e funcionam como a última
ligação da cadeia respiratória aeróbica, transferindo elétrons ao oxigênio com formação de água. O
teste é útil para identificação preliminar de colônias suspeitas de pertencerem a um gênero da família
Enterobacteriaceae (todas negativas) ou a outros, tais como Pseudomonas, Burkholderi, Alcaligenes,
Vibrio, Aeromonas, Neisserias , Campylobacter, Pasteurella (positivas).
Procedimento
- Pode ser realizada usando tiras de papel impregnadas com

o reativo: Umedecer o papel reagente levemente com
água destilada estéril;
- Com uma alça descartável ou de platina, transferir uma
alçada da colônia suspeita na zona reagente do papel;
- Pode-se saturar um pedaço de papel de filtro com o
reagente líquido e passar a alça com a colônia suspeita;
- As colônias bacterianas que produzem oxidase
desenvolvem, em menos de 15 segundos, uma cor azul
escura no local de inoculação. Burkholderia cepacia e Prova da Oxidase positiva.
Stenotrophomonas maltofilia podem apresentar reação Método da fita reagente
fraca e lenta de até 1 minuto.
Não deve ser usada alça de níquel-cromo porque os produtos de oxidação formados na superfície ao
serem esterilizados na chama, podem produzir reações falso- positivas.
Reagente: Dicloridrato de Tetrametil-p-fenilenodiamina, 1% (reativo de Kovacs); Dicloridrato de

Dimetil-p-fenilenodiamina 1%, (reativo de Gordon e Macleod); Discos e tiras comerciais
(Difco, BBL,etc).
Agar Ferro de Kligler (KIA) e agar Tríplice-Acúcar-Ferro (TSI)
Características pesquisadas
Pesquisa a fermentação de glicose, lactose (no KIA) e sacarose (no TSI), a produção de H2S e a
produção de gás (CO2).
Princípio bioquímico
Esses meios permitem o crescimento da maioria das bactérias. Contém nutrientes, peptídeos,
aminoácidos, um indicador de pH, que é o vermelho de fenol, que vai indicar a produção de ácido
decorrente da fermentação dos carboidratos, além de tiossulfato e citrato férrico para a produção de
H2S e sua detecção. O vermelho de fenol é vermelho em pH alcalino e amarelo em pH ácido. A
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proporção de lactose e sacarose nesses meios é de 10:1 de glicose.

O agar encontra-se em posição inclinada, resultando em duas câmeras de reação. O ápice, a porção
inclinada, aeróbia e a porção inferior denominada de base, relativamente, anaeróbia.
Os tubos são inoculados com auxílio de uma agulha bacteriológica estéril que toca na colônia em
estudo e a transfere para o TSI atravessando a base até cerca de 3-5mm do fundo do tubo. Após a
saída da profundidade do agar, são feitas estrias na superfície inclinada com movimento de zigue-
zague.
Considerando apenas a fermentação dos carboidratos podemos observar as seguintes reações no
TSI/KIA:
a) Bacilos não fermentadores: São incapazes de produzir ácidos a partir da fermentação da glicose,
lactose ou sacarose: O meio fica de um vermelho mais forte devido à descarboxilação oxidativa de
peptídeos e aminoácidos (realizada por enzimas e pelo oxigênio na superfície inclinada) que forma
aminas que alcalinizam o meio e faze mudar a cor do indicador de pH para vermelho. Ex.
Pseudomonas aeruginosa;
b) Bactérias que fermentam apenas a glicose:
Nas primeiras 12 horas de reação, há uma acidificação inicial da profundidade (base) e da superfície
inclinada do meio (ápice) por bactérias que fermentam a glicose, tornando o meio totalmente ácido
(amarelo); Ao se formarem as aminas alcalinas a partir da descarboxilação oxidativa a superfície
inclinada retorna ao pH alcalino (vermelho). O meio fica, então, com a base amarela e o ápice
vermelho. Ex. Shigella flexinerii;
c) Bactérias que fermentam a lactose (e sacarose no TSI), além de glicose:
Como essas bactérias fermentam todos os carboidratos, ocorre a produção de ácido suficiente para
mudar permanentemente a cor da base e do ápice para amarelo mesmo ocorrendo as
descarboxilações no ápice. Ex. E.coli.
Além da fermentação dos carboidratos, a prova pesquisa ainda a produção de H2S que é detectada
pela formação de um precipitado negro. Salmonella spp. e Proteus spp., Edwardsiella tarda e
Citrobacter freundii produzem H2S; A produção de gás é evidenciada pela produção de bolhas e
pelo levantamento ou rachadura do meio. Esta característica nem sempre pode ser observada. A
figura e o quadro abaixo mostram as reações do TSI/KIA para as principais bactérias.
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Reações do TSI/KIA
Meio não Bactéria não Shigella Salmonella E.coli Proteus

Inoculado fermentadora de Salmonella Citrobacter Enterobacter Citrobacter
carboidrato. Providencia Edwardsiella Klebsiella
Ex.Pseudomonas.
Morganella Proteus Providencia
Acinetobacter,
Burkholderia. Serratia Serratia
Yersinia Obs. Se Gas (-) 
E.coli
Serratia
Reações do KIA/TSI incluindo as reações de fermentação, produção de H2S e gás para os principais
gêneros da família Enterobacteriaceae
Leitura Interpretação Identificação
Ápice Alcalino (vermelho)/Base Ausência de fermentação de carboidratos. Bactérias não fermentadoras
Alcalina (vermelha) como Pseudomonas
spp.;,Acinetobacter spp.;
Burkholderia spp.
Ápice alcalino(vermelho)/ Fermentação da glicose Shigella, Salmonella
Base ácida (amarela) Não fermentação da lactose ou sacarose. Providencia, Morganella, Serratia
Ausência de H2S Yersinia
Ápice alcalino (vermelho)/ Glicose fermentada Salmonella,Citrobacter
BaseÁcida (amarela/negra) Não utilização da lactose e sacarose Edwardsiella, Proteus
Presença de H2S
Äpice ácido (amarelo) Fermentação da glicose sem gás Escherichia coli
/Base ácida (amarela) Fermentação da lactose e/ou sacarose Serratia
Ausência de H2S
Ápice ácido (amarelo)/ Fermentação da glicose com gás Citrobacter
Base ácida(amarela/negra) Fermentação da lactose e/ou sacarose Proteus
Produção de H2S
Ápice Ácido (amarelo)/ Fermentação da glicose com gás Escherichia, Klebsiella
Base ácida (amarela) Fermentação da lactose e/ou sacarose. Enteroacter, Providencia
Ausência de H2S Serratia
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Provas do SIM (Sulfeto, Indol e Motilidade)
Características pesquisadas:
Produção de Sulfeto de hidrogênio, Indol e Motilidade.
Princípio Bioquímico
Indol
Algumas bactérias possuem a enzima triptofanase que degrada o

triptofano contido no meio com produção de indol, ácido pirúvico e
amônia (NH3). O indol é detectado por meio do desenvolvimento de
cor vermelha após adição de 5 gotas de uma solução contendo p-
dimetilaminobenzaldeído (reativo de kovacs). Pode ser colocado
também um tampão de algodão embebido no reagente que mudará
de cor em contato com o indol produzido. Ex. Escherichia coli;
Klebsiella oxytoca, Proteus vulgaris, etc..
Produção de sulfeto de Hidrogênio (H2S)
O meio contém uma fonte de enxofre, o tiossulfato de sódio e citrato

férrico. Bactérias que apresentam o sistema enzimático para retirar
enxofre do tiossulfato e transferir para ions H+ produzem H2S. Este,
reage com os sais de ferro formando um precipitado negro
caracterizando prova positiva. Ex. Salmonella spp., Proteus spp.,
Citrobacter freundii, Edwardsiella tarda.
©Ângela Veras
Motilidade
As bactérias movem-se por meio de seus flagelos que estão presentes mais
Móvel Imóvel frequentemente nos bacilos Gram-negativos. Os cocos raramente os contêm.
A bactéria que se movimenta a partir da linha inicial de inoculação deixa o
meio turvo e o local da picada difuso, evidenciando a presença de flagelos e
consequentemente, de motilidade. A bactéria que cresce apenas no local da
inoculação, deixa o meio límpido com a linha de inoculação nítida,
evidenciando a ausência de flagelos. Os meios para prova de motilidade são
semissólidos. Shigella e Klebsiella são tipicamente imóveis. Pseudomonas
aeruginosa sendo uma bactéria aeróbia, cresce formando uma película sobre
©Ângela Veras a superfície do agar.
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O meio é inoculado por meio de uma picada central com uma agulha bacteriológica estéril contendo a
bactéria em estudo.
Prova do Citrato (Citrato de Simmons)
Característica pesquisada:
Pesquisa se a bactéria utiliza o citrato como única fonte de carbono no seu metabolismo.
Princípio
Positiva Negativa
É utilizado o meio Citrato de Simmons que contém citrato de sódio,
fosfato de amônia e azul de bromotimol como indicador de pH.
O meio deve ser isento de qualquer outra fonte de carbono. Bactérias que
utilizam o citrato utilizam também o fosfato de amônia resultando na
formação de hidróxido de amônia que alcaliniza o meio e vira a cor do
indicar de pH para azul. Diferencia bactérias citrato positivas como
Klebsiella spp., Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp.,
Salmonella spp., Providencia spp., de bactérias que não conseguem usar o
citrato como a Escherichia coli. O desenvolvimento de cor azul ou
crescimento de colônias ao longo da estria de inoculação significa prova
positiva.
©Ângela Veras
O meio é inoculado com o auxílio de uma agulha bacteriológica estéril
fazendo-se uma única estria na superfície do agar. O inóculo deve ser escasso para evitar que bactérias
“velhas” do inóculo morram e sirvam de fonte de carbono para as outras, resultando em prova falso-
positiva;
- Incubar a 36 ± 1 ºC por 24-48 horas em estufa.
Prova da Urease
Característica pesquisada
Pesquisa a produção da enzima urease por algumas bactérias, auxiliando no processo de identificação.
Os micro-organismos que produzem urease têm a capacidade de

Positiva Negativa hidrolisar a ureia do meio com liberação de amônia. A amônia reage
para formar carbonato de amônia, aumentando o pH e mudando a cor
do indicador vermelho de fenol para rosa pink.
Prova usada diferenciar bactérias que apresentam a enzima urease como

Proteus spp. (reação rápida em todo o meio) e Klebsiella spp.
(degradação lenta no ápice e gradualmente no restante do meio),
Morganella morganii e Providencia spp., e bacilos Gram negativos não
fermentadores de outras que não apresentam.
Podem ser usados os meios: Ureia de Stuart e Ureia de Christensen.
15
- Com o auxílio de uma agulha, tocar na colônia em estudo e inocular na superfície inclinada do meio
por meio de uma estria em zigue-zague;
- Incubar a 36 ± 1 ºC por 24-48 horas em estufa.
Prova da Fenilalanina Desaminase
Característica pesquisada:
Pesquisa a produção da enzima fenilalanina desaminase.
Positiva Negativa
O aminoácido fenilalanina presente no meio é desaminado pela enzima

formando ácido fenilpirúvico. Este, é evidenciado pela adição de 5 gotas
de cloreto férrico a 10%, resultando em uma coloração verde bandeira na
superfície do meio. Somente as espécies de Proteus, Providencia e
Morganella possuem esta enzima.
O meio é inoculado fazendo-se estrias em zigue-zague com o auxílio de
uma agulha bacteriológica.
©Ângela Veras - Incubar a 36 ± 1 ºC por 24-48 horas em estufa;
- Após incubação, acrescentar 5 gotas de cloreto férrico a 10% e deixar
que este banhe a superfície inclinada. O aparecimento de uma cor verde
na superfície do meio indica prova positiva.
Prova das Descarboxilases
Característica pesquisada
Pesquisa a produção de enzimas descarboxilases dos aminoácidos Arginina, Lisina e Ornitina.
As descarboxilases são capazes de atuar especificamente ©Ângela Veras

sobre a extremidade COOH dos aminoácidos Arginina,
Lisina e Ornitina, formando aminas alcalinas específicas.
A Lisina é descarboxilada em cadaverina, a Ornitina em
putrescina e a arginina, inicialmente desaminada (perda
de NH2) em citrulina, é convertida em ornitina e esta,
descarboxilada em putrescina.
- Os meios contendo os respectivos aminoácidos e um

tubo controle que contém somente o meio-base são
inoculados com o auxílio de uma alça ou agulha.
Adicionar aproximadamente 10 gotas de óleo mineral
para que a reação ocorra na ausência de oxigênio.
– Incubar a 36 ± 1 ºC por 24 a 48 horas.
16
Primeiramente ocorre a fermentação da pequena quantidade de glicose presente no meio com

produção de ácido e viragem do indicador de pH púrpura de bromocresol para amarelo. Se a bactéria
produzir a enzima, o aminoácido será descarboxilado, formando-se amina, que sendo alcalina, mudará
a cor do indicador de pH para púrpura novamente. Se ela não produzir a enzima, não haverá
descarboxilação e o tubo permanecerá amarelo, assim como o controle, que não tem aminoácido para
ser descarboxilado.
Prova da Bacitracina e Sulfametoxazol-trimetoprim (SXT ou SUT)
Estas provas devem ser utilizadas quando houver isolamento de Streptococcus β-hemolíticos. A prova
da bacitracina identifica presuntivamente Streptococcus beta hemolítico do grupo A (S.pyogenes), já
que 99% destes são sensíveis à bacitracina (disco com 0,04 U). Entretanto, como 1% desses
Streptococcus mostram-se resistentes, e 5% dos Streptococcus do grupo B e 10% dos do grupo C e
G são também sensíveis, esta prova é considerada apenas de caráter presuntivo para S.pyogenes.
Para melhorar o carácter presuntivo da prova da bacitracina para o S.pyogenes, pode ser usado o
disco de sulfametoxazol-trimetoprim (SUT/SXT), já que:
Os Streptococcus dos grupos A e B são, geralmente, resistentes e os grupos C e G são, geralmente,
sensíveis a esse antimicrobiano.
Esta prova também pode ser usada para orientar a prova sorológica na confirmação do grupo de
Lancefield.
- Semear meia placa de agar sangue Mueller-Hinton com o Streptococcus β-hemolítico da mesma forma
que para o antibiograma. Repetir o procedimento na outra metade do meio;
- Em um dos lados aplicar com uma pinça estéril um disco de bacitracina e no outro, um de SXT na
superfície semeada do agar pressionando-os suavemente para garantir o contato dos discos com o
meio;
- Incubar em estufa à 35º C ±1 18-24 horas SEM atm de 5-7% de CO2.
©Ângela Veras
Semeadura e aplicação dos discos. Resultado da prova: Bacitracina sensível; SXT

resistente.
Presença de um halo de qualquer tamanho ao redor do disco evidencia sensibilidade à bacitracina;
Bacitracina sensível e SXT resistente, identifica Streptococcus do grupo A com maior probabilidade de
certeza do que quando se usa apenas o disco de bacitracina.
A prova mais específica para Streptococcus β-hemolítico do grupo A é o teste de PYR que determina a
17
atividade da enzima pyrrolidonil arilamidase produzida por S. pyogenes e Enterococcus spp., mas não
pelos demais Streptococcus β-hemolíticos.
Prova da Optoquina
É utilizada quando ocorre o isolamento de Streptococcus α-hemolítico (Ver fluxograma para

identificação de Streptococcus spp.). A optoquina (etil-hidrocupreína hidroclorídrica) é um antimicrobriano
usado apenas para provas diagnósticas. Sofre fácil difusão no meio provocando a lise das células
produzindo uma área de inibição do crescimento em torno do disco.
Semear meia placa de agar sangue Mueller-Hinton

com o Streptococcus α-hemolítico suspeito da mesma
forma que para o antibiograma;
- Assepticamente, aplicar o disco no meio,
pressionando-o gentilmente para um firme contato
com o agar;
- Incubar à 35ºC ± 1 e 5 -7% de CO2 por 18 a 24 horas.
©Ângela Veras
Prova da Optoquina (Sensível).
Presença de halo ≥ 14 mm indica sensibilidade e identifica, presuntivamente, Streptococcus

pneumoniae.
Confirmar a identificação com a prova da bile solubilidade, já que S.pneumoniae pode apresentar halo
menor do que 14mm, assim como os alfa hemolíticos do grupo viridans.
Prova da bile solubilidade
Os sais biliares, especialmente, o desoxicolato de sódio, têm a capacidade de

ativar uma autolisina produzida por Streptococcus pneumoniae, quando
adicionados a culturas dessa bactéria. Pode ser realizado em meio sólido ou
líquido e diferencia o pneumococo de outros Streptococcus α-hemolítico.
A partir de uma cultura em fase logarítmica de crescimento (cultura recente),

preparar uma suspensão bacteriana homogênea com concentração equivalente
à escala 1,0 de MacFarland em um tubo de ensaio contendo 1,0 mL de salina.
Este tubo será o teste;
-Transferir 0,5 ml da suspensão bacteriana para outro tubo. Este será o
controle;
- Ao tubo teste adicionar 0,5 ml de solução de desoxicolato de sódio;
- Ao tubo controle adicionar 0,5 ml de solução fisiológica;
- Homogeneizar os tubos delicadamente e incubar em estufa a 36 ºC ± 1 por até
18
por 2 horas;
- Examinar a lise bacteriana por meio da redução da turvação no tubo teste após 1 a 2 horas de
incubação, comparando o tubo teste com o tubo controle.
- Limpidez ou turvação menor no tubo teste, quando comparado com o controle, o teste é positivo
para Streptococcus pneumoniae;
- Se a turvação persistir em ambos os tubos, o teste é negativo e identifica Streptococcus do grupo
viridans.
©Ângela Veras
Prova da Bile Esculina
Usada para caracterizar Streptococcus do grupo D e Enterococcus spp., Negativa Positiva

separando-os de outros Streptococcus.
Estas bactérias são capazes de hidrolisar a esculina na presença de bile
formando esculetina que reage com sais de ferro formando um composto
marrom-escuro ou negro.
- Inocular a bactéria a ser testada fazendo estrias em zigue-zague na superfície

do agar com o auxílio de uma agulha bacteriológica;
- Incubar a 35 ± 1 ºC de 24 a 72 horas.
- Enegrecimento do meio evidencia prova positiva. Meio âmbar original, prova
negativa. ©Ângela Veras
Prova do Crescimento em NaCl a 6,5% (Caldo Hipercloretado)
Prova usada para diferenciar espécies de Enterococcus de Streptococcus do grupo D.
Positiva Negativa
Enterococcus spp. crescem produzindo coloração amarela no meio
devido à fermentação do carboidrato, produção de ácido e viragem do
indicador de pH púrpura de bromocresol. Streptococcus bovis
(Streptpcoccus do grupo D) não cresce e o meio permanece violeta. A
prova da PYR substitui a prova da bile esculina e a do NaCl a 6,5% na
identificação dos Enterococcus spp.
- Com uma alça ou agulha bacteriológica, transferir algumas colônias da

bactéria em estudo para o tubo da prova que contém carboidrato,
19
NaCl a 6,5% e o indicador de pH púrpura de bromocresol;

- Incubar o tubo a 36°C ± 1 de 24 a 72 horas.
- A prova é considerada positiva se observado crescimento bacteriano, evidenciado pela turvação do meio,
com ou sem viragem do indicador de pH para amarelo. Ausência de crescimento e o meio na cor púrpura
original, a prova é considerada negativa.
Prova da Sensibilidade à Novobiocina
Princípio
Essa prova é usada para diferenciar cepas de Staphylococcus saprophyticcus, ©Ângela Veras
importante causa de infecção das vias urinárias, das demais cepas de
Staphylococcus coagulase negativa (SCN) de importância clínica.
- Semear uma suspensão da bactéria suspeita como no antibiograma;

- Assepticamente, aplicar o disco de novobiocina 5µg/ml no meio,
pressionando-o gentilmente para um firme contato com o agar;
- Incubar à 35ºC± 1 por 18 a 24 horas.
- A resistência à novobiocina é evidenciada pela ausência de halo de inibição

ou halo ≤ 15 mm, identificando Staphylococcus saprophyticus;
Prova de CAMP
Princípio
É uma prova utilizada para identificação de Streptococcus β-
Streptococcus agalactiae
hemolítico do grupo B (SβGB). S.aureus
CAMP é um acrônimo dos autores do teste (Christie,
Atkinson, Munch, Peterson). A prova é baseada na capacidade
única que têm os SβGB de produzir o fator CAMP.
O fator CAMP reage com a área hemolisada pelo S.aureus Seta
intensificando sua atividade hemolítica, formando uma seta;
O mesmo não acontece com o S.pyogenes, por que ele não
apresenta o fator CAMP.
©Ângela Veras
- Em uma placa de agar sangue de carneiro fazer uma estria central com uma cepa de Staphylococcus
aureus β-hemolítico (P.ex. ATCC 25923);
- Perpendicularmente, fazendo um ângulo reto, aplicar uma estria com o Streptococcus suspeito
evitando que as estrias se toquem;
- O Streptococcus pyogenes pode ser usado como controle negativo da prova.
20
A Presença de uma seta no encontro entre a hemólise do Streptococcus teste e a do S.aureus significa CAMP
positivo e identifica S.agalactiae.
Prova do Satelitismo
Princípio
Haemophilus influenzae requer os fatores X (hemina) e V (NAD) para seu crescimento. Diferente de
uutras espécies de Haemophilus que requerem um ou outro fator. As espécies que requerem NAD
somente crescem em agar sangue se forem hemolíticas e puderem liberar o NAD das hemácias.
Entretanto, crescem bem em agar sangue em volta das colônias de S.aureus β-hemolítico, os quais, são
capazes de liberar o NAD e com a hemólise, liberam também a Hemina. O NAD se difunde no meio em
volta do crescimento do S.aureus e estimula o crescimento de Haemophilus na zona adjacente. Esse
comportamento é conhecido como satelitismo e identifica Haemophilus influenzae.
- Semear por estrias adjacentes a cepa a ser avaliada por toda a superfície do agar sangue;
- Realizar uma ou duas estrias (formando uma cruz) com a cepa de S.aureus (ATCC 25923);
- Incubar a 35 ± 1 ºC por 24 a 48 horas em atm de 5-75 de CO2;
Colônias satélites de H.influenzae
Estria de S.aureus
- Examinar a presença de colônias satélites
pequenas e transparentes ao redor da estria de
S.aureus. As colônias são menores do que as
que crescem no agar chocolate por que o agar
sangue contem inibidores para o crescimento
de H.influenzae.
- H.ducrey não requer do fator V (NAD) e não
cresce em agar sangue, nem mesmo em volta
da estria ou colônias de S.aureus.
- Haemophilus haemolyticus e H.
parahaemolyticus podem crescer sem S. aureus
e não demonstram o fenômeno do satelitismo
ainda que requeiram o fator V, por que ambos
são hemolíticos e podem liberar NAD no meio. ©Ângela Veras
21
Algoritmo para Identificação de

Streptococcus spp. E Enterococcus spp.
Cocos Gram-positivos
Catalase negativa
α-hemolíticos β-hemolíticos γ-hemolíticos
Pode ser feita prova sorológica
Bile esculina
Bacitracina 0,04U
Optoquina R Optoquina S
(≤ 14) (≥ 14) ou R (-) (+)
Bile solubilidade - Bile solubilidade +
(R) (S)*
CAMP Streptococcus grupo D
Ou Enterococcus spp.
Bile esculina S.pneumoniae
Bile esculina - Bile esculina + CAMP - CAMP + (-) (+)
grupo D grupo A grupo B grupo viridans grupo B

Entro
CAMP - grupo A
(-) (+) CAMP +
Hipurato - Hipurato+-
Streptococcus NaCl 6,5%
NaCl 6,5%
grupo viridans
grupo não
grupo B (-) (+)
A, B ou D (-) (+)
NaCl 6,5%
(-) (+) Streptococcus Enterococcus sp.

Streptococcus Enterococcus sp.
spp. grupo D
grupo D
Streptococcus Enterococcus sp.

grupo D
Obs. Pode ser acrescentado o disco de Sulfametoxazol-trimetoprim (SXT) para reduzir o caráter presuntivo da prova da bacitracina
e orientar a prova sorológica.
- Bacitracina: 99% dos β-hemolíticos do grupo A, 5% dos do grupo B e 10% dos Streptococcus dos grupos C e G são sensíveis;
- SXT: Os Streptococcus dos grupos A e B geralmente são resistentes e os dos grupos C e G são geralmente sensíveis.
Fonte: Modificado do Manual de Procedimentos básicos em Microbiologia para o

controle de Infecção hospitalar - Ministério da Saúde.
22
Algoritmo para Identificação de

Staphylococcus spp.
Cocos Gram-positivos
Prova da Negativa Streptococcus spp.

Catalase Enterococcus spp.
Positiva
Cocos Gram-positivos Cocos Gram-positivos Prova da Positiva

Com predomínio Com predomínio Staphylococcus aureus
Coagulase
de tétrades e sarcinas de cachos
Testar cefoxitina no TSA

Negativa para detecção de Cepas
MRSA (ou oxacilina,
Prova da SCN dependendo do
Oxidase Staphylococcus
SE AMOSTRA DE URINA coagulase+
Positiva
Sensibilidade Resistente
à Staphylococcus
Resistência novobiocina saprophyticus
à
furazolidona
Sensível
Resistente
SCN
Micrococcus
Fonte: Boas Práticas em Microbiologia Clínica

ANVISA.
23
Algoritmo para Identificação inicial de

Bacilos Gram-negativos
Bacilos Gram-
Negativos
Fermentador de Glicose Não-Fermentador
Oxidase (-) Oxidase (+) Oxidase Oxidase (+)

(-)
Aeromonas Exemplos: Exemplos:

Enterobacteriaceae Plesiomonas Pseudomonas spp.
Acinetobacter spp.;
Realizar TSI, SIM, Vibrio Burkholderia cepacia Burkholderia spp.
Citrato,Fenilalaninadesaminase, (reação fraca); Alcaligenes spp.
Urease., Descarboxilases., VM e Stenotrophomonas
VP maltophilia
Fonte: Modifica deProcedimentos Básicos em

Microbiologia Clínica Oplustil. 2010.
24
Algoritmo para Identificação de Neisseria spp.
Colônias suspeitas em agar Se cultura não pura, reisolar

uma colônia suspeita em
Chocolate agar chocolate VX
DGN no Gram
Catalase (+) e Oxidase (+)
Preparar suspensão em salina

de acordo com a escala 4,0 de
MacFarland
Se liquor:Sorologia
Sorologia com Antissoros
com Antissoros Provas bioquímicas:
A, B, C,
A, Y
B e/ou
e C W135 Açúcares/CTA
N. meningitides N. meningitidis: Oxida Glicose e Maltose

A, B, C, Y ou W135 N.gonorrhoeae oxida somente a glicose
25
Algoritmo Identificação de Haemophilus influenzae
Colônias suspeitas em agar Se cultura não pura, reisolar

uma colônia suspeita em
Chocolate agar chocolate
Cocobacilos GN com/sem
Pleomorfismo no Gram
Prova do satelitismo Sorologia com antissoro

Anti-H
Crescimento de colônias
Pequenas e transparentes em torno da
hemólise de S.aureus
H.influenzae H.influenzae
26
Tabela de Diferenciação de Enterobacteriacea pelas provas

bioquímicas de triagem em Coprocultura
Bactéria Lac H2 S Ureia Fenil. Motil. Indol Citrato Gli com

Gás
E.coli + - - - V + - V
EPEC V - - - V + - V
EIEC - Pouco ou
a maioria - - - - + -
nenhum
EHEC - Pouco ou
a maioria - - - - + -
nenhum
Shigella spp. - - - - - V - -*
Shigella sonnei - - - - - - - -*
Salmonella spp. - + - - + - + +
Salmonella typhi* - +w - - + - - -
Pouco ou
nenhum
Edwardsiella tarda - + - - + + - +
Citrobacter freundii - V - - + - + +
C. diversus V - - - + + + +
Enterobacter aerogenes + - - - + - + +
Serratia marcescens - - - - + - + V
Proteus mirabilis - + + + + - V +
P.vulgaris - + + + + + V V
Providencia rettgeri - - + + + + + V
P.stuartii - - + + + + + -
Morganella morganii - - + + + + - V
Yersinia enterocolitica - - + - - V - -
Y.pseudotuberculosis - - + - - - - -
Lac=Lactose; Fenil.=Fenilalanina desaminase;
+ = 90% ou mais de amostras positiva.
- = 90% ou mais de amostras negativas
V = Varável.
*W = Reação fraca.
Obs. 1. A maioria das cepas de .S.sonnei é fermentadora tardia de lactose.
2. Alguns sorotipos de S.flexineri e S. boydii produzem gás de glicose;
3. A maioria das cepas de S.sonnei não produz indol (outras do gênero podem produzir);
4. Atenção especial às colônias que produzem pouco ou nenhum H S. Pode tratar-se de S.typhi. Algumas sorovariantes de Salmonella não descarboxilam a Lisina (S.
2
paratyphi A e algumas cepas de S. typhimurium);
27
Farmácia
Grupos de Problematização
28
FARMÁCIA
Avaliação
29
AVALIAÇÃO
Seguindo os requisitos da UNIFOR (CF. Resolução R18 de 01/07/2005), um mínimo de
8,0 (oito) na média aritmética das Notas Parciais constituirá critério para a aprovação. De
igual forma, será exigida a frequência mínima regulamentar de 75% (setenta e cinco por
cento) requerida nas atividades dos demais cursos de graduação.
O aluno que tiver obtido média aritmética das duas Notas Parciais inferior a 8,0 (oito
vírgula zero) e igual ou superior a 4,0 (quatro vírgula zero), e obtido o mínimo de 75%
(setenta e cinco por cento) de frequência às atividades acadêmicas deverá se submeter à
Avaliação Final (AF), realizada no final do semestre, com conteúdo cumulativo.
A nota da Prova Final não poderá ser inferior a 4,0 (quatro vírgula zero). Ficará
aprovado no módulo o aluno que obtiver Média Global igual ou superior a 5,0 (cinco vírgula
zero), calculada entre a média das duas Notas Parciais e a Nota Final.
Assim, será considerado aprovado para fins de promoção no módulo Diagnóstico
Laboratorial Clínico I, o estudante que apresentar evidências de alcance dos objetivos de
aprendizagem (nota final e frequência). As notas parciais têm valor máximo de 10 pontos.
30
Exemplo de TOSCE
FUNDAÇÃO EDSON QUEIROZ TO S C E
UNIVERSIDADE DE FORTALEZA (TEAM OBJECTIVE STRUCTURED CLINICAL
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE EXAMINATION)
C URSO DE F ARMÁCIA EXAME CLÍNICO OBJETIVO ESTRUTURADO POR
ESTAÇÕES
ESTAÇÃO 02 Urinocultura
TÍTULO
Prova Prática de Diagnóstico Laboratorial Clínico II (DLC II)
Objetivo Geral:
Avaliar a execução dos procedimentos necessários ao diagnóstico microbiológico das infecções

do Trato Urinário (ITUs).
Objetivos Específicos
Avaliar a execução dos procedimentos necessários ao cultivo, isolamento e identificação de

Micro-organismos para o diagnóstico microbiológico das ITUs;
Avaliar a liberação do laudo da cultura;
Verificar a observância às normas de biossegurança e técnicas assépticas para os trabalhos

microbiológicos.
Cenário, materiais e recursos humanos necessários para essa estação:
Material
Amostras biológica: Urina de jato médio.
Bateria para coloração de Gram;
Provas bioquímicas para identificação de cada possível isolado;
Meios de cultura apropriados para cada amostra biológica dispostos na bancada;
Bico de Bunsen;
Fósforo;
Lâminas ponta fosca (para o Gram) e sem ponta fosca (p/provas);
Solução salina estéril em tubo p/ TSA, coagulase livre, Bile solubilidade;
Tubos tipo hemólise (coagulase livre, Bile solubilidade);
Cenário
Laboratório de Bacteriologia e proposta para cada amostra
Recursos Humanos
Técnico e monitor
31
FUNDAÇÃO EDSON QUEIROZ OSCE
UNIVERSIDADE DE FORTALEZA (OBJECTIVE STRUCTURED CLINICAL EXAMINATION)
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE EXAME CLÍNICO OBJETIVO ESTRUTURADO POR ESTAÇÕES
C URSO DE F ARMÁCIA
TÍTULO
Check list: da parte prática

Critérios SIM NÃO Pont.
Usou os EPIs completos?
Selecionou os meios corretamente?
Semeou corretamente?
Fez o esfregaço da gota de urina para o Gram?
Incubou as placas corretamente?
Fez a avalição da cultura (pureza ( ), aspecto do meio( ), característica das

colônias ( )?
Fez o cálculo do número de colônias?
Selecionou colônias isoladas para identificação?
Fez o esfregaço e coloração de Gram corretamente?
Conseguiu focalizar a lâmina?
Identificou as características microscópicas do isolado?
Observou a correlação entre o Gram da amostra e o da Cultura?
Escolheu a prova bioquímica inicial corretamente? Executou corretamente?
Selecionou as provas bioquímicas complementares corretamente?
Semeou corretamente as provas bioquímicas?
Incubou corretamente?
Fez a leitura e interpretação do resultado das pb. Corretamente e identificou o

patógeno isolado na cultura?
Utilizou as técnicas assépticas para as manipulações microbiológicas?
Fez a limpeza do microscópio e o fez corretamente?
Fez a desinfecção da bancada?
32
FUNDAÇÃO EDSON QUEIROZ TO S C E
UNIVERSIDADE DE FORTALEZA (TEAM OBJECTIVE STRUCTURED CLINICAL
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE EXAMINATION)
C URSO DE F ARMÁCIA EXAME CLÍNICO OBJETIVO ESTRUTURADO EM
GRUPO
TÍTULO
INSTRUÇÕES DA TAREFA (PARA SER AFIXADA NA BANCADA)

Estação 2 - Cultura de Urina
Objetivo:
Executar os procedimentos necessários ao cultivo, isolamento e identificação de micro-

organismos para o diagnóstico microbiológico das ITUs.
1) Você está recebendo uma amostra de urina colhida hoje e enviada ao laboratório sob refrigeração
para realização de uma cultura. A amostra é de uma paciente de 35 anos com sintomas de
cistite.
2)
3) Atividade: Realize todas as etapas dos procedimentos necessários à elucidação do agente
causador dessa cistite e responda as questões que seguem. As etapas devem ser divididas entre
os componentes da equipe que depois devem entrar em um consenso com relação às respostas:
4)
1) Parte escrita:
Valor da parte escrita: 3,0 pontos.

Tempo: Você terá 1,5 h para realizar as atividades da estação.
33
Visão dos participantes sobre o TOSCE
Concordo Concordo Não concordo

totalmente parcialmente
O desempenho do grupo no exame foi ( ) ( ) ( )
satisfatório
O exame mostrou ser uma ferramenta ( ) ( ) ( )
satisfatória para o desenvolvimento e
avaliação de competência no diagnóstico
microbiológico das doenças infecciosas
O tempo para a realização do exame foi ( ) ( ) ( )
adequado
O exame reforçou as habilidades de ( ) ( ) ( )
comunicação entre os membros da equipe
Cite uma vantagem do TOSCE:
Cite uma desvantagem do TOSCE:
34

Anexos Provas Bioquímicas

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Anexos Provas Bioquímicas

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Microbiologia Clínica – R592 Profa. Ângela Veras Unifor - 2021.

A manipulação de micro-organismos no laboratório de microbiologia resulta em perigo potencial e

Protocolo de biossegurança para o retorno gradual das

Técnica de Preparo do Esfregaço para Coloração

1. Esfregaços a partir de crescimento bacteriano em cultura

 Colocar uma gota pequena de salina estéril.

 Flambar a alça bacteriológica, esperar esfriar, coletar um pouco do crescimento bacteriano

2. Esfregaço de amostras colhidas em “swab”

 Rolar delicadamente o swab sobre a superfície da lâmina.

pode alterar as estruturas e, consequentemente, o padrão de coloração).

3. Esfregaços de aspirado, exsudatos e fezes

 Amostras recebidas em seringa devem ser transferidas para um frasco estéril,

homogeneizadas e retirada uma pequena porção para realização do esfregaço fino

 Amostras de exsudatos selecionar a parte mais purulenta para realizar o esfregaço. Na

5. Esfregaço de meio de cultura líquido

6. Urina de jato médio

 Centrifugar a urina a 2.000/10min. Desprezar o sobrenadante e dispensar uma gota do

sedimento em lâmina previamente limpa e seca sem fazer movimentos.

8. Biópsia ou fragmento de tecido

 Colocar o material em placa de Petri estéril fragmentando-o com o auxílio de um bisturi;

 Fazer imprints na lâmina e deixar secar.

Mecanismo da coloração de Gram

Gram negativas – parede com uma fina

Gram positivas – parede mais espessa,

Demonstração esquemática do Método

Técnica para a Coloração de Gram

1. Preparar um esfregaço fino do material em estudo em salina estéril e secá-lo ao ar.

4. Após 1 minuto, lavar com água destilada.

5. Cobrir o esfregaço com lugol/ 1min.

7. Lavar com água destilada.

9. Lavar com água destilada.

Provas Bioquímicas para Identificação Bacteriana

A identificação de bactérias requer a observação de várias características, entre elas,

- Com uma agulha ou alça bacteriológica, transferir 2-3

Prova em tubo (coagulase livre)

A presença de um coágulo gelatinoso em qualquer grau indica

Espécie de Coagulase ligada Coagulase livre

A prova da oxidase utiliza um reativo corante, o dicloridrato de p-fenilenodiamina, que é incolor no

- Pode ser realizada usando tiras de papel impregnadas com

Reagente: Dicloridrato de Tetrametil-p-fenilenodiamina, 1% (reativo de Kovacs); Dicloridrato de

Agar Ferro de Kligler (KIA) e agar Tríplice-Acúcar-Ferro (TSI)

proporção de lactose e sacarose nesses meios é de 10:1 de glicose.

b) Bactérias que fermentam apenas a glicose:

c) Bactérias que fermentam a lactose (e sacarose no TSI), além de glicose:

Meio não Bactéria não Shigella Salmonella E.coli Proteus

Provas do SIM (Sulfeto, Indol e Motilidade)

Algumas bactérias possuem a enzima triptofanase que degrada o

Produção de sulfeto de Hidrogênio (H2S)

O meio contém uma fonte de enxofre, o tiossulfato de sódio e citrato

Prova do Citrato (Citrato de Simmons)

Os micro-organismos que produzem urease têm a capacidade de

Prova usada diferenciar bactérias que apresentam a enzima urease como

Prova da Fenilalanina Desaminase

O aminoácido fenilalanina presente no meio é desaminado pela enzima

Prova das Descarboxilases

Pesquisa a produção de enzimas descarboxilases dos aminoácidos Arginina, Lisina e Ornitina.

As descarboxilases são capazes de atuar especificamente ©Ângela Veras

- Os meios contendo os respectivos aminoácidos e um

Primeiramente ocorre a fermentação da pequena quantidade de glicose presente no meio com

Prova da Bacitracina e Sulfametoxazol-trimetoprim (SXT ou SUT)

Semeadura e aplicação dos discos. Resultado da prova: Bacitracina sensível; SXT

É utilizada quando ocorre o isolamento de Streptococcus α-hemolítico (Ver fluxograma para

Semear meia placa de agar sangue Mueller-Hinton