Técnicas de coleta,

cultivo e semeadura
de amostras clínicas
Profª Ana Carolina Santana de Oliveira
 Coleta de amostras biológicas
Os profissionais encarregados pela coleta
devem estar aptos a proceder à coleta e
enviar as amostras ao laboratório com a
segurança de que o sistema de transporte
utilizado seja capaz de manter a
viabilidade dos microrganismos na
amostra. Já no laboratório, devem ser
capazes de recuperar as amostras com a
segurança de que os componentes
representativos da amostra foram
mantidos durante o transporte.
 Coleta de amostras biológicas
O material colhido deve ser representativo do processo infeccioso investigado, devendo
ser eleito o melhor sítio da lesão, evitando contaminação com as áreas adjacentes. A
coleta e o transporte inadequados podem ocasionar falhas no isolamento do agente
etiológico e favorecer o desenvolvimento da microbiota contaminante. Portanto,
procedimentos adequados de coleta devem ser adotados para evitar o isolamento de um
“falso” agente etiológico, resultando numa orientação terapêutica inadequada.
 Procedimentos de coleta
Secreção de orofaringe
1.Solicitar ao paciente que abra bem a boca.

2.Usando abaixador de língua e swab estéril, fazer esfregaços sobre as

amígdalas e faringe posterior, evitando tocar na língua e na mucosa
bucal.

3.Procurar o material nas áreas com hiperemia, próximas aos pontos

de supuração ou remover o pus ou a placa, colhendo o material
abaixo da mucosa.

4.Coletar a amostra exatamente na área inflamada, evitando outros

sítios.

5.Colher dois swabs.

6.Enviar imediatamente ao laboratório para evitar o ressecamento do

material.
 Procedimentos de coleta
Secreção de ouvido
1) Conduto auditivo externo e médio (até a membrana timpânica).

Remover secreção superficial com um swab umedecido em salina

estéril e obter material com outro swab fazendo rotação no canal e em
seguida inserir no meio de transporte (Stuart).

2) Conduto auditivo interno

a) membrana timpânica rompida: o médico deve proceder como

no item anterior e com espéculo ou cone de otoscópio coletar
material com swab e em seguida inserir no meio de transporte.
Com outro swab, fazer esfregaço para coloração Gram.

b) membrana íntegra: usar seringa para puncionar a membrana ou

sistema apropriado para aspiração e coletor, que deverão ser
encaminhados imediatamente ao laboratório para
processamento ou introduzir em meio de transporte para
conservação e fazer lâmina para bacterioscopia.
 Procedimentos de coleta
Coleta de hemoculturas
• Para diagnóstico de infecção sistêmica a coleta de hemocultura deve
ser realizada preferencialmente por punção venosa periférica.
• A técnica de coleta de sangue através de cateteres deve ser utilizada
somente para o diagnóstico de infecções relacionadas ao dispositivo e
deverá sempre ser acompanhada de uma amostra de sangue periférico.
• Os métodos automatizados costumam revelar as amostras positivas
em 70 a 80% dos casos nas primeiras 48 horas.
• Punções arteriais não trazem benefícios na recuperação dos micro-
organismos.
• Não se recomenda a troca de agulhas entre a coleta e a distribuição do
sangue nos frascos específicos.
 Procedimentos de coleta
Coleta de fezes
Devem ser coletadas no início ou fase aguda da doença, quando os
patógenos estão usualmente presentes em maior número e,
preferencialmente, antes da antibioticoterapia.
• Coletar as fezes e colocar em um frasco contendo o meio para
transporte (Cary-Blair ou salina glicerinada tamponada), fornecido
pelo laboratório, em quantidade equivalente a uma colher de
sobremesa. Preferir sempre as porções mucosas e sanguinolentas.
• Fechar bem o frasco e agitar o material.
• Se a amostra não for entregue no laboratório em uma hora,
conservar em geladeira a 4ºC, no máximo por um período de 12
horas. Marcar o horário da coleta.
 E depois da coleta?
Procedimentos de semeadura
 01
Zona de esterilidade

As manipulações devem ser feitas dentro de uma

capela microbiológica de fluxo laminar.
Na ausência dela, manipular por trás da chama do
bico de gás, de forma a garantir o estabelecimento
de uma zona de esterilidade.
Nesse local os tubos ou recipientes com meios de
cultura estéreis e o material biológico a ser
inoculado, deverão ser abertos ou manipulados.
30 cm
 Técnica de transferência
asséptica
Técnica de transferência de suspensão bacteriana
para meio de cultura estéril.

Impedir a contaminação da cultura com bactérias

do ambiente.

Manipular o tubo e/ou placas em ambiente estéril

próximo ao bico de Bunsen.
 Técnica de transferência
asséptica
(a) Flambar a alça no bico de
Bunsen.
Técnica de transferência de suspensão
(b) Destampar bacteriana
o tubo.
para meio de cultura estéril.
(c) Flambar a boca do tubo no
bico
Impedir a contaminação de Bunsen.
da cultura com bactérias
do ambiente.
(d) Mergulhar a alça fria no
tubo.
Manipular o tubo e/ou placas em ambiente estéril
(e)Bunsen.
próximo ao bico de Flambar a boca do tubo no
bico de Bunsen.
(f) Tampar o tubo.
 Técnica de inoculação em meio
líquido

Mergulhe a alça esterilizada na cultura bacteriana.

Mergulhe a alça carregada de bactérias no tubo com

o meio de cultivo e agite a alça.

Suspensão Meio de
bacteriana cultivo
Técnica de inoculação em meio
semi-sólido

Mergulhe a alça esterilizada na cultura bacteriana.

Mergulhe a agulha carregada de bactérias no tubo

com o meio de cultivo de maneira a fazer uma única
linha de inoculação.
Técnica de inoculação em meio
semi-sólido
 Técnicas de semeadura em meio sólido em placa

01 02 03
Técnica de esgotamento Técnica de esteira Técnica de espalhamento
em superfície
 Técnicas de esgotamento
Utilizada para obtenção de
culturas puras em meio sólido.

Ao final da semeadura, espera-se

conseguir colônias isoladas.
Técnicas de esgotamento

1. Fazer estrias em zigue-zague em

1/3 da placa.
2. Girar a placa e fazer estrias
novamente, tocando de 2-3 vezes
as estrias anteriores.
3. Girar a placa e fazer estrias
novamente, tocando de 2-3 vezes
as estrias anteriores.
4. Girar a placa e fazer estrias
novamente, tocando de 2-3 vezes
as estrias anteriores, puxando o
inóculo para o centro da placa.
Técnicas de esgotamento
 Técnica de esteira
Ideal para semear e contar colônias de amostras de urina, líquor, lavado broncoalveolar.

Também conhecido como técnica de espalhamento

É uma técnica quantitativa.

 Técnica de esteira

(A) Com a alça fazer uma estria central na placa.

(B) Com movimentos de zigue-zague, espalhar o conteúdo da estria central por toda a placa.
(C) Girar a placa e repetir esse movimento
Técnica de esteira
Técnica de esteira
 Como contar o número de colônias?
Calcule o número de bactérias (UFC) por mililitro ou grama de amostra, dividindo o
número de colônias pelo fator de diluição.

O número de colônias por ml relatado deve refletir a precisão do método e não deve
incluir mais de dois algarismos significativos.

O UFC/ ml pode ser calculado usando a fórmula:

UFC/ ml = (nº de colônias x fator de diluição) / volume da placa de cultura

Por exemplo, suponha que a placa rendeu uma contagem de 130 colônias. Então, o
número de bactérias em 1 µl da amostra original pode ser calculado da seguinte forma:

130 bactérias 1 µl
X = 130.000 UFC/mL
X bactérias 1.000 µl
 Técnica de espalhamento em superfície

No método do espalhamento em superfície, o

inóculo, geralmente de 0,1 mℓ, é espalhado
uniformemente na superfície do meio já
solidificado, com o auxílio da alça de
Drigalsky, de modo a separar ao máximo as
células microbianas presentes. Neste caso só
crescerão colônias na superfície do meio
sólido. A superfície do meio de cultura não
deve estar muito úmida, para que o inóculo
seja absorvido e as células não se desloquem.
Técnica de espalhamento em superfície
 @mundomicro_

Vídeo Técnica
Asséptica
Acesse:
Cocos Gram positivos

Bacilos Gram
negativos
+ -
 + -

TSI não inoculado. 1– Salmonella; 2– Shigella; 3– Klebsiella sp. (E. coli

apresenta comportamento semelhante) e 4– Pseudomonas
Quadro 01: Leitura do tubo de TSI.
+ -
- +
- +
Por exemplo:
• Indol negativo
• H2S negativo
• Fenil negativo
• Motil negativo
• Citrato positivo
• Ureia positivo
 Antibiograma
Profª Ana Carolina Santana de Oliveira
Antibiograma.......................................
Antibiograma..................................

A determinação da suscetibilidade aos antimicrobianos (TSA ou

antibiograma) é uma das principais tarefas do laboratório de
Microbiologia Clínica.

Sob o ponto de vista do clínico, os resultados

do antibiograma são considerados muitas
vezes mais importantes do que a própria
identificação do microrganismo envolvido no
processo infeccioso.
 Antibiograma..................................

O antibiograma liberado
Detectar possível
pode fornecer dados
resistência ao
para ajudar o clínico a
medicamento em
decidir as drogas de
patógenos comuns e
escolha ou, ainda, as
assegurar a
doses dos agentes
suscetibilidade a drogas
antimicrobianos
de escolha para infecções
adequadas ao
específicas.
tratamento da infecção.
Indicações para a Realização de Testes de Sensibilidade

O laboratório de Microbiologia Clínica deve realizar o antibiograma somente

para microrganismos patogênicos e que sejam contemplados pelos comitês
de padronização (CLSI, EUCAST, BrCAST). O TSA não deve ser executado
para microrganismos integrantes da microbiota normal humana (organismos
colonizadores) e para microrganismos cuja sensibilidade aos antimicrobianos
seja previsível.
Indicações para a Realização de Testes de Sensibilidade

Os testes de sensibilidade são raramente necessários quando a infecção se

deve a um microrganismo reconhecidamente sensível a uma droga muito
eficaz (ex., isolados de Streptococcus pyogenes permanecem sensíveis à
penicilina).
Seleção do Agente Antimicrobiano
para Testes e Relatórios Rotineiros
A composição do painel de antibióticos a serem testados não é uma decisão
exclusiva do laboratório. Embora os comitês padronizadores publiquem uma lista
com os antimicrobianos a serem testados diante dos grupos de microrganismos, é
imprescindível que a adequação para cada laboratório seja um consenso entre
microbiologistas, corpo clínico, farmácia, comitê terapêutico e comissão de controle de
infecção hospitalar.
Antibiograma....................................

Os métodos de análise disponíveis incluem: diluição em caldo,

diluição em ágar, difusão em ágar (disco difusão) ou sistemas
comerciais automatizados.
Antibiograma..............................................

CIM
Método Kirby
(Concentração
Bauer ou
Inibitória
Disco-difusão
Mínima)
Difusão no ágar Diluição limitante
(qualitativo) (quantitativo)
 Antibiograma....................................

1. Método Kirby Bauer ou Disco-

difusão
- Ágar Mueller-Hinton / MH + 5% Sangue
- Inóculo
- Discos impregnados com o antimicrobiano
- Difusão da droga
Cuidados:
- Não colocar os discos com
menos de 2,5cm entre eles
- Não colocar mais do que 12
discos em placa grande
- uma vez que um disco ou fita
tenha contato com a superfície
do ágar, eles não devem ser
movidos
- incubação a 35 ± 1°C por 16 a
20 horas
1 2 3

4 5
 Ausência do Presença do halo de
halo de inibição inibição

Depende do tamanho do
Resistente
halo

Sensível Intermediário Resistente

Para interpretar os resultados, usa-se tabela de referência.

Presen Ausênc
ça de ia de
halo halo
Concentração Inibitória
Mínima
 CONCENTRAÇÕES
64 32 16 8,0 4,0 2,0 1,0 0,5 0,2 0,1 CN CP
A
CP: controle positivo
A
N CN: controle negativo
ER 0,1 µg

T CP 0,2 µg
0,5 µg
I AX
1,0 µg
B
CI 2,0 µg
4,0 µg
KA
I 8,0 µg
Ó CK 16 µg
32 µg
SXT
64 µg
T