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Olga Martins Marques (Prof

a
UNICAP - DQ)
Alexandra Amorim Salgueiro (Prof
a
UNICAP -DQ)
Maria Alice Gomes de Andrade Lima (Prof
a
UFPE-DEQ)
Maria de Los Angeles Peres Palha (Prof
a
UFPE - DEQ)
Sonia M
a
Souza Cavalcante de Albuquerque (Prof
a
UFPE -DEQ)







Recife - Pernambuco

1998


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Apresentao




A inexistncia de um texto de prticas de Microbiologia
Geral adaptado s nossas condies do nosso laboratrio, e destinado
aos cursos superiores de Engenharia Qumica, Qumica Industrial e
outros, nos motivaram realizao deste manual. Os experimentos
foram selecionados de modo a englobar a maioria dos assuntos contidos
no programa referentes primeira unidade do curso e podem ser
facilmente efetuados em laboratrios de recursos limitados.
Cada experimento, poder ser efetuado por um grupo de
dois ou mais alunos. Muitas vezes o experimento pode ser dividido
entre vrios grupos da classe, sendo que cada grupo deve fazer o
experimento numa determinada condio. Neste caso, o instrutor dever
fazer uma discusso a posteiori e global do problema apresentado.





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PRTICA N 1
OBJ ETIVOS:
Discriminar as funes e/ou aplicaes
Limpar
Acondicionar


1. FUNES E/OU APLICAES DO MATERIAL DO
LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA


1.1. Material Permanente

a. Autoclave - cmara de vapor com parede dupla, equipada com
dispositivos que permitem o enchimento da cmara com vapor
saturado e sua manuteno em determinadas temperatura e presso
por quaisquer perodos de tempo. O autoclave um equipamento
indispensvel ao laboratrio de microbiologia na esterilizao de
meios de cultura, gua, suspenses etc. (ver modo de operao)


b. Estufas de Esterilizao (Fornos de Pasteur) - esteriliza a seco
toda vidraria convenientemente acondici onada, a temperatura de 170
a 200
o
C por 1-2 horas.

c. Refrigerador - utilizado na conservao de culturas de
microrganimos sob baixa temperatura, diminuindo o tempo de
gerao

d. Estufa bacteriolgica - favorece o crescimento de microrganis mos
pela incubao na temperatura adequada.

Incubao = manuteno do meio semeado em determinadas
condies para promover o desenvolvimento dos microrganismos.
e. Mesa agitadora (rumbeira) - favorece o crescimento de
microrganismos aerbios, pela dissol uo do oxignio no meio,
atravs da agitao da mesa, em movimentos rotatrios.

f. Cabine de fluxo laminar - cmara assptica, dotada de exaustor e
lmpada fluorescente, sendo utilizada em repiques de microrganismos

g. Fermentador - equipamento onde ocorrem as fermentaes, podendo
ser dotado de sistemas de agitao, aerao, refrigerao.



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1.2. Vidraria

a. Tubo de ensaio (tubo de cultura) - utilizado no cultivo de
microrganismos em pequeno volume de meio e na conservao de
culturas puras de microrganismos.

b. Placa de Petri - facilita o isolamento de microrganismos devido
grande superfcie de crescimento que apresenta, possibilitando o
aparecimento de colnias separadas.

Colnia = aglomerado de clulas em meio slido, geralmente
originadas de uma nica clula progenitora.
c. Pipeta - para diluir preparaes diversas e inocular culturas lquidas
I nocul ar = i nseri r, i nt roduzi r
Inculo (ou semente) = concentrao de clulas suficientes para
cultivar uma de meio com bom rendimento
d. Pipeta Pasteur - um tubo de vidro espichado em capilar, utilizada
para transportar pequenos volumes de lquido

e. Ala de Drigalsky - obtida a partir de uma pipeta Pasteur longa,
dobrada em ngulo reto e depois em 45C na chama. utilizada para
espalhar microrganismos em meio de cultura slido.

f. Balo de fundo chato- utilizado geralmente para guardar meios de
cultura.

g. Erlenmeyer - utilizado para propagao celular de microrganismos
em meio lquido sob agitao em mesa agitadora.

h. Fernbach - idem

i. Lmina - para examinar microrganismos ao microscpios

Lmina Escavada - possui uma ou duas depresses possibilitando
observar a mobilidade de microrganismos suspensos numa gota de
lquido (Ensaio em gota pendente)

j. Lamnula - utilizada para recobrir prepar aes microscpicas in
vivo

1.3.Materiais utilizados em titul aes, destilaes,
preparaes de soluo e de meios de cultura - Bequer, basto
de vidro, bureta, funil, proveta, balo volumtrico, condensador dentre
outros.


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1.4. Diversos

a. Lpis dermatogrfico - utilizado para escrever em superfcie de
vidro
b. Algodo bruto (ou cardado) - serve para proteger o material
esterilizado, do contato com o ar ambiente.
c. Cabo de Kolle - feito com material isolante, adaptado em trs formas
(crculo, ele, agulha). Serve de suporte para um fio de platina ou uma
liga nquel -cromo, sendo utilizado em inoculao de microrganismos.
2. DESINFECO

a. Desinfeco do ar:

- atravs da vaporizao de uma soluo de hipoclorito de sdio a
1%;

- pelo uso de lmpadas de luz ultravioleta.

- pode ser feita periodicamente com a vaporizao de uma
soluo de formalina (formol a 40%), no entanto, esta soluo no se
pode usar para a desinfeco de ambientes ocupados;


b. Desinfeco da bancada:

Antes da realizao de um determinado trabalho de
microbiologia, a bancada deve ser limpa com uma soluo detergente
seguida de uma soluo alcolica a 70%.

c. Desinfeco da vidraria:

- vidraria contaminada - dever ser inicialmente esterilizada em
autoclave para que toda fl ora presente seja destruda e, em seguida
lavada com uma soluo detergente ou sabo neutro;

- vidraria sem contaminao - idem ao anterior, porm sem
necessidade de autoclavao.

Observao: no costume se utilizar soluo sulfocrmica na lavagem
dos materiais do laboratrio de microbiologia, uma vez que esta soluo
contm cromo que um metal que pode intoxicar as clulas vivas e
tambm por ser de difcil remoo no material





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3. ACONDICIONAMENTO

a. Placas de Petri - embrulhadas com papel, geral mente formando
conjunto de 3 unidades. A quantidade depende da necessidade do
trabalho.

b. Pipetas - obtura-se as boquilhas com mecha de algodo (1cm) para
filtrar o ar soprado e para proteger o operador durante a manipulao;
em seguida so enroladas uma a uma com papel, anotando a capacidade
de cada uma.

c. Tubos de ensaio, bales de fundo chato, Erlenmeyers, fernbachs -
so preparados introduzindo-se um tampo de algodo cardado na boca
do recipiente. Esse tampo deve ser feito, enrolando o algodo no
sentido da fibra em quantidade suficiente para facilitar o manuseio, isto
, no deve ser nem muito apertado, nem muito frouxo.

d. Lminas - mergulhadas em soluo alcolica, ficam aptas a serem
utilizadas a qualquer momento, evitando paralelamente que s ejam
arranhadas.

ATENO: Toda vidraria utilizada no laboratrio de microbiologia
antes de ser preparada para esterilizao dever estar limpa e seca.


ESTERILIZAO EM AUTOCLAVE

Operao: ligar o aparelho rede eltrica. Aps a colocao do
material dentro do autoclave, a tampa fechada e a torneira de remoo
de ar ou vapor deixada aberta para remover todo o ar. Quando todo o
ar for removido, deixe que um fluxo de vapor fluente persista por cerca
de 5 minutos, antes de fechar a torneira. A partir de ento a presso
internamente ir aumentar e chegar presso de esterilizao usada, que
de 15 lb/pol
2
, ou 1atm, ou 1 kgf/cm
2
, correspondendo a uma
temperatura de 121
0
C. O tempo de exposio do material no interior
deste equipamento ir depender do volume de lquido a ser
esterilizado. Para pequenos volumes, at 3 litros, podem ser
esterilizados durante 20 a 30 minutos a uma presso de 15 lb/pol
2
. Com
relao a maiores volumes, ser necessrio, uma exposio mais
prolongada. Quando a temperatura requerida para a esterilizao
alcanada, deve-se comear a contar o tempo, usando um relgio de
laboratrio (com alarme). Decorrido o tempo desliga-se o aparelho da
corrente eltrica e mantm-se a autoclave e a torneira de ar e vapor
fechados, at o manmetr o voltar ao ponto zero, pois quando a presso
da autoclave aliviada rapidamente, os lquidos dentro dos tubos e
frascos fervem violentamente, fazendo com que os tampes sejam
arremessados para fora dos mesmos.


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Concluda a esterilizao, abre-se a tornei ra de vapor; em seguida
a tampa do autoclave levantada.
PRTICA N 2
OBJ ETIVOS:
Trabalhar assepticamente
Cultivar microrganimos
Diferenciar macroscopicamente fungos, leveduras, bactrias
INTRODUO

O homem no seu meio ambiente convive com inmer as formas de
vida. Os microrganismos ocupam lugar de destaque tanto pelos
benefcios como pelos malefcios que proporcionam ao homem, sendo
encontrados na natureza em abundncia e variedade de formas. Para que
os mesmos sejam cultivados artificialmente necessrio conhecer suas
exigncias nutricionais e suas condies fsicas de crescimento,
trabalhar com material esterilizado e obdecer s normas de prtica
assptica.
Dependendo da finalidade da operao, os microrganimos podem
ser cultivados em: lminas, placas, tubos, bales, fernbach ou
recipientes de maior capacidade. O cultivo em lmina utilizado
quando se deseja acompanhar microscopicamente o crescimento e
reproduo de um microrganismo. Emprega-se o cultivo em placas
quando se quer isolar espcies microbianas distintas, devido extensa
rea de superfcie que apresenta. Porm, devido pequena quantidade
de meio em exposio ao ar, com frequncia ocorre ressecamento e/ou
aparecimento de contaminaes.
Cultivando os microrganismos em tubos, h faci lidade de
manipulao das culturas, alm da vantagem de economizar meio e
espao fsico. Para se obter grandes volumes de cultura, o
microrganismo cultivado inicialmente em bales, fernbach, para
depois ser transferido para recipiente maior, cuja capacidade funo
da necessidade do trabalho.

NORMAS DE PRTICA ASSPTICA

1. No trabalhar em corrente de ar, nem ambiente agitado pelo acmulo
de pessoas;
2. No falar nem respirar em frente ao recipiente aberto contendo
material de estudo;


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3. Abrir o recipiente inclinado junto chama, onde o ar est rarefeito de
formas vivas;
4. Retirar o tampo de algodo com o dedo mnimo e a palma da mo
sem tocar na boca do recipiente e sem encostar o tampo em lugar
algum;
5. Flambar a boca do recipiente sempre que for iniciar uma inoculao,
para que uma corrente de ar quente seja formada de dentro para fora;
6. Introduzir o mais rpido possvel a ala ou pipeta sem tocar nas
paredes do recipiente;
7. Ao terminar a inoculao, flambar a boca do recipiente e ajustar o
tampo, conservando o material ao abrigo da poeira e umidade.


PROCEDIMENTO PRTICO
Limpar a bancada;
Marcar todo material (placa e tubos), especificando o tipo de meio e
a fonte da inoculao;
Fundir dois meios de cultura diferentes (por exemplo AN e CZ);
Distribuir os meios em placas de Petri e tubos (inclinar);
Esperar solidificar;
Fazer inoculaes nas superfcies dos meios distribudos em placas; -
Incubar na temperatura ambiente por 2 a 5 dias, no esquecendo de
guardar placas sem inocular, uma de cada meio utilizado para
controle da esterilizao e da eficcia da tcnica utilizada.

FONTES: gua poluda, fermento de padaria, ar, garganta, mos,
cabelo, suor etc.
DIFERENCIAO MACROSCPICA DOS MICRORGANISMOS

Os microrganimos crescem e reproduzem quando cultivados e
inoculados adequadamente. Podemos fazer avaliao dos grupos aos
quais eles pertencem, por observaes das caractersticas das colnias
nos meios em que eles foram cultivados. O crescimento em meio lquido
pode ser evidenciado pela tur vao, pela formao de pequena massa de
clula que flotam (velo) ou por sedimentao das clulas. Em placas de
Petri estuda-se o crescimento dos microrganismos em meio slido,
observando-se o aparecimento de colnias cujos aspectos macroscpicos
auxiliam na diferenciao de grupos microbianos.

I) Descrio de colnias em placas de Petri:




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Aps o perodo de incubao preestabelecido as colnias de
microrganismos cultivados em placas de Petri podem ser descritas de
acordo com os seguintes critrios:
a. forma:



circular rizoide irregular filamentosa

b. quanto dimenso
puntiforme com menos de 1 mm de dimetro

c. cromognese

-cor do pigmento
-pigmento solvel ou insolvel no meio



d. superfcie

plana , elevada, convexa, lisa, rugosa, seca, brilhante, translcida,
opaca, pregueada, pulverulenta

II) Descrio da cultura em caldo nutriente

O crescimento em caldo de cultura pode apresentar -se sob
diferentes formas.

a. turbidez: mais ou menos acentuada

b. forma da pelcula: uma massa de clulas que flutua superfcie do
caldo



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c. sedimento: depsito de clulas no fundo do tubo.



Observao:.
. As colnias de fungos so geralmente grandes e filamentosas, algumas
vezes ocupam toda a placa onde esto cultivadas.
. As colnias de leveduras so pequenas e leitosas, enquanto as de
bactrias so menores e brilhantes sendo algumas to pequenas que se
denominam puntiformes.


PRTICA N 3

OBJETIVOS:

Distinguir os diversos component es de um microscpio tico
composto
Focalizar in vivo: clulas de leveduras em suspenso,
microrganismos (algas, protozorios e bactrias mveis em gua)


COMPONENTES DE UM MICROSCPIO TICO COMPOSTO

I - PARTE MECNICA:

1. Base ou p - dispositivo de tamanho e peso suficiente para assegurar
o equilbrio estvel do instrumento, evitando trepidaes;

2. Corpo, brao ou coluna - haste destinada a sustentar o tubo
microscpico e conter os mecanismos de movimento; alguns apresentam
articulao, facilitando a observao do pesquisador;

3. Tubo ou canho microscpico - cilindro oco que serve de suporte
para os dois sistemas de lentes (oculares e objetivas);

4. Revlver - pea giratria onde ficam fixadas as lentes objetivas,
permitindo que cada lente possa ser colocada em foco ( uma de cada
vez),
isto , em coincidncia com o eixo tico;

5. Platina - plataforma horizontal com uma abertura circular no centro
por onde passam os raios luminosos. Existem platinas mveis;

6. Pina ou presilhas - alas flexveis e ajustveis, situadas na platina.
So utilizadas para fixar a lmina;



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7. Charriot- dispositivo facultativo que permite a movimentao da
lmina em dois sentidos: horizontal e vertical, pela manipulao de dois
parafusos;
8. Sistema de cremalheira - pea munida de dentes, controlada pelos
parafusos macromtrico e micromtrico;

a) Macromtrico - ocasiona diferentes aproximaes entre a objetiva e a
preparao, variando a distncia vertical de vrios centmetros. Serve
para trazer o objeto ao foco aproximado;

b) Micromtrico - permite mnimos deslocamentos verticais da ordem
de centsimos de milmetros, sendo utilizado na focalizao final;

Observao: Nos microscpios mais modernos existe um nico
parafuso que oferece o controle destes dois movimentos.



II - PARTE TICA

1. Fonte luminosa:

1. 1. Natural - luz solar
1. 2. Artificial - lmpada
1. 2. 1. Direta - quando a lmpada est fixada no eixo tico
1. 2. 2. Indireta - quando se utiliza fonte luminosa anexa ao
microscpio.

2. Espelho - girando em torno de um eixo, utilizado para refletir os
raios luminosos; pode ser cncavo ou plano, aumentando ou diminuindo
a intensidade da luz, respectivamente;

3. Diafrgma - controla a extenso angular do feixe luminoso,
reduzindo o ngulo do cone de luz, de modo que no exceda o dimetro
da objetiva aps atravessar o objeto;

4. Condensador - conjunto de lentes convergentes que projeta sobre a
preparao o feixe de luz em forma de um amplo cone; por
deslocamentos verticais diminui ou concentra a l uz no objeto;

5. Lentes objetivas - so as lentes que ficam prximas ao objeto,
formando na parte superior do tubo microscpico uma imagem invertida
e ampliada do objeto. Podem ser: a) a seco - quando o meio entre o
objeto e a lente o ar, podendo ser de pequeno, mdio ou grande
aumento; b) de imerso - quando a lente fica mergulhada numa camada
de lquido;

6. Sistema de lentes oculares - apresenta um conjunto de lentes: lente
de campo (corretora) que corrige a esfericidade da imagem e a lente


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ampliadora que atua em conjunto com o observador como uma simples
lente de aumento, aumentando a imagem formada pela objetiva.


MANIPULAO DO MICROSCPIO

1. Instalao do aparelho

Retirar o microscpio da caixa ou armrio pelo brao e coloc -lo
na mesa apropriada (chumbada e nivelada); a seguir ligar a fonte
luminosa e dispor a objetiva no revlver e regular a altura do banco, de
maneira a permitir um trabalho confortvel.


2. Iluminao de campo

Se a luz utilizada uma luz natural, usar a face plana do es pelho,
caso contrrio, a face cncava. Em qualquer caso, a luz deve cobrir
completamente a superfcie do espelho e este deve estar centrado de
maneira que o cone luminoso refletido atravesse completamente o
condensador (que deve estar completamente levant ado, com o diafragma
aberto) bem como a abertura da platina, de tal sorte que o campo do
microscpio (isto , o espao da platina visualizado com a ocular) fique
totalmente iluminado.

3. Adaptao da preparao

Colocar a lmina contendo a preparao s obre a platina e prend-
la, depois, com o auxlio do Charriot, deslocar o conjunto de tal forma
que a preparao contida na lmina, fique sobre a abertura da platina,
perfeitamente iluminada pelo cone luminoso.

4. Escolha da objetiva

a) preparaes a fresco (In vivo): trabalhar apenas com objetivas a
seco, comeando pela de menor aumento;

b) preparaes coradas (In vitro):

- focalizar inicialmente com a objetiva a seco de menor aumento;

- girar o revlver de maneira que nenhuma das objetivas fiquem em uso;

- colocar sobre a preparao uma pequena gota de leo de imerso;

- colocar no eixo tico a objetiva de maior aumento (imerso)

5. Iluminao da preparao



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Para as preparaes coradas que do imagens por absoro, usar o
mximo de iluminao com o condensador completamente elevado e o
diafragma totalmente aberto. Para as preparaes a fresco, que do
imagens por refrao, iluminar menos a fim de que o fenmeno seja
mais perceptvel. Comear descendo o condensador, a uns dois teros da
sua abertura, depois olhando pela ocular, regular o cone luminoso,
fechando aos poucos o diafrgma.


6. Focalizao

a operao que consiste em trazer o objeto para o foco da
objetiva, formando a imagem que, ampliada pela ocular, ser vista pelo
obsevador. A focalizao consta das seguintes etapas:

a) girar o revlver colocando a objetiva de menor aumento no eixo
tico;

b) ajustar a iluminao de campo;

c) centralizar a preparao;

d) aproximar ao mximo a preparao, da objetiva de menor aumento,
por meio do mecanismo de movimento. Durante este trabalho dever ser
observado a aproximao diretamente com a vista, no devendo ser
utilizado a ocular;

e) observando ento pela ocular, imprimir movimento moderado de
afastamento entre a preparao e a objetiva, at que seja distinguida a
imagem do objeto;

f) movimentar o micromtrico para focalizao final;

g) regular o diafragma e o condensador para visualizar com mais
nitidez;

h) para trocar de objetiva basta o revlver e em seguida ajustar o foco
imprimindo movimentos lentos no micromtrico;

i) ao trmino da observao, girar o revlver at a menor objetiva e
apagar a luz. Retirar a lmina e colocar num recipiente com detergente.

OBSERVAO: Quando o microscpio binocular deve-se ajustar a
distncia inter-ocular de tal forma que o observador visualize um s
campo de luz. Trabalhando com microscpio monocular, procurar
manter ambos os olhos abertos, a fim de evitar fadiga.




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7. Causas de erro na observao
a) Obscuridade total do campo - m centralizao do aparelho de
iluminao
b) Obscuridade parcial - revlver mal centrado, verificar se o ponto em
que h resistncia no foi atingido ou foi ultrapassado.
c) Falta de nitidez da imagem
- preparao invertida ou com sujos;
- ocular suja - verifi car se rodando-a, o sujo acompanha o movimento;
limpar a objetiva;
- objetiva suja ou com arranho - limpar com mistura xilol -ter;
- aparelho de iluminao - falta de centralizao, poeiras depositadas ou
objetos estranhos interpostos na marcha dos raios;
d) Dificuldade subjetiva
Corpsculos de forma diversas que parecem deslocar -se no
campo. Com alguma prtica, verifica-se que eles so independentes da
preparao, e provm do observador; repousar um pouco e repetir a
operao;
e) Movimento Brauniano
Quando os microrganismos deslocam-se num s sentido devido
correntes lquidas formadas por evaporao da gua durante a
observao nas preparaes In vivo. Salientando que o movimento
dos microrganismos aleatrio.
8. Conservao dos microscpios
O aparelho deve estar sempre protegido, seja com capa plstica,
seja com caixa prpria e guardado em ambiente provido de luz artificial
para evitar o crescimento de fungos. A cada utilizao o p do
microscpio dever ser removido com um pano limpo.
Evitar a ao de vapores cidos e contato com reativos; s
manuse-lo com mos limpas; s observar preparaes limpas e ter o
cuidado de no deixar escorrer nada sobre a platina ao adaptar a
preparao. Se isto ocorrer, limpar imediatamente, se necessrio com
gua destilada, enxugando a seguir.
As oculares devem ser limpas externamente com papel de seda e
internamente, por um tcnico, s quando necessrio.


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A objetiva de imerso limpa com papel de filtro ou algodo
umedecido com uma mistura de xilol e ter na proporo de 1:1, que
deve ser imediatamente removido com papel ou algodo limpo.
A permanencia de xilol sobre a lente causa desvitrificao da
mesma.
Nunca deixe ficar leo na lente pois ali resinifica e depois para
limpar, exige excesso de dissolvente, podendo este penetrar no sistema,
dissolvendo o blsamo que liga as diversas partes.
As objetivas a seco so limpas com um linho macio e
ocasionalmente, com papel umedecido com gua destilada.
A parte interior das objetivas no deve ser limpa usualmente e
quando feito dever ser praticada por pessoa habilitada. Deve -se
remover a objetiva e passar suavemente um pincel macio ou uma bucha
de pano macio na extremidade de uma haste. No se deve assoprar para
evitar a umidade. Esta operao dever ser feita com muito cuidado
para no descentralizar as objetivas.
As lentes do aparelho de iluminao so limpas como as demais,
com frequncia pois delas depende a boa iluminao fornecida.
A parte mecnica limpa e polida com uma flanela e a
cremalheira com leo detergente fino.
Para uma boa conservao do microscpio o operador dever
seguir uma rotina diria que vai desde uma simples remoo do p at
uma lubrificao mensal de todas as partes mveis com um leo fluido.
A cada trimestre o aparelho deve ser enviado a um tcnico especializado
para uma inspeo rigorosa, limpeza e lubrificao geral.


PRTICA N 4
OBJETIVOS:
Realizar colorao simples
Observar microrganismos diferentes sob objetiva de imerso
Diferenciar leveduras de bactri as considerando o tamanho celular



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OBSERVAES IN VITRO
Os microrganismos so usualmente transparentes, tornando difcil
o estudo de detalhes morfolgicos quando so examinados em seu
estado natural, assim torna-se necessrio a utilizao de tcnicas de
colorao.
As observaes microscpicas in vitro so realizadas com o
microrganismo previamente fixado lmina. Nestas condies as
clulas microbianas so observadas mortas.
Aps a fixao, submete-se a preparao etapa de colorao
pela adio de solues adequadas em funo da tcnica de colorao
desejada.
As tcnicas de colorao no s facilitam a visibilidade das
clulas microbianas, como tambm, propiciam a visualizao de
determinadas estruturas celulares em funo de afinidades especfic as
com determinados corantes, e facilitam identificao de micorganismos
devido a comportamento diferentes frente ao de solues
diferenciadoras.
A menos que algum aspecto morfolgico especfico, dependente
de idade da cultura, deva ser demonstrado, o microbiologista deve usar
sempre cultura nova nas observaes microscpicas. As clulas com o
tempo de cultivo, modificam o metabolismo, alterando a afinidade com
muitos corantes. Excluindo os organismos que tm um tempo de gerao
especialmente grande, uma cultura com 24 horas de cultivo dar sempre
bons resultados.


SUBSTNCIAS CORANTES

Segundo Langeron, corantes so substncias coradas que gozam
da propriedade de transmitir cor a outros corpos.
Muitas so as substncias corantes empregadas na rotina diria
dos laboratrios, a maioria derivados da anilina, podendo ser
classificados em naturais e artificiais. Entre os naturais destacam-se: o
carmim, a hematoxilina. Os artificiais so agrupados em funo dos
grupos qumicos presentes e da afinidade com estruturas celulares,
podendo ser:

a) Bsicos ou nucleares: violeta de genciana, cristal violeta, verde de
malaquita, azul de metileno, fucsina bsica, azul de toluidina, verde de
metila etc.

b) cidos ou citoplasmticos: eosina, fluorescena, fucsina cida,
orange G, vermelho congo, cido picrico etc

c) Neutros: eosinato de azul de metileno e de azul AZUR, giensa etc.


PREPARAO E FIXAO DE ESFREGAO


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Em processos de colorao de rotina, uma boa observao
microscpica depende tanto da preparao do esfregao como de sua
fixao lmina.

TCNICA

. Flambar a ala de platina (em crculo) ao rubro, deixar esfriar,
conservando-a prxima chama;

. Depositar com o auxlio da ala, gotas da suspenso microbiana na
lmina, se for o caso, suspender a amostra da cultura na prpria lmina;

. Espalhar bem o material na lmina, empregando movimentos
rotacionais na ala de platina ( do centro para a periferia), a fim de se
obter um esfregao de forma oval, bem fino e uniforme;

. Secar a fina pelcula do material (esfregao) ao ar ou pela passagem
na chama do bico de Bunsen;

. Fixar o esfregao, passando o dorso da lmina trs vezes ou mais na
chama, a fim de que o material fique bem aderido lmina;

. Deixar a preparao esfriar ao ar e corar.


A fixao do esfregao com gua pode formar aerossis
(partculas projetadas durante a fervura de lquidos); evita -se
introduzindo a lmina no cone azul da chama (parte redutora, a mais
quente), permanecendo alguns instantes a fim de secar o material.

A preparao e fixao do esfregao requer cuidados evitando-se
tratamentos bruscos, para que as clulas da amostra a serem observadas
no fiquem aglomeradas dificultando a observao, como tambm no
tenham seus arranjos caractersticos destrudos.


COLORAO SIMPLES

Denomina-se de colorao simples colorao em que se adiciona
qualquer soluo corante ao esfregao fixado durante um determinado
tempo (30s a 3 min) em funo do corante utilizado. Depois lava -se a
lmina em gua corrente, seca-se e observa-se usando a objetiva de
imerso.
Essa colorao tem a finalidade de nos d uma viso da forma, do
tamanho e dos arranjos das clulas, bem como de outros detalhes
estruturais.




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TCNICA

1. Preparar e fixar o esfregao;
2. Cobrir com algumas gotas de uma soluo corante (azul de metileno,
cristal violeta, fucsina, safranina);
3. Deixar o corante agir por 60s;
4. Lavar em gua corrente;
5. Secar cuidadosamente na chama ou com papel absorvente;
6. Observar com a objetiva de imerso (no esquecer de col ocar 1 gota
de leo de imerso antes de adaptar a referida objetiva no eixo tico).


Obsevao: No se deve facilitar com os papis absorventes usados,
especialmente se os microrganismos em estudo forem patgenos.



PRTICA N 5
OBJETIVOS:
Realizar colorao Diferencial de Gram
Observar ao microscpio sob imerso as preparaes
in vitro
Diferenciar as formas de bactrias (cocos, bacilos) e arranjos
celulares ( em cadeia, ttrades, cbicos, em cachos).
COLORAES DIFERENCIAIS
As coloraes diferenciais distinguem grupos de microrganismos
entre si, devido diferenas qumicas existentes entre as clulas
microbianas.
Nesta tcnica de colorao utiliza-se inicialmente solues de
corantes e mordentes; numa segunda etapa um agente diferenciador;
para fi nalmente realizar outra colorao que contrasta com a primeira.
COLORAO DIFERENCIAL DE GRAM
Em 1884, CHRISTIAN GRAM descobriu um mtodo de
colorao, baseado no fato de que, quando certas bactrias so coradas
pelo cristal de violeta e depois tratadas pelo iodo (soluo iodo-
iodetada, dita lugol), forma-se um composto de colorao escura entre o
iodo e o corante, o qual fortemente removido pelo tratamento
subseqente com lcool (diferenciador). So as bactrias Gram
positivas, as que tomam o corante de Gram (cristal violeta). Outras
bactrias, ditas Gram negativas, deixam-se descorar facilmente pelo
lcool. Assim sendo, se aps a ao do lcool, fizermos uma colorao
de fundo pela safranina ou pela fucsina bsica, as bactrias Gram
negativas aparecero vermelhas.


19
MECANISMO DA COLORAO DE GRAM
As bactrias Gram positivas e Gram negativas interagem com o
corante cristal violeta devido ligaes irnicas entre os grupos bsicos
dos corantes e grupos cidos dos constituintes celulares. O iodo em
soluo penetra nos dois tipos de clulas e forma um precipitado com o
corante. O agente descorante (lcool etlico ou acetona) nas clulas
Gram negativas passa facilmente atravs da membrana celular
dissolvendo o complexo corante-iodo, deixando a clula incolor. Nas
clulas Gram positivas o lcool penetra com dificuldade e a dissoluo
do complexo lenta. A maior parte do complexo corante -iodo
permanece na clula que retm assim a sua colorao. Pela adio do
contra-corante (safranina ou fucsina bsica) as clulas Gram positivas
permanecem violetas enquanto as Gram negativa interagem com o
mesmo, ficando vermelhas.
As diferenas qumicas entre os constituintes da parede celular
das bactrias so responsveis pela reteno ou no do cristal violeta.
Todas as clulas desprovidas de parede celular (certos
protozorios), bem como as clulas artificialmente despojadas de parede
celular (mesmo que sejam Gram positivas), comportam-se como Gram
negativas.
As bactrias Gram negativas contm uma concentrao elevada de
lipdeos, e suas paredes so tambm mais delgadas com relao s
bactrias Gram positivas. O descoramento extrai os lipdeos
aumentando a porosidade ou permeabilidade da parede favorecendo a
retirada do complexo cristal violeta-iodo.
As paredes celulares das bactrias Gram. positivas em virtude de
sua composio diferente (menos contedo lipdico, presena de cido
teicico, maior quantidade de peptoglicano (mucocomplexo) cujos
aminocidos encontram-se mais intercruzados, deixando a parede mais
compacta), tornam-se desidratadas durante o tratamento com o
descorante; a porosidade diminui, a permeabilidade se reduz e o
complexo cristal violeta-iodo no extrado.
O mtodo de Gram dentre os processos de colorao para
bactrias, o mais importante.
Todas as leveduras quando submetidas a esta colorao
comportam-se como Gram positivas, enquanto os fungos filamentosos e
para os protozorios, geralmente no se aplica esta tcnica por no ser
conveniente.
REGRAS GERAIS DA COLORAO PELO MTODO DE GRAM
1 - Os cocos, so geralmente Gram-positivos, com exceo dos
pertencentes ao gnero Neisseria (Gonococos , Meningococos).
2 - Os bacilos, so geralmente Gram-negativos, excetuando-se os
pertencentes aos gneros: Corynebacterium (bacilo diftrico); Bacillus


20
(B. subtilis ), B. antracis (do carbnculo) e Clostridium (bacilo do
ttano
Cl. tetani ; Cl. botulinum (do botulismo).
TCNICA DA COLORAO DE GRAM
1. Preparar um esfregao;
2. Depois de frio cobrir o esfregao com soluo de cristal de violeta
(1 minuto);
3. Cobrir com soluo de lugol (mordente) - 1 minuto;
4. Lavar em gua corrente;
5. Descorar pelo lcool absoluto (evitar o descoramento deficiente ou
em excesso;
6. Lavar em gua corrente;
7. Contrastar, rapidamente com safranina (30 segundos);
8. Lavar em gua corrente;
9. Secar com papel fino;
10. Examinar com objetiva de imerso.

AMOSTRAS:

Bacillus subtilis
Escherichia coli
Aerobacter aerogenes
Staphylococcus aureus
Sarcina lutea
Micrococcus

PRTICA N 6
OBJETIVOS:
Realizar colorao Especial de esporos
Observar ao microscpio sob imerso as preparaes coradas


COLORAO DE ESPOROS

Os esporos so clulas de resistncia, no sendo caracterstica
predominante de todos os microrganismos. Algumas bactrias so
capazes de formar esporos, como por exemplo: bactrias do gnero
Bacillus e Clostridium.

TCNICA

1. Preparar o esfregao e fixar;
2. Cobrir o esfregao com papel de filtro;


21
3. Adicionar o corante verde malaquita;
4. Aquecer at emisso de vapores;
5. Repetir as operaes 3 e 4 por 3 minutos;
6. Lavar em gua corrente;
7. Adicionar safranina (0, 5 a 1 minuto);
8. Lavar em gua corrente;
9. Secar e observar em imerso

RESULTADO: Os esporos coram-se em verde e o resto da clula em
vermelho.

PRTICA N 7
OBJETIVOS:
Preparar meios de cultura de usos em prticas microbiolgicas
Distribuir convenientemente, esterilizar em autoclave

PREPARAO DE MEIOS DE CULTURA

Meios de cultura so associaes de substncias que permitem o
cultivo dos microrganismos fora do seu meio natural.
Nas preparaes dos meios de cultura todos os nutrientes devem
ser dissolvidos em gua para que possam ser absorvidos pelas clulas
microbianas.
Nos laboratrios geralmente utiliza-se gua destilada no preparo
destes meios, no entanto nas unidades industriais costuma-se utilizar
gua de rios ou poos. A gua deve ter boa origem e composio
qumica constante; quando necessrio, deve ser devidamente tratada.
Como constituintes bsicos dos meios de cultura, alm da gua,
pode-se especificar: as fontes de carbono, as fontes de nitrognio, os
sais. Em meios de cultura solidificados, alm destes componentes deve -
se introduzir agar, gelatina ou slica gel com a funo especfica de
solificar esses meios.

NORMAS DE PREPARAO

Pesagem dos componentes: os diversos componentes dos meios de
cultura podem ser pesados separadamente, ou consecutivamente num
nico recipiente (Bquer). Para quantidades inferiores a 1g utiliza -se
uma balana analtica (semi -analtica).
O agar-agar geralmente pesado separadamente, sendo o valor da
pesagem em funo da quantidade do meio a ser distribudo nos
recipientes. Utiliza-se de 10 a 20g deste agente solidificante em p para
cada litro de soluo nutriente.

Solubilizao dos componentes: adicionar os nutrientes previamente
pesados a um Bquer contendo gua destilada em quantidade suficiente


22
para dissolv-los. Os extratos de carne e de leveduras podem ser
aquecidos ligeiramente para facilitar a solubilizao. Deve -se evitar o
uso de fogo direto e prolongado para no haver queima do material e
consequente escurecimento do meio.
O agar no solvel a frio, devendo se necessrio ser
solubilizado em um banho-maria ou em autoclave a vapor fluente.



Ajuste do pH nos meios: deve-se deixar resfriar ao mximo os meio
lquidos, antes de acertar o pH. No caso dos meios solidificados ajustar
na menor temperatura em que no haja solidificao.
So empregadas para ajuste do pH solues de hidrxido de
sdio ou cido clordrico a 0, 1 N, conforme o caso. Na maioria dos
casos pode-se verificar o pH atravs do uso de um papel de tornassol.
Em meios solidificados, o pH cido s dever ser ajustado depois
da esterilizao para evitar a hidrlize do agar quando em temperatura
elevada. Neste caso o pH cido ajustado com uma soluo estril de
cido ltico.

Clarificao: em alguns casos h necessidade de clarificao dos
meios que durante o preparo tornam-se turvos. A clarifio pode ser
feita simplesmente pelo calor ou pelo uso de clara ou albumina de ovo,
aquecendo em seguida at ebulio e filtrando-se em gase ou algodo
hidrfilo.

Distribuio, esterilizao e conservao: os meios de cultura
depois de preparados so distribudos em recipientes adequados (tubos,
bales, Erlenmeyeres), especificando o respectivo nome ou sigla e a
data do preparo dos mesmos. Terminada a distribuio, os tubos, bales
ou Erlenmeyers so arrolhados com algodo ou tampas metlicas
especiais, acondicionados em cestas e levados esterilizao em
autoclave. A temperatura e o tempo de exposio neste equipamento
depende da composio e da quantidade de meio de cultura recipiente
(vide esterilizao).
Aps a esterilizao, os meios so resfriados espera-se 72 horas
antes de us-los ou estoc-los em geladeira, a fim de que se possa
detectar algum tipo de contaminao, ou falha de esterilizao.




COMPOSIO DE MEIOS DE CULTURA


AGAR NUTRITIVO

Extrato de carne. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3, 0g
Peptona. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5, 0g


23
Agar. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20, 0g
gua destilada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1000ml
pH = 6, 8 - 7, 0



BATATA GLICOSE AGAR - BGA

Batatas descascadas e cortadas em fatias . . . . . 300g
gua destilada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1000ml

As batatas devem ser manuseadas com o mnimo de exposio ao ar.
Aquecer em 500ml de gua at completamente cozidas. Filtrar atravs
de gase, completar o volume para 1000ml e adicionar:

Agar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15, 0g
Glicose. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20, 0g

pH = 6, 8 - 7, 0

CZAPECK (CZ)

NaNO
3
(nitrato de sdio). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3, 0g
K
2
HPO
4
(fosfato monocido de potssio). . . . . . 1, 0g
MgSO
4
(sulfato de magnsio). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0, 5g
KCl (cloreto de potssio). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0, 5g
FeSO
4
(sulfato ferroso). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0, 01g
Sacarose. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30, 0g
Agar. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20, 0g
gua destilada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1000ml
pH = 6, 6

CALDO GLICOSADO

Extrato de carne. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3, 0g
Peptona. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5, 0g
Glicose. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10, 0g
gua destilada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1000ml
pH = 6, 8 - 7, 0

CALDO LACTOSADO

Peptona. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5, 0g
Extrato de carne. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3, 0g
Lactose. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5, 0g
gua destilada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1000ml
pH = 6, 8 - 7, 0

GODOY


24

Peptona. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1, 0g
Caldo-de-cana. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 500g
Agar. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15g

Juntar ao caldo-de-cana uma clara de ovo batida. Aquecer at
fervura, filtrar completando o volume at 1000ml. Juntar a peptona e o
agar.




GLICOSE LEVEDURA (GL)

Peptona . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10, 0g
Extrato de carne. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3, 0g
NaCl. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5, 0g
Extrato de levedura. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10, 0g
Glicose. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10, 0g
Agar. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12-15g
gua destilada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1000mL
pH 6, 9 -7, 1


EMB

Peptona . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10, 0g
Lactose. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5, 0g
Sacarose. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5, 0g
K
2
HPO
4
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2, 0g
Agar. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12-15g
gua destilada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1000mL


Dividir em bales de 250 mL, 100mL e 200mL de meio.
Esterilizar a 120
o
C por 20 minutos.

Quando for distribuir em placas para uso, fundir e adicionar
para cada 100 mL de meio, 1mL de soluo estril de eosina (4%) e
1mL de soluo estril de azul de metileno (0, 65%). As placas podem
ser guardadas por uma semana em refrigerador.


GLICOSE AGAR (GA)

Extrato de carne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3, 0g
Peptona. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5, 0g
Glicose. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10, 0
Agar. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20, 0g


25
gua destilada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1000ml
pH = 6, 8 - 7, 0

SORO DE LARANJA

Triptona. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10, 0g
Extrato de leveduras. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3, 0g
Glicose. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4, 0g
Fosfato dipotssico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15, 0g
Soro de laranja. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200, 0ml
gua destilada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 800, 0ml

Preparar o soro de laranja aquecendo 1 litro do suco recm-
extrado, a aproximadamente 93C. Adicionar 30g de diatomcea e
misturar. Fil trar com suco atravs de um funil de Buchner usando
papel de filtro grosseiro recoberto com o auxlio de filtrao. Refiltrar
os primeiros mililitros. Ajustar o pH a 5, 5 , distribuir em recipientes
adequados.


PRTICA N 8
OBJETIVOS:
Isolar bactrias, fungos filamentosos e leveduras de ambientes
diversos
Identificar morfologicamente as espcies isoladas


Os microrganismos em seus ambientes naturais (gua, solo, ar
etc) existem como uma populao mista. Para que possamos estudar
uma determinada espci e de microrganismo nas suas caractersticas
morfolgicas e bioqumicas individuais necessrio separ -la das
diversas espcies contidas nessa populao , obtendo uma cultura pura e
formada por microrganismso derivados de uma nica clula original.

O i solamento de microrganismos requer tcnicas adequadas de
inoculao destes microrganismos em meios de cultura adequados que
possibilitem o seu rpido crescimento, livre de contaminaes.
Para o cultivo, em condies laboratoriais, de microrganismos
necessrio o conhecimento de suas exigncias nutritivas e das condies
fsicas requeridas. Extensas pesquisas determinaram exigncias
nutritivas de muitas espcies de microrganismos e esta informao
resultou no desenvolvimento de numerosos meios de cultura . Por causa
da grande variedade das necessidades nutritivas dos microrganismos h,
tambm, grandes diferenas na composio dos meios utilizados. Do
mesmo modo, existem amplas variaes no que se refere ao ambiente
fsico que favorece seu crescimento. Alguns microrganismos, por


26
exemplo crescem abaixo de 0C; outros exigem temperatura acima de
45C e podem desenvolver -se at mesmo a 70C. certas bactrias
necessitam do oxignio atmosfrico; outras so indiferentes ou inibidas
pelo oxignio.








MTODO DE ISOLAMENTO DE CULTURAS PURAS


Tcnica de sementeira em superfcie e de esgotamento do inculo:


- Com o uso de uma ala de platina, coloca-se uma poro de
espcime na superfcie de um meio de cultura com gar.

- Espalhar a amostra de lado a lado, na superfcie da placa ,
tracando linhas de acordo com as figuras 1 e 2 , de modo que as
bactrias individuais se separem umas das outras.

- Incubar as placas na temperatura adequada

- Examinar as placas que apresentarem colnias isoladas

- Selecionar uma colnia caracterstica da espcie estudada e
anotar seus aspectos macroscpicos, tais como: tamanho, forma,
consistncia, cor da colnia e de seu reverso, se h pigmento solvel
etc.

- Transferir com a ajuda de uma ala de platina, material da
colnia escolhida para um tubo contendo meio inclinado e incubar
temperatura e tempo adequados.

- Examinar as caractersticas do microganismo atravs de
observaes microscpicas in vivo e in vitro com coloraes
especficas utilizando para isso um microscpio tico luminoso.



Tcnica da placa derramada (pour-plate): O princpio da tcnica
o da diluio do material em tubos de agar liquefeito.

- Transfere-se uma ala de platina da suspenso original para o
tubo A (agar fundido). O tubo rolado entre as mos, permitindo a


27
mistura completa do inculo com o meio. Transferncias similares so
efetuadas do tubo A para o B e, deste, para o C.

- Os contedos de cada tubo so derramados em placas separada

- Incubar as placas na temperatura e perodo de tempo adequados

- Examinar as placas que apresentarem colnias isoladas


- Selecionar uma colnia caracterstica da espcie estudada e
anotar seus aspectos macroscpicos, tais como: tamanho, forma,
consistncia, cor da colnia e de seu reverso, se h pigmento solvel
etc.

- Transferir com a ajuda de uma ala de platina, material da
colnia escolhida para um tubo contendo meio inclinado e incubar
temperatura e tempo adequados.

- Examinar as caractersticas do microganismo atravs de
observaes microscpicas in vivo e in vitro com coloraes
especficas utilizando para isso um microscpio tico luminoso.


Tcnica das diluies sucessivas: se o microrganismo suspeito,
numa populao mista, est presente em nmero maior do que outros
germes, pode ser obtido em cultura pura por meio de uma srie de
diluies em meios apropriados.

- Transfere-se 1ml ou 1g do material a ser examinado para um
Erlenmeyer A contendo 99ml de gua estril. Homogeniza -se
permitindo a mistura completa do inculo com a gua. A partir da,
transfere-se 1ml para um tubo B com 9ml de gua estril, agita -se e
repete a operao para os tubos restantes (C, D, E). Obtm-se assim
uma srie de diluies decimais.

- De cada tubo transferir para duas placas estreis, amostra de
1ml, depois adicionar a cada placa cerca de 15 ml de meio fundido e
resfriado a 45
o
C;

- Incubar as placas na temperatura e perodo de tempo
adequados;

- Examinar as placas que apresentarem colnias isoladas.

Maiores detalhes sobre esta tcnica esto no esquema apresentado
na figura 2.


28


FIGURA 2 - Esquema de diluio da tcnica das diluies sucessivas.

Visando facilitar o entendimento e treinar o alunos nas tcnicas
de isolamento acima referidas, foram selecionadas de algumas tcnicas
sobre bactrias, bolores e leveduras. Estas tcnicas deveram ser
realizadas em grupo de trs alunos e realizadas num perodo de 1 a 2
semanas.



29
ISOLAMENTO DE Streptomyces sp. DO SOLO


MATERIAL

Amostra de terra seca
Erlenmeyer com 99 ml de gua estril
4 tubos de ensaio contendo cada um 9 ml de gua estril
1 balo com meio de Czapeck (CZ)
Placas de Petri esterilizadas
Tubos de ensaio com meio Cz
Placa com meio AVP


TCNICA


1
o
DIA - Pesar um grama de terra e suspender no Erlenmeyer que
contm gua estril. Agitar para obter uma suspenso dos
microrganismos existentes.
Transferir com pipeta estril, 1 ml da suspenso para um dos
tubos de gua estril; agitar bem e deste tubo retirar 1ml e
transferir para outro tubo com gua e assim sucessivamente
sendo realizada uma srie de diluies 10
- 2
, 10
- 3
, 10
- 4
, 10
- 5
, 10
-
6
.
De cada tubo transferir para duas placas estreis, amostra de
1ml, depois adicionar a cada placa cerca de 15 ml de meio de
CZ fundido e resfriado a 45
o
C.



Agitar para homogenizar. Esperar o meio solidificar em
repouso por mais ou menos 3 minutos, inverter as placas e


30
incubar temperatura ambiente durante 5 a 7 dias.
2
o
DIA - Observar as colnias que cresceram e escolher colnias tpicas
de Streptomyces: pequenas, secas, de cores variadas. Na
escolha da colnia devem ser anotados aspectos
macroscpicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos,
consistncia, brilho, presena de pigmento solvel. Transferir
com ala de platina parte da colnia para um tubo com CZ e
para uma placa com meio de CZ e para uma placa com AVP,
fazendo nesta ltima uma estria no centro com auxlio de uma
ala em L. Incubar.

3
o
DIA - Observar o crescimento no tubo de cultura. Testar a atividade
anti -microbiana da cepa utilizando a placa de AVP que
apresenta uma estria central; inocular diferentes germes
(bactrias, leveduras) fazendo estrias perpendiculares estria
central, comeando a 30 mm da estria central e terminando
junto mesma. Fazer placas testemunhas inoculando apenas as
estrias de microrganismos-testes. Incubar as placas a 30
o
ou
37
o
C dependendo da temperatura dos microrganismos -testes.

4
o
DIA - Observar se houver inibio e medir (o halo correspondente) a
distncia em milmetros do crescimento do microrganismo-
teste at a estria de Streptomyces.



OBSERVAO:
A prtica dever ser encerrada mediante a entrega
do relatrio e do tubo de cultura isolada.



31
ISOLAMENTO DE BACILOS ESPORULADOS DO SOLO


MATERIAL

Amostra de terra seca
1 Erlenmeyer com 99 ml de gua estril
1 tubos de ensaio contendo 10ml de caldo glicosado
4 tubos de ensaio contendo cada um 9 ml de gua estril
1 balo com meio de Agar Nutritivo (AN)
Placas de Petri esterilizadas
Tubos de ensaio com meio AN

TCNICA


1
o
DIA - Pesar um grama de terra e suspender no erlenmeyer que
contm gua estril. Agitar para obter uma suspenso dos
microrganismos existentes.
Transferir com pipeta estril, 1 ml da suspenso para um tubo
de caldo glicosado. Imergir o tubo em gua fervente pelo
espao de tempo de 5 minutos. Resfriar e transferir 1 ml do
caldo para um tubo com 9ml de gua estril, agitar para
homogenizar e repetir a operao para mais 3 tubos. Obtm-se
assim uma srie de diluies decimais 10
- 4
, 10
- 5
, 10
- 6
. De cada
diluio transferir para duas placas estreis, amostra de 1ml,
depois adicionar a cada placa cerca de 15 ml de meio de AN
fundido e resfriado a 45
o
C.


Agitar para homogenizar. Esperar o meio solidificar em
repouso por mais ou menos 3 minutos, inverter as placas e
incubar temperatura ambiente durante 48 horas.


32
2
o
DIA - Observar as colnias que cresceram e escolher colnias tpicas
de bacilos esporulados: grandes, com bordos irregulares, de
superfcie rugosa. Na encolha da colnia devem s er anotados
aspectos macroscpicos, tais como: tamanho, cor, forma,
bordos, consistncia, brilho, presena de pigmento solvel.
Transferir com ala de platina parte da colnia para um tubo
com AN e incubar temperatura ambiente.

3
o
DIA - Observar o crescimento no tubo de cultura em AN. Fazer
lmina n vivo para observar se h movimento. Realizar uma
colorao de Gram e uma de esporos.

OBSERVAO:
A prtica dever ser encerrada mediante a entrega
do relatrio e do tubo de cultura isolada.



33
ISOLAMENTO DE BACTRIAS MESOFLICAS DE GUA


MATERIAL

Amostra de gua poluda
1 Erlenmeyer com 99 ml de gua estril
4 tubos de ensaio contendo cada um 9 ml de gua estril
1 balo com meio de Agar Nutritivo (AN)
Placas de Petri esterilizadas
Tubos de ensaio com meio AN


TCNICA

1
o
DIA - Pesar um grama de terra e suspender no Erlenmeyer que
contm gua estril. Agitar para obter uma suspenso dos
microrganismos existentes.
Transferir com pipeta estril, 1 ml da suspenso para um dos
tubos de gua estril; agitar bem e deste tubo retirar 1ml e
transferir para outro tubo com gua e assim sucessivamente
sendo realizada uma srie de diluies 10
- 3
, 10
- 4
, 10
- 5
, 10
- 6
.
De cada diluio transferir para duas placas estreis, amostra
de 1ml, depois adicionar a cada placa cerca de 15 ml de meio
de AN fundido e resfriado a 45
o
C.





Agitar para homogenizar. Esperar o meio solidificar em
repouso por mais ou menos 3 minutos, inverter as placas e
incubar temperatura ambiente durante 48 horas.


34
2
o
DIA - Observar as colnias que cresceram e escolher colnias tpicas
de bactrias. Na escolha da colnia devem ser anotados
aspectos macroscpicos, tais como: tamanho, cor, forma,
bordos, consistncia, brilho, presena de pigmento solvel.
Transferir com ala de platina parte da colnia para um tubo
com AN e incubar temperatura ambiente.

3
o
DIA - Observar o crescimento no tubo de cultura em AN. Fazer
lmina n vivo para observar se h movimento. Realizar uma
colorao de Gram e uma de esporos.

OBSERVAO:
A prtica dever ser encerrada mediante a entrega
do relatrio e do tubo de cultura isolada.



35
ISOLAMENTO DE BACTRIAS COLIFORMES


MATERIAL

Amostra de gua de banheiro, ou pedao de queijo coalho ou carne de
sol;
Tubos com meio de verde-bril hante-lactose-bile (VB)
Tubos de ensaio contendo caldo lactosado
1 balo com meio de Agar Nutritivo (AN)
Placas de Petri com meios diferenciais (EMB ou Endo ouTTC)
Tubos de ensaio com meio AN


TCNICA

1
o
DIA - Inocular o tubo de Verde-brilhante com o mat erial a ser
pesquisado, incubar a 35
o
C por 48 horas.

2
o
DIA - Inocular o tubo fermentado em placas de Petri com meio
diferencial seguindo um dos esquemas abaixo.



Incubar 35
o
C durante 48 horas.


36
3
o
DIA - Observar as colnias que cresceram e escolher colnias tpicas
de coliformes. Na escolha da colnia devem ser anotados
aspectos macroscpicos, tais como: tamanho, cor, forma,
bordos, consistncia, brilho, presena de pigmento solvel.
Transferir com ala de platina parte da colnia para um tubo
com AN e para um tubo com caldo lactosado (CL) incubar
35
o
C.

4
o
DIA - Observar se o tubo de caldo lactosado fermentou e ento se o
tubo tiver dado resultado positivo (presena de bolha de ar)
prosseguir a anlise com o tubo de cultura com o meio de
agar-nutritivo (AN). Realizar uma colorao de Gram e uma de
esporos. Anotar os resultados e comparar com a literatura.

OBSERVAO:
A prtica dever ser encerrada mediante a entrega
do relatrio e do tubo de cultura isolada.



37
ISOLAMENTO DE BACTRIAS DO IOGURTE
(Lactobacillus e Streptococcus)

MATERIAL
Uma amostra de Iogurte natural
Placa de Petri com meio de Agar -glicose-levedura (GL)
Tubos de ensaio com meio de leite desengordurado
Tubos de ensaio com meio de Agar-glicose-levedura (GL)


TCNICA


1
o
DIA - Fundir e resfriar o meio de cultura; em seguida distribuir em
placas de Petri. Quando o meio solidificar fazer estrias com o
material pesquisado na superfcie de cada uma das placas.
Cada aluno dever realizar a tcnica de esgotamento utilizando
apenas uma placa, segundo o desenho abaixo:

ou ento, com uma ala em L fazer estrias paralelas a partir da
gota depositada na primeira placa e continuando em mais duas
placas do mesmo meio, segundo o esquema abaixo:



38
Agitar para homogenizar. Esperar o meio solidificar em
repouso por mais ou menos 3 minutos, inverter as placas e
incubar em condies anaerbicas ou sob tenso de CO
2
(por
exemplo, utilizando uma lata cuidadosamente no fundo da lata
e a seguir fechar bem, por um perodo de 48 a 72 horas.

2
o
DIA - Observar as colnias que cresceram e escolher colnias
distintas.
Na escolha da colnia devem ser anotados aspectos
macroscpicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos,
consistncia, brilho, presena de pigmento solvel. Transferir
com ala de platina parte da colnia para um tubo com meio
de GL e para um tubo com meio de leite (o qual pode conter
um corante indicador). Incubar.

3
o
DIA - Observar o se h coagulao no tubo com meio de leite.
Verificar se h crescimento no tubo de GL e realizar uma
colorao de Gram. Incubar. Comparar com os dados obtidos
na prtica com os fornecidos pela literatura.


OBSERVAO:
A prtica dever ser encerrada mediante a entrega
do relatrio e do tubo de cultura isolada.


39
ISOLAMENTO DE BOLORES DO SOLO

MATERIAL
Uma amostra de terra seca
Um Erlenmeyer com 99 ml de gua estril
4 tubos com 9 ml de gua estril
Um balo com meio de Czapeck (CZ) fundido
8 placas de Petri estreis
4 tubos e quatro placas com meio de Czapeck


TCNICA


1
o
DIA - Pesar um grama de terra e suspender no Erlenmeyer que
contm gua estril. Agitar para obter uma suspenso dos
microrganismos existentes.
Transferir com pipeta estril, 1 ml da suspenso para um dos
tubos de gua estril; agitar bem e deste tubo retirar 1ml e
transferir para outro tubo com gua e assim sucessivamente
sendo realizada uma srie de diluies 10
- 2
, 10
- 3
, 10
- 4
, 10
- 5
, 10
-
6
.

De cada tubo transferir par a duas placas estreis, amostra de
1ml, depois adicionar a cada placa cerca de 15 ml de meio de
CZ fundido e resfriado a 45
o
C.

Agitar para homogenizar e incubar temperatura ambiente
durante 5 a 7 dias.
2
o
DIA - ( 5 a 7 dias depois) Observar as colnias que cresceram e


40
escolher colnias tpicas de bolores: filamentosas, grandes, de
cores variadas.
Na escolha da colnia devem ser anotados aspectos
macroscpicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos,
consistncia, brilho, presena de pigmento solvel. Transferir
com ala de platina parte da colnia para um tubo com CZ e
para uma placa com meio de CZ. Incubar.

3
o
DIA - Observar o crescimento da colnia gigante na placa e a partir
da cultura crescida no tubo, preparar um cultivo em cmara
mida. Incubar

4
o
DIA - Observar a lmina ao microscpio para determinar tipos de
hifas, tipo de esporos assexuados, e se possvel a classe e o
gnero do fungo em estudo

OBSERVAO:
A prtica dever ser encerrada mediante a entrega
do relatrio e do tubo de cultura isolada.


41
ISOLAMENTO DE BOLORES DO MATERIAL MOFADO

MATERIAL
Uma amostra de po, queijo, fruta ou outro material mofado
Placa de Petri com meio de Czapeck (CZ) e Batata-glicose-agar (BGA)
Tubos de ensaio com meio de CZ e BGA

1
o
DIA - Fundir e resfriar os meios de BGA e CZ; em seguida acidificar
com cido ltico a pH 3, 5. Distribuir em placas de Petri.
Esperar solidificar. Com o auxlio de uma ala em agulha
incubar material mofado no centro de cada um dos meios
contidos em placas. Incubar temperatura ambiente durante 5
dias.

2
o
DIA - ( 5 a 7 dias depois) Observar as colnias que cresceram e
escolher colnias tpicas de bolores: filamentosas, grandes, de
cores variadas.
Na encolha da colnia devem ser anotados aspect os
macroscpicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos,
consistncia, brilho, presena de pigmento solvel. Transferir
com ala de platina parte da colnia para um tubo com CZ e
para uma placa com meio de CZ. Incubar.

3
o
DIA - Observar o crescimento da colnia gigante na placa e a partir
da cultura crescida no tubo, preparar um cultivo em cmara
mida. Incubar

4
o
DIA - Observar a lmina ao microscpio para determinar tipos de
hifas, tipo de esporos assexuados, e se possvel a classe e o
gnero do fungo em estudo


OBSERVAO:
A prtica dever ser encerrada mediante a entrega
do relatrio e do tubo de cultura isolada.


42
ISOLAMENTO DE FUNGOS DO ACAR CRISTAL

MATERIAL
Acar cristal
Erlenmeyer com 99 ml de gua estril
Balo com batata-glicose-agar (BGA) acidificado a pH 3, 5
Balo com meio de Czapeck (CZ)
Placas de Petri estreis
Tubos de ensaio com BGA e CZ

TCNICA

1
o
DIA - Pesar 11g de acar e transferir para o Erlenmeyer com gua
estril, agitando bem para dissolver.
Transferir pores de 1 e 2 ml para placas de Petri.
Os meios de cultura CZ e BGA devem ser fundidos, refriados
a 45
o
C e em seguida acidificados com cido ltico a pH 3, 5.

Adicionar os meios de cultura s placas. Deixar esfriar para
solidificar (2 a 3minutos) e incubar temper atura ambiente
durante 5 a 7 dias.



2
o
DIA - (5 a 7 dias depois) Observar as colnias que cresceram e
escolher colnias tpicas de bolores: filamentosas, grandes,
de cores variadas.
Na encolha da colnia devem ser anot ados aspectos
macroscpicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos,
consistncia, brilho, presena de pigmento solvel. Transferir
com ala de platina parte da colnia para um tubo com CZ e
para uma placa com meio de CZ. Incubar.

3
o
DIA - Observar o crescimento da colnia gigante na placa e a partir
da cultura crescida no tubo, preparar um cultivo em cmara
mida. Incubar


43
4
o
DIA - Observar a lmina ao microscpio para determinar tipos de
hifas, tipo de esporos assexuados, e se possvel a classe e o
gnero do fungo em estudo.

OBSERVAO:
A prtica dever ser encerrada mediante a entrega
do relatrio e do tubo de cultura isolada.








44
ISOLAMENTO DE LEVEDURAS DE FRUTA

MATERIAL
Fruta (uva, ma, abacaxi, mamo, caj etc. )
Erlenmeyer com 50 ml de caldo glicosado (CG)
Meio de glicose-agar (GA)
cido ltico
Placas de Petri estreis
Tubos de ensaio estreis
Tubos de ensaio para fermentao com caldo glicosado


TCNICA

1
o
DIA - Acidificar o caldo glicosado com cido ltico a pH 3, 5.
Cortar a fruta com casca e macerar com ajuda de uma faca.
Tranferir para o Erlenmeyer com o meio acidificado, agitar e
incubar temperatura ambiente, durante 48 a 72 horas.

2
o
DIA - Adicionar o meios de cultura s placas. Deixar esfriar em
repouso para solidificar. Com uma ala de platina, depositar
uma gota do caldo na superfcie do meio contido na placa de
Petri e fazer estrias por esgotamento seguindo o esquema
abaixo:





ou ento, com uma ala em L fazer estrias paralelas a partir
da gota depositada na primeira placa e continuando em mais
duas placas do mesmo meio, segundo o esquema a
seguir:


45

Incubar temperatura ambiente por 48 horas.

3
o
DIA - Observar as colnias que cresceram e escolher colnias
tpicas de leveduras.
Na encolha da colnia devem ser anotados aspectos
macroscpicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos,
consistncia, brilho, presena de pigmento solvel. Transferir
com ala de platina parte da colnia para um tubo com GA e
para um tubo com meio de CG. Incubar.

4
o
DIA - Analisar o crescimento no tubo com caldo glicosado e
observar se a levedura fermentativa. Realizar uma
observao in vivo e com colorao simples. Anotar os
aspectos microscpicos do microrganismo em estudo, tais
como: tipo de reproduo (fisso, gemulao, esporulao),
presena de grnulos, de vacolos.

OBSERVAO:
A prtica dever ser encerrada mediante a entrega
do relatrio e do tubo de cultura isolada.
I


46
ISOLAMENTO DE LEVEDURAS DE CALDO-DE-CANA

MATERIAL
Caldo de cana fermentado (24horas)
Meio de glicose-agar (GA)
4 Placas de Petri estreis
Tubos de ensaio estreis
Tubos de ensaio para fermentao com caldo glicosado


TCNICA


1
o
DIA - Adicionar o meios de cultura s placas. Deixar esfriar em
repouso para solidificar. Com uma ala de platina, depositar
uma gota do caldo na superfcie do meio contido na placa de
Petri e fazer estrias por esgotamento seguindo um dos
esquemas abaixo:



Incubar temperatura ambiente por 48 horas.




47
2
o
DIA - Observar as colnias que cresceram e escolher colnias
tpicas de leveduras.
Na encolha da colnia devem ser anotados aspectos
macroscpicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos,
consistncia, brilho, presena de pi gmento solvel. Transferir
com ala de platina parte da colnia para um tubo com GA e
para um tubo com meio de CG. Incubar.

3
o
DIA - Analisar o crescimento no tubo com caldo glicosado e
observar se a levedura fermentativa. Realizar uma
observao in vivo e com colorao simples. Anotar os
aspectos microscpicos do microrganismo em estudo, tais
como: tipo de reproduo (fisso, gemulao, esporulao),
presena de grnulos, de vacolos.


OBSERVAO:
A prtica dever ser encerrada mediante a entrega
do relatrio e do tubo de cultura isolada.


48
PRTICA N 9
OBJETIVOS:

Determinar a densidade celular por turbidimetria
Obter o nmero de clulas por contagem em placa
Confeccionar uma curva de calibrao de uma espcie microbiana


Um cultivo de bactri as ou leveduras em meio lquido, atua como
uma suspenso coloidal, refletindo ou pondo obstculos a passagem da
luz atravs do mesmo. At certo ponto, a luz que foi absorvida ou
refletida proporcional a concentrao de clulas presentes na
suspenso. A t urvao que apresenta um tubo de ensaio contendo uma
cultura em crescimento, provocada pela absoro e reflexo da luz.
Portanto, ao se medir a percentagem de absoro da luz (turbidimetria)
ou a reflexo da luz (nefelometria) se pode estimar a concentra o de
clulas presentes. Ficaremos restritos ao primeiro caso.
Para as medidas turbidimricas da massa celular, podem ser
utilizados instrumentos como um espectrofotmetro ou fotocolormetro.
Na turbidimetria, a capacidade do cultivo para deter a luz, se
expressa como percentagem de luz transmitida, sendo esta percentagem
inversamente proporcional concentrao de clulas. A percentagem da
transmitncia (T) igual a I/I
0
, sendo I
0
, a intensidade da luz incidente
e I, a intensidade da luz transmitida.
Para verificar a relao direta proporcional entre a concentrao
de clulas e a absorbncia da luz (Densidade tica, DO = log I
0
/I),
vamos medir a turbidez de vrias diluies (Figura 3) de uma suspenso
de uma cultura de E.coli e proceder a contagem em placa destas
diluies.


Material

- Microrganismos:

Escherichia coli (bactria)
Saccharomyces cerevisiae (levedura)

- Meios de cultura:

Caldo lactosado
Caldo glicosado

- Equipamentos:

Agitador magntico
Espectrofotmetro


49
- Diversos:

Tubos ou cubetas para o espectrofotmetro
Pipetas de 5ml esterilizadas


Mtodos

- Fazer a diluio das culturas, conforme mostra a figura 3.

- Calibrar o espectrofotmetro, utilizando luz com comprimento de onda
variando entre 500 e 600nm. Colocar no aparelho um tubo contendo 5ml
de meio de caldo lactosado ou caldo glicosado estril. Com este tubo
(branco) o espectrofotmetro ajustado para D. O. igual a zero, ou
transmitncia igual a 100%;

- retirar o branco do aparelho e colocar o tubo da cultura. Fazer a
leitura da D. O. e anotar o resultado. Imediatamente proceder a
contagem em placa, da cultura no tubo que foi feita a leitura no
espectrofotmetro.

- repetir o mesmo procedimento para os demais tubos da cultura diluda,
ajustando sempre o espectrofotmetro contra o branco, a cada leitura,
e agitando bastante o tubo com a cultura;

- para a contagem em placa, dos tubos contendo a cultura de E.coli e S.
cerevisiae fazer diluies at 1x10
- 7
e plaquear em duplicata 1ml das
diluies de 1x 10
- 4
a 1x10
- 7
.



FIGURA 3. Diluio da cultura para leitura no espectrofotmetro





50

Resultados

Anotar na tabela, os resultados das leituras das densidades ticas
e das correspondentes contagens em placas.

Aps obter o nmero de clulas por contagem em placa, das
diluies, relacionar num grfico, os valores da D. O. das diversas
diluies na ordenada, contra os nmeros de microrganismos
correspondentes que se determinou. Assim, obtemos uma curva de
calibrao para o referido microrganismo nas condies do
experimento.

Diluies da cultura
(ml)
Densidade tica
(D. O)
Concentrao celular
(clulas/ml)

1/2

1/4
1/8
1/16
1/32
1/64

PRTICA N 10
OBJETIVOS:
Obter a concentrao de clulas de levedur as pelo uso de cmara
de contagem (cmara de Neubauer)



A contagem direta por microscpio, a mais rpida, e levada a
efeito com a contagem de organismos num volume conhecido da cultura.
Esta enumerao feita com o auxlio de lminas espessas, conhecidas
como cmaras de contagem. As mais comuns so as de Petroff -Hausser,
Neubauer e as de Helber. estas cmaras apresentam uma rea reticulada,
com pequenos quadrados de superfcie conhecida. Fazendo parte do
conjunto, existe uma lamnula que recobre os pequenos quadrados, de
modo que a altura destes lamnula conhecida.

No nosso experimento, as leveduras sero contadas numa cmara
de Neubauer, que apresenta uma rea dividida em quadrados com
1/400mm
2
; a cmara coberta com uma lamnula, deixando uma altura
de 1/10mm, i. . , de cada quadrado lamnula. Assim sendo o volume
que fica acima de cada quadrado de 1/4000 mm
3
.



51
Esta contagem inclui organismos viveis e mortos, sendo
denominada de contagem total de clulas.

Este mtodo de contagem diret a, tem a vantagem de fornecer um
resultado quase imediato, no entanto tem a desvantagem de no se ter
a distino entre clulas vivas e mortas.


Material

- Microrganismo:
Cultura de Saccharomyces cervisiae

- Reagentes:
Soluo salina fisiolgica (0, 85% NaCl)

-Equipamentos:

Microscpio tico comum
Cmara de contagem de Neubauer
Bico de Bunsen

- Diversos:
Pipeta Pasteur


Mtodos

-Adicionar com uma pipeta Pasteur ou similar, uma gota da
suspenso da cultura de levedura sobre a rea ret iculada da cmara;
-colocar a lamnula sobre a gota. Alternativamente, pode -se
colocar primeiro a lamnula, e deixar -se que a suspenso do
microrganismo, que sai da pipeta, escorra por ao capilar sob a
lamnula;
- esperar cerca de dez minutos, at que o material sedimente;
- usando a objetiva de 40-45X, contar as leveduras em cerca de 10
quadrados dispostos em X (ver figura 2).

Resultados

- Calcular o nmero de leveduras/mL, contidas em uma suspenso
utiliza-se a seguinte frmula

Concentrao Celular (leveduras/mL) = n x 25000 x diluio

onde n= nmero de clulas dos quadrados





52
Exemplo:

n = 232

diluio 1:100

Concentrao celular = 232 x 25000 x 100 = 5, 8 x 10
8
clulas/mL



PRTICA 11

OBJETIVO: Determinar uma curva de calibrao para a determinao
da concentrao da levedura Saccharomyces cerevisiae a partir do
fermento prensado.

INTRODUO:

A partir do conhecimento do teor de matria seca em fermento
prensado comercial possvel preparar uma suspenso padro de
leveduras, de determinada concentrao, com bastante confiabilidade.
Atravs de uma srie de diluies convenientes dessa suspenso padro
so obtidas novas suspenses de concentraes conhecidas. Finalmente,
a turbidez provocada no meio pelas diferentes suspenses de leveduras
medida atravs de um instrumento adequado e os valores obtidos so
relacionados com as respectivas concentraes por intermdio de uma
expresso matemtica.

As diluies adequadas so obtidas atravs de tentativas de forma
a abranger um i ntervalo de concentraes que atenda as seguintes
condies:

1
a
. ) Deve haver uma correlao linear entre a concentrao e o
logaritmo da trasmitncia e;

2
a
) Os valores das transmitncias obtidas devem estar situadas na regio
de maior sensibilidade na escala do instrumento utilizado.


TCNICA:

1. Em um copo de Bquer de 50ml pesar, em balana semi -analtica, 2g
de fermento prensado, anotando o valor exato. Diluir em um pouco de
gua e transferir, analiticamente, para um balo de 1000ml.
Completar o volume e homogeneizar;



53
2. A partir da concentrao da suspenso padro escolher os valores
para as concentraes, de forma a cobrir uma determinada faixa de
concentraes;

3. Realizar uma srie de diluies com um conjunto de pipetas e bales
volumtricos adequados. Utilizar como sugesto os valores da tabela
abaixo.

Suspenso
nmero
Conc. da
diluio,
X (g/l)
Fator de
diluio
Modo de
preparo
(ml da susp.
padro)
1 0, 1 20x 25 at 500
2 0, 2 10x 25 at 250
3 0, 3 6, 67x 15 at 100
4 0, 4 5x 20 at 100
5 0, 5 4x 50 at 200
6 0, 6 3, 33x 15 at 50
7 0, 8 2, 5x 20 at 50
8 1, 2 1, 67x 15 at 25

4. Homogeneizar cada suspenso e transferir para um tubo de
espectrofotmetro previamente ajustado ao comprimento de onda de
610 nm.

5. Realizar, pelo menos, duas leituras do valor da absorbncia para
cada concentrao. O espectrofotmetro calibrado antes de cada
leitura, com um branco de gua destilada.

6. Construir um grfico, colocando no eixo das ordenadas os valores da
concentrao X (g/l) e no eixo das abssissas os valore s da
absorbncia (D. O).

7. Fazer uma regresso linear com o auxlio de um programa de
computador ou utilizando o mtodo dos mnimos quadrados.

8. Calcular o coeficiente de correlao, r, e determinar o intervalo de
concentraes, X
1
X
2
, no qual a expresso vlida.

Observao: A curva de calibrao obtida pelos pontos descritos
vlida apenas para o fermento prensado utilizado na sua confeco.


PRTICA 12

OBJETIVOS:

Avaliar o crescimento de um microrganismo em diferentes meios de
cult ivo;


54
Confeccionar a curvas de crescimento celular, utilizando o mtodo
turbidimtrico;
Calcular o tempo de gerao (G )e a velocidade especfica mxima
de crescimento (
mx
) e a produtividade celular (P) em cada meio de
cultivo.

INTRODUO:

O crescimento microbiano pode ser definido em termos, tanto da
massa, como tambm do nmero de clulas. Em condies de
crescimento exponencial, massa celular e nmero de clulas
permanecem proporcionais, embora a relao entre estes dois valores
possa variar em determinadas condies de cultivo. O crescimento de
um microrganismo em diferentes meios de cultivo, por exemplo, pode
ser avaliado pela determinao da massa celular que, por sua vez, pode
ser medida indiretamente pela turvao de uma suspenso.
A evoluo do crescimento pode ser avaliada utilizando um
cultivo em batelada em condies de incubao controladas. Com
leituras da densidade ptica (absorbncia) de uma srie de amostras
retiradas a intervalos de tempo regulares, e com auxlio da curva
padro de calibrao, possvel confeccionar uma curva de
crescimento relacionando a concentrao celular (ordenada) com o
tempo de cultivo (abcissa). Nesta curva so, ento, identificadas as
diferentes fases do crescimento microbiano.
Durante a fase exponencial de crescimento pode-se ento
determinar o tempo de gerao (G) e a velocidade especfica mxima
de crescimento (
MX.
).
Pode-se ainda determinar a produtividade celular (P)que a
relao entre a variao da concentrao celular pela variao do tempo
de cultivo. Este valor dever ser determinado pela seguinte equao:

P= (X
f
- X
o
)/(t
f
- t
o
) )

Onde: X
o
= Concentrao celular inicial, (g/l)
X
f
= concentrao celular final , (g/l)
t
f
= tempo final, (h)
t
o
= tempo inicial, (h)


MATERIAL

- Microrganismo
Saccharomyces cerevisiae

- Meios de cultura
Caldo nutritivo suplementado com 1% de acar (glicose, frutose e
sacarose)

- Equipamentos:


55
Espectrofotmetro
Mesa agitadora (rumbei ra)
Balana semi -analtica

- Diversos:
Cubetas do espectrofotmetro
Tubos de ensaio estreis
3 Erlenmeyers, 1000ml
Pipetas, 10ml

MTODOS

1. Preparar 1, 5 litros de caldo nutritivo, distribuir 500ml em 3
Erlenmeyers de 1000ml de capacidade. Adicionar no primeiro 5g de
glicose, no segundo 5g de sacarose e no terceiro 5g de frutose,
homogeneizar e esterilizar a 121
o
C por 15 minutos. Deixar esfriar;

2. Retirar uma amostra de 5-10ml de cada meio para servir como um
branco;

3. Colocar os Erlenmeyers na balana semi -analtica e inocular
esterilmente cerca de 0, 2g a 0, 4g do microrganismo Saccharomyces
cerevisiae (fermento prensado);

4. Retirar 3ml de amostra com uma pipeta estril, imediatamente aps
a inoculao, correspondente, portanto, ao tempo zero. Efetuar a
leitura da Absorbncia (ou densidade ptica). Anotar o resultado;

5. Colocar os Erlenmeyers na mesa agitadora, tendo o cuidado de fix -
los bem. Ligar a agitao a 9000 rpm. Deix-los sob agitao durante
todo o cultivo;

6. Retirar amost ras de 3ml a intervalos de 1 hora, at que se observe
um mnimo de trs valores idnticos, ou muito prximos, de
densidade ptica (DO). Anotar os resultados;

7. Construir um grfico para cada meio de cultivo, colocando no eixo
das ordenadas os valores do tempo (h) e no eixo das abcissas
concentrao X (g/l);

1. Calcular a velocidade especfica mxima de crescimento (
mx
) o
tempo de gerao (G ) e a produtividade celular ( X/t) em cada
meio de cultivo;

1. Comparar os resultados obtidos e tirar concluses a respeito do meio
mais adequado ao crescimento.





56

Modelo de registro tabular
Meio de Cultivo:
Tempo
(h)
Densidade
ptica
(DO)
Concentrao
X(g/l)
0
1
2
3
4
5
6
7
8