Universidade Tecnológica Federal do Paraná

Campus Campo Mourão

Coordenação de Alimentos
Disciplina de Microbiologia
Profa. Márcia R. F. G. Perdoncini

AULA PRÁTICA n°

Preparo de materiais e vidrarias para

esterilização em autoclave.

Figura 1. Fita adesiva para autoclave

INTRODUÇÃO

O acondicionamento correto de materiais

e de vidrarias é de vital importância para a
esterilização eficiente em autoclave. O sucesso
de análises depende da obtenção de materiais
livres de contaminações iniciais, a fim de que se
possa determinar apenas o microrganismo
presente em determinada amostra. Assim,
pipetas, placas de Petri, tubos de cultura e
demais instrumentos usados em microbiologia
devem estar corretamente embalados, para que,
depois de esterilizados, possam ser guardados
sem que sofram nenhum tipo de contaminação
subseqüente.
Placas e pipetas devem ser
acondicionadas em papel de embrulho, ou em
papel Kraft, e identificadas antes da esterilização.
Tubos de cultura e balões de fundo chato com
meio de cultura devem possuir um tampão de
algodão obtido por meio da técnica de
“embuchamento”. Em seguida, devem ser
cobertos por uma coifa, feita do papel Kraft (de
10 cm por 10 cm), que será amarrado com um fio
sobre a boneca de gaze.
Para testar a eficiência da esterilização,
poderá ser realizado um processo químico com
uma fita própria para autoclave e um processo
biológico, com uma ampola com Bacillus
stearothermophilus, bastonete esporulado muito
resistente ao calor. Após a esterilização, a
ampola com o microrganismo é incubada em
estufa regulada a 37°C, por 24 horas. Se não
houver mudança na cor inicial (rosa) da ampola,
a esterilização foi eficiente. Caso ocorra mudança
da cor inicial, de rosa para amarelo, a
esterilização não foi eficiente. A mudança da cor
inicial rosa para amarelo indicará ocorrência de
fermentação de carboidratos existentes no líquido
contido na ampola, demonstrando, portanto, que
o microrganismo continua vivo.
a) b)
Figura 2. Indicadores biológicos: a) amostra de
Bacillus stearothermophilus; b) amostra de
Geobacillus stearothermophilus.
Compreende-se por esterilização a
completa destruição de qualquer microrganismo
vivo. Essa destruição pode ser realizada pelo
chamado controle de microrganismos, sendo que
o mais freqüentemente usado é o que utiliza o
calor como agente. O emprego de calor se faz
por meio de flambagem e estufa (calor seco) e de
água fervente, autoclavagem e tindalização (calor
úmido).
O calor seco provavelmente exerce a
maioria de seus danos pela oxidação das
moléculas. O calor úmido destrói os
microrganismos principalmente pela
desnaturação protéica, pela presença de
moléculas de água, que ajudam a romper as
pontes de hidrogênio, e outras interações fracas
que mantêm as proteínas em suas conformações
tridimensionais, além de romperem membranas
lipídicas.
CALOR SECO

O calor seco (como forno ou estufa)

penetra nas substâncias mais lentamente que o
calor úmido (vapor). É geralmente, usado para
esterilizar objetos de metal e de vidro, e é o único
meio satisfatório para esterilizar óleos e pós. Os b)
objetos são esterilizados por calor seco quando
submetidos a 171°C, por 1 hora, a 160°C, por 2
horas ou mais, ou a 121°C, por 16 horas ou mais,
dependendo do volume.
Uma chama aberta (flambagem) é a forma
de calor seco usada para esterilizar, pela
incineração, alças de inoculação e bocas dos
tubos de cultura e para secar o interior de
pipetas. Quando os objetos forem flambados no
laboratório, deve-se evitar a formação de cinzas
flutuantes e aerossóis (gotículas liberadas no ar).
Essas substâncias podem se constituir em um
meio de espalhar agentes infecciosos, se os
organismos presentes não forem mortos pela
incineração como pretendido. Por essa razão, c)
incineradores de alça especialmente
desenhados, com gargantas fundas, são
freqüentemente usados para esterilizar alças de
inoculação.

CALOR ÚMIDO

O calor úmido é um agente físico

amplamente usado. A água fervente destrói
células vegetativas da maioria das bactérias e
dos fungos e inativa alguns vírus. Entretanto, não d)
é eficiente na destruição de todos os tipos de
esporos.
O processo de autoclavagem utiliza água
aquecida sob pressão. Seu ponto de ebulição é
elevado e, assim, temperaturas acima de 100°C
podem ser alcançadas. Isso é normalmente
obtido por meio de uma autoclave com pressão
de 15lb/pol2 (aproximadamente 1 atm) mantida
por 15 a 20 minutos, dependendo do volume da
carga. À essa pressão, maior do que a
atmosférica, a temperatura alcança 121°C, que é
alta o suficiente para matar os esporos, como
também organismos vegetativos, e para romper a
estrutura dos ácidos nucléicos nos vírus. e)

a)

Figura 3. Autoclave vertical. a) autoclave fechada

e aberta; b) câmara; c) Manômetro e válvula de
segurança; d) resistência; e) registro de saída de
água.
 • Embrulhá-las uma a uma, identificando-as
de acordo com as orientações do
professor.
- Tubos de ensaio e balões de fundo chato
• Cortar um pequeno pedaço de gaze e
colocar na boca de um tubo de cultura;
• A seguir, colocar algodão até obter um
tampão firme, mas não muito apertado;
• Repetir o procedimento para o balão de
fundo chato, colocando a coifa com papel
Kraft;
• Levar todo o material preparado para o
local da esterilização.

B) Esterilização em autoclave
• Verificar se a água da autoclave foi
trocada;
• Observar o nível da água, que
Figura 4. Ciclo de esterilização. deve estar até 1cm abaixo da
cruzeta;
Na tindalização, o material é submetido a • Colocar o cesto da autoclave;
três sessões de exposição a vapor de 100°C, • Colocar todo o material a ser
durante 20 a 45 minutos; durante 45 minutos; e esterilizado na parte superior do
durante 20 a 45 minutos, com um tempo de cesto, prendendo com fita para
repouso entre elas de 24 horas. Consegue-se a autoclave, uma ou mais ampolas
esterilização visto que os esporos germinam de Bacillus stearothermophilus, de
entre duas sessões e depois são destruídos. acordo com a capacidade da
Essa técnica é usada para soluções açucaradas autoclave;
ou que contenham gelatina. • Fechar a tampa, apertando os
manípulos em cruz;
OBJETIVOS • Ligar a autoclave na potência
máxima e abrir o registro (válvula
- Aprender a preparar materiais de forma de escape);
correta para esterilização; • Aguardar a saída do vapor por 3 a
- Observar o funcionamento de uma 5 minutos, fechando o registro
autoclave. passado esse tempo;
• Alcançada a temperatura de
MATERIAIS trabalho (121°C), colocar a chave
na posição média;
Placas de Petri, pipetas, balão de fundo chato;
• Marcar o tempo, que deverá ser de
papel de embrulho ou papel Kraft; pincéis para
15 a 30 minutos, dependendo do
marcação; fita para autoclave; tesoura; algodão e
material;
gaze, tubos de cultura.
• Terminado o tempo de
esterilização, desligar a autoclave
PROCEDIMENTO
e deixar que o ponteiro do
A) Preparação de vidraria para manômetro atinja a posição zero;
esterilização • Abrir o registro aos poucos e
- Placas de Petri: aguardar a saída do vapor da
autoclave, de maneira que ele seja
• Separar as placas limpas e secas;
escoado completamente;
• Embalar as placas (no mínimo quatro e no
• Em seguida, abrir os manípulos em
máximo dez) para facilitar a estocagem;
cruz e retirar os materiais,
• Colocar as placas no centro do papel e
colocando-os em estufa de
começar a embrulhá-las firmemente, para
secagem, e incubando-os a 100°C
evitar a absorção de umidade em
por 30 minutos. Colocar também a
excesso; fechar sempre com fita adesiva
ampola de Bacillus
para autoclave.
stearothermophilus na estufa
- Pipetas:
bacteriológica a 37°C por 18
• Colocar uma pequena rolha de algodão no
horas.
bocal de cada uma das pipetas;
Importante:
Material Contaminado:
- Não abrir o registro antes que o manômetro
atinja a posição zero, para evitar que o material
esterilizado fique muito molhado e que os papéis
que o envolvem se rasguem;
- Nunca abandonar o local de esterilização,
conferindo sempre a temperatura da autoclave, e
evitando a quebra de materiais e o RISCO DE
EXPLOSÃO.
EXERCÍCIOS DE FIXAÇÃO
1. O que indica a mudança de cor da ampola com
Bacillus stearothermophilus?
2. Descreva o procedimento necessário para
esterilização de materiais em autoclave.
3. Por que se deve sempre esperar que a
autoclave escoe todo o vapor antes de se
proceder à abertura da tampa?
• Todo o material contaminado, incluindo os
meios de cultura onde foi submetido o
crescimento microbiano e demais
utensílios que tenham entrado em contato
com os microrganismos, principalmente
os patógenos, devem ser submetidos à
esterilização em autoclave a 121oC por 30
minutos, observando os seguintes
cuidados:
1. Afrouxar as tampas de todos os
frascos com tampa de rosca;
2. Adicionar água ou solução detergente
aos estojos de descarte de pipetas,
para amolecer os resíduos e facilitar a
posterior remoção;
3. Após passar por este processo de
esterilização, os resíduos contidos nas
vidrarias ou em outros materiais
podem ser descartados.

4. Como é o processo de funcionamento de uma

autoclave?

REFERÊNCIAS

OKURA, M. H. & RENDE, J. C. Microbiologia-

roteiros de aulas práticas. São Paulo: Tecmedd,
2008.

NOTA:

DESCONTAMINAÇÃO E DESCARTE DE
RESÍDUOS

Material limpo
• Toda a vidraria nova deve passar por um
tratamento de limpeza, pois podem estar
presentes esporos resistentes
provenientes do material de embalagem;
• As vidrarias devem ser mergulhadas em
água destilada, enxaguadas e submetidas
a testes de pH, antes de serem utilizadas;
• Outro método também utilizado é a
fervura da vidraria em solução detergente,
causando assim a lise dos organismos;
• Proceder ao resfriamento e lavagem
completa com água destilada;
• Tampas de plástico ou borracha, tubos de
roscas ou outros frascos, devem passar
por um tratamento para a remoção de
resíduos tóxicos: mergulhar em água
destilada, autoclavar a 121oC/15 minutos
e enxaguar com água destilada. Repetir
processo;