INTRODUÇÃO ÀS

CIÊNCIAS
BIOLÓGICAS
GUIA DO TRABALHO
LABORATORIAL 4 (TL4)

Área científico-pedagógica de Ciências Biológicas

Fevereiro 2023

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TL4. A diversidade microbiana no mundo que nos rodeia
Introdução
Os microrganismos formam um grupo diversificado de organismos microscópicos que
existem como células únicas ou em colónias, dispersos em grande número em toda a biosfera.
Representam, aproximadamente, 60% da biomassa global. Com o crescimento das
tecnologias genómicas tem sido possível compreender o papel essencial que os micróbios
desempenham no equilíbrio entre saúde e doença no Homem, sendo crescentes os reportes
que associam a disbiose (alterações à composição microbiana dita “normal”, ou seja, mais
frequente em indivíduos saudáveis) a doenças mais ou menos graves. De um ponto de vista
aplicado, muitos processos industriais são hoje conduzidos por microrganismos como seja a
produção de fármacos (por exemplo, muitos antibióticos ou a insulina sintetizada por
microrganismos genéticamente modificados, entre outros), a produção de produtos
fermentados (como o vinho, a cerveja, o pão ou os iogurtes, entre outros), a produção de
bioenergia (como por exemplo o bioetanol ou o biogás/biometano), a síntese de enzímas com
interesse comercial (por ex., exploradas nas indústrias alimentar, biofarmacêutica, têxtil ou
de materiais de limpeza), a síntese de poliésteres com características de bioplásticos
(polihidroxialcanoatos, PHAs), etc. Muitos microrganismos com interesse industrial e
comercial têm sido encontrados em ambientes naturais, como por exemplo solo, água, lamas,
árvores, materiais de origem vegetal, entre outros.
No TL4, iremos realizar procedimentos laboratoriais que têm como objectivo familiarizar
os alunos com aspectos introdutórios da metodologia experimental associada aos
laboratórios de Microbiologia, em particular focado na deteção e caracterização de
comunidades microbianas a partir de amostras fornecidas pelos alunos. Neste contexto, serão
realizados procedimentos básicos de preparação de meios de cultura sólidos e líquidos,
esterilização de materiais na autoclave, manipulação de micróbios em condições de assépsia,
e isolamento de colónias de bactérias e fungos em diferentes meios sólidos.
Assim, o TL4 envolverá as três partes principais indicadas na tabela seguinte
(procedimentos experimentais descritos nas páginas indicadas):

Procedimento experimental Págs.

TL4-A) Preparação de meios de cultura líquidos e sólidos, inoculação de 3-6

meios de cultura e repicagem de culturas
TL4-B) Isolamento e enumeração de colónias de bactérias e fungos a 6-15
partir de amostras ambientais, e efeito de agentes antimicrobianos no
crescimento microbiano
TL4-C) O mundo microscópico que habita a superfície da nossa pele: 15-17
isolamento de colónias microbianas e efeito da lavagem ou desinfeção
das mãos

Notas sobre Higiene e Segurança em Laboratórios de Microbiologia

Para além de todas as regras de segurança que se devem observar em qualquer laboratório,
ao trabalhar com micróbios é fundamental garantir que as culturas em estudo não são
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contaminadas por microrganismos do ambiente e também que os microrganismos em estudo
não contaminam o ambiente. Dessa forma, é ESSENCIAL:
 Usar SEMPRE bata de laboratório;
 Lavar as mãos antes e após a realização de uma aula;
 Para prevenir acidentes por queimadura durante a utilização do bico de Bunsen,
deve manter o corpo a uma distância adequada da chama, apanhar o cabelo, não se
debruçar por cima da chama e evitar tocar nas zonas quentes do material flamejado.
 Não abrir as placas de Petri contendo microrganismos sem ser em condições de
assépsia (garantidas pela manipulação junto da chama do bico de Bunsen ou na
câmara de fluxo laminar);

- não abra as placas de Petri na ausência de cuidados de assépsia

 Se suspeitar de derramamento de cultura de células nas mãos ou na roupa, estas
devem ser lavadas com sabão azul e branco e água corrente ou desinfectadas com
solução de etanol a 70% (v/v). No último caso, tenha cuidado em manter-se afastado
do bico de Bunsen aceso porque o alcool etílico é muito inflamável;
 Material sujo com células viáveis deve ser sujeito a tratamento de
descontaminação (portanto, não é para despejar no lavatório nem para colocar nos
caixotes de lixo normais). Os sobrantes de culturas com micróbios são colocados para
esterilizar na autoclave, e os materiais que contactam com culturas são colocados nos
recipientes contendo lixívia que estão disponíveis nas estações de trabalho de cada
grupo.

TL4-A. Preparação de meios de cultura sólidos e líquidos, inoculação de meios

de cultura e repicagem de culturas
1. Preparação de meios de cultura sólidos e líquidos
1.1. Prepare 500 mL de uma solução com a composição indicada (num copo ou num frasco
Schott com capacidade de 500 mL ou 1 L):
“Tryptic Soy Broth” (TSB) comercial (Difco) 30 g/L
Água desionizada q.b. (para o volume pretendido)
(pHfinal ~7.3)
Nota: “Tryptic soy” é um pó constituido por mistura de aminoácidos e pequenos péptidos
resultantes da digestão enzimática de caseína do feijão de soja, suplementada com glucose,
NaCl e fosfato de potássio. Quando dissolvido em água com a concentração descrita acima
forma um caldo (“broth”) ou meio de cultura líquido.

1.2. Para preparar meio líquido TSB contido em balão Erlenmeyer:

a) Coloque 25 mL da solução preparada em 1.1 no interior de um balão Erlenmeyer com

capacidade de 100 mL, e etiquete o balão com a designação do meio (TSB);

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b) Tape o balão com uma rolha construida com gaze e algodão cardado e folha de alumínio;
c) Esterilize na autoclave a 121°C (1 atm), durante 15 minutos;
d) Deixe arrefecer e guarde no frigorifico (4 ºC) até ser usado.
Nota: O meio líquido TSB a usar na parte 2.1. deste trabalho foi preparado deste modo.

1.3. Para preparar meio de cultura sólido TSA em placas de Petri:

(Nota: meio TSA  meio TSB agarizado)
a) Aos 475 mL de meio líquido sobrante (contidos em frasco Schott de 500 mL ou 1 L), adicione
uma quantidade adequada de agar (de modo a que a concentração final de agar seja 20 g/L)
e uma barra magnética;
b) Misture bem num agitador magnético (sem fazer muitas bolhas de ar), tape o frasco e
esterilize na autoclave, a 121°C (1 atm) durante 15 minutos;
c) Após esterilização, deixe arrefecer homogeneamente (em agitador magnético) até cerca de
50 °C;
d) Entretanto, coloque em cima da bancada cerca de 18 placas de Petri esterilizadas e escreva
com uma caneta, na base (verso) da placa de Petri, a designação do meio de cultura agarizado
que está a preparar (neste caso, TSA);
e) Em condições de assépsia (por ex. junto à chama do bico de Bunsen ou numa câmara de
fluxo laminar) verta porções adequadas do meio ainda liquefeito (~50ºC) nas placas de Petri
e tape-as imediatamente;
e) Deixe o meio solidificar (arrefecimento até à temperatura ambiente) e inverta as placas;
guarde-as no frigorifico (a 4 ºC), até serem usadas.
Nota: As placas de Petri de meio TSA a usar na parte 2.2. deste trabalho bem como nos TL4-B
e TL4-C foram preparadas deste modo.

2. Inoculação de meios de cultura

Cada grupo receberá uma placa de Petri com meio sólido na superfície do qual foram
crescidas colónias de um certo microrganismo específico (por ex., de uma das espécies
bacterianas Escherichia coli ou Sphingomonas elodea), que correspondem a culturas puras
desse microrganismo.
As transferências de culturas de um meio de cultura para outro (fresco) devem ser
realizadas em condições de assépsia (junto a uma chama de Bico de Bunsen ou na câmara de
fluxo laminar), recorrendo a uma ansa de repicagem. O filamento metálico da ansa de
repicagem deve ser flamejado na chama do bico de Bunsen (i.e., levado ao rubro ou
incandescência) antes de ser utilizado, de forma a ficar esterilizado. No final, após a
inoculação do meio de cultura e antes de colocar a ansa no suporte ou sobre a bancada, esta
também deve ser esterilizada na chama.
2.1. Inoculação de meio líquido e observação de crescimento microbiano

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a) Pegue numa ansa de repicagem e coloque o filamento metálico na chama do bico de Bunsen
até ficar incandescente (Atenção: tenha cuidado para não se queimar nem queimar roupa
ou cabelo)
b) Deixe arrefecer o filamento da ansa ao ar, na região protetora por baixo da chama do bico
de Bunsen, e sem que o filamento toque em qualquer supefície. Para assegurar o
arrefecimento adequado do filamento metálico, enterre-o numa zona sem colónias do meio
de cultura sólido, antes de passar ao passo seguinte;
c) Com o filamento metálico esterilizado e arrefecido, transfira uma colónia da cultura
fornecida em placa de Petri para o meio líquido TSB preparado em 1.2 (inoculação do meio
de cultura).
Para tal, deve manter todo o material na zona protectora por baixo da chama e proceder do
seguinte modo: (i) abra a placa de Petri, (ii) retire uma colónia com o filamento metálico da
ansa, (iii) flameje o gargalo de vidro do balão Erlenmeyer na chama do bico de Bunsen, (iv)
introduza o filamento da ansa com a colónia no interior do meio líquido, e (v) agite o filamento
dentro do meio líquido, para libertar células do microrganismo que ficarão em suspensão no
meio;
d) No final, flameje novamente o gargalo do balão, tape o balão com a rolha, e esterilize o
filamento metálico da ansa na chama antes de a colocar no suporte.
e) Registe, através da escala qualitativa indicada na caixa abaixo, a turbidez da suspensão
celular inicial (correspondente ao tempo zero). Fotografe a cultura obtida, para servir de
termo de comparação na observação a fazer após a incubação da cultura;
g) Incube a cultura num incubador à temperatura de 30 ºC durante a noite (entre 15 e 24 h).
h) Após o período de incubação, observe a suspensão de células e registe, através de
fotografia e da escala qualitativa indicada, a turbidez indicadora da concentração de células
(densidade celular) na suspensão celular. Conclua quanto à ocorrência (ou não) de
crescimento da cultura microbiana (use como termo de comparação, a fotografia da cultura
correspondente ao tempo zero de incubação).
i) Registe e interprete os resultados na “Ficha de registo de resultados_relatório” fornecida
à parte.

Código para avaliação qualitativa do crescimento microbiano:

+ pouco turvo (densidade celular baixa)
++ moderadamente turvo / translúcido (densidade celular moderada)
+++ muito turvo / opaco (densidade celular alta)

2.2. Repicagem de culturas em meios sólidos frescos – técnica das estrias

Este tipo de procedimento serve para manter, nos laboratórios de Microbiologia, culturas
com células viáveis de microrganismos durante períodos relativamente curtos (dias ou
semanas). Consiste no isolamento de colónias ao longo de estrias/riscados, na superfície do
meio sólido contido em placa de Petri. É usada uma ansa de repicagem (como em 2.1) para
transferir as células de uma colónia para a superfície de meio sólido fresco adequado ao
cultivo do microrganismo em causa.

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a) Esterilize o filamento metálico da ansa de repicagem e arrefeça-o, como indicado em 2.1;
b) Use a ansa esterilizada para transferir uma colónia da cultura fornecida em placa de Petri
para a superfície do meio de cultura sólido fresco, espalhando as células num dos lados do
meio sólido (como indicado no circulo do lado esquerdo na figura abaixo);

c) Espalhe essas células sobre a área restante de

meio sólido disponível, traçando estrias segundo o
esquema indicado à direita na figura ao lado
(Nota: Após cada conjunto de estrias/riscados,
antes de alterar a direção, o filamento metálico da
ansa deve ser esterilizado na chama (e arrefecida
no meio sólido). Pretende-se, em cada conjunto de
estrias, separar mais as células que ficaram sobre
as estrias/riscados imediatamente anteriores);
d) Após inoculação do meio, escreva na base
(verso) da placa de Petri o nome do microrganismo e a data, e incube a placa de Petri a uma
temperatura e durante um período de tempo adequado (por exemplo, 30 ºC/48h; as
condições de incubação adequadas dependem de cada microrganismo específico);
e) Observe as colónias formadas após o período de incubação:
- verifique se o objectivo de isolar colónias ao longo das estrias foi bem sucedido.
- verifique se as colónias isoladas são semelhantes e com as características morfológicas
esperadas para o microrganismo específico que repicou (por exemplo, colónias cremes e
translúcidas para E. coli ou circulares, opacas e amarelas para S. elodea).
Nota: se aparecerem colónias com morfologia diferente da esperada para o microrganismo
em causa, significará que existem microrganismos contaminantes sobre o meio sólido.

TL4-B. Isolamento e enumeração de bactérias heterotróficas e fungos a partir

de amostras ambientais, e efeito de agentes antimicrobianos no seu
crescimento
Introdução
Os microrganismos, especialmente os procariotas, apresentam uma elevada versatilidade
fisiológica e bioquímica que possibilita a sua rápida adaptação a variações ambientais mais ou
menos extremas. Resulta daí que, para além da grande diversidade que podemos encontrar
entre diferentes espécies de micróbios, existe também uma importante diversidade que se
observa mesmo dentro dos diferentes indivíduos duma mesma espécie (que quando são
suficientemente diferentes do ponto de vista genético podem originar diferentes estirpes
dessa espécie). A descrição dos micróbios encontrados em diferentes ambientes é, pois,
crucial para encontrar microrganismos com actividades interessantes, para uma compreensão
adequada dos principais processos biológicos que ocorrem na biosfera e, claro, para uma
intervenção adequada que procure resolver problemas emergentes.

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 Existem variadas abordagens que visam estudar a ecologia microbiana na natureza. O
método tradicional é o isolamento e posterior cultivo (crescimento) em meios de cultura
adequados, genéricamente designado por método dependente de cultivo (“culture-
dependent method”). Neste método, cada colónia formada sobre meios de cultura sólidos
resulta da proliferação celular (“cultivo”) de uma unidade formadora de colónia (UFC), que
pode ser uma célula viável ou um esporo (dependendo do microrganismo específico).
No entanto, a obtenção de resultados a partir desta abordagem requere uma janela
temporal que pode ser grande, dependendo da taxa de crescimento dos micróbios isolados.
Acresce que este método tem uma outra limitação importante, na medida em que somente
podem ser detectados e cultivados microrganismos chamados “cultiváveis”. De facto, os
microbiólogos estimam que cerca de 50 a 99% das unidades celulares (células ou esporos) dos
microrganismos presentes em amostras ambientais, clínicas ou no microbiota do nosso corpo
(% variável de amostra para amostra), podem existir num estado chamado “viável mas não-
cultivável”. Isto significa que essas unidades celulares podem estar funcionais nesses habitats
mas não ser capazes de se adaptar às condições artificiais (meios de cultura, temperatura,
etc.) usadas no laboratório, pelo que não serão detectáveis desta forma (i.e., podemos “não
dar por eles”). As razões subjacentes à sua existência não estão ainda completamente
esclarecidas, mas pensa-se que esses microrganismos tenham necessidades nutricionais e
ambientais que não sejam satisfeitas com os meios e condições de cultivo padrão no
laboratório, ou que dependam, na Natureza, de interações metabólicas com outros micro- ou
macro-organismos que não são possíveis ou fáceis de imitar num contexto de laboratório
Mais recentemente têm vindo a ser desenvolvidas abordagens menos morosas que
assentam na utilização de técnicas moleculares para a deteção/caracterização (mais ou menos
exaustiva) do DNA genómico contido na comunidade microbiana que compõe a amostra. São
exemplos destas abordagens a amplificação por PCR, a hibridação de fluorescência in situ (ou
FISH – fluorescent in situ hybridization) ou a metagenómica, que são colectivamente
designados por métodos independentes de cultivo (“culture-independent method”). Estes
métodos têm a vantagem importante (face ao método tradicional de cultivo) de permitirem
analisar a totalidade das comunidades microbianas nas amostras, incluindo tanto
microrganismos “cultiváveis” como “não-cultiváveis”. Embora mais específicas na
caracterização das comunidades microbianas, estas técnicas requerem o uso de equipamento
especializado (como por exemplo, microscópios de fluorescência, termocicladores,
espectrómetros ou até sequenciadores de DNA) e a existência de conhecimentos e
competências prévios em microbiologia por parte dos operadores.
Tendo em conta o carácter inicial desta UC utilizaremos o método de cultivo para
caracterizar do ponto de vista microbiológico, através do isolamento de colónias de bactérias
e fungos em diferentes meios de cultura sólidos, um conjunto de amostras que serão trazidas
pelos alunos.

1. Actividades a realizar antes da aula laboratorial:

1.1. Num Cada grupo deverá obter o seu kit de recolha de amostra no laboratório
dos dias de Ciências Biológicas do IST (piso 6, Torre Sul, lab. em frente ao elevador).
anteriores Os kits estarão dispostos à entrada e identificados de forma visível.
à aula Cada kit é composto por 1 cotonete e dois tubos Falcon de 15 mL estéreis
num saco com “zip-lock”: um dos Falcons vai conter um cotonete para

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 fazer um “swab” numa superfície sólida* à escolha e o outro estará vazio
e servirá para a recolha de uma amostra ambiental**;

*Exemplos de superfície sólida: telemóvel, botão do elevador, maçaneta,

corrimão, etc.. O “swab” com o cotonete permitirá recolher unidades
celulares de microrganismos presentes sobre a superfície (directamente
ou aderentes ao pó aí depositado).
**Exemplos de amostra ambiental que pode recolher: solo (diversos),
lama ou sedimento em ambiente aquático (por ex., na margem de rio,
lago), marinho (região costeira) ou misto (estuário), folhas em
decomposição (floresta; bosque), etc
1.2. No Cada grupo deve proceder à recolha das amostras.
dia da No caso do swab com o cotonete para a recolha de amostra, passe a parte
aula de algodão várias vezes sobre a superfície sólida à sua escolha, tendo o
cuidado de não tocar com a ponta do cotonete nas suas mãos (Nota: deve
passar toda a área disponível do algodão sobre a superfície).
Após o swab volte a colocar o cotonete no tubo Falcon esterilizado.

Para a recolha da amostra ambiental, pode usar uma colher/espátula

previamente desinfectada (p.ex. passando um pouco de solução alcoólica
70% (v/v) ou alcool-gel na superfície e deixando secar ao ar, antes da
recolha). Coloque o material no Falcon vazio (Nota: cerca de 10% do
volume do tubo Falcon, correspondendo a cerca de 2 mL, serão
suficientes).

Volte a colocar os dois tubos Falcon no saco e deixe no frigorífico até à

hora da aula (pode vir deixar no laboratório de Ciências Biológicas caso
necessite).

2. Material necessário:
 Kit de recolha de amostra (descrito em 1., acima);
 Placas de Petri com meio TSA (“Tryptic soy broth” agarizado; ver composição e preparação
no guia do TL4-A).
O meio TSA é nutricionalmente rico e tem pH aproximadamente neutro, suportando o
crescimento preferencial e rápido (em 24-48 h) de uma vasta diversidade de unidades
celulares de bactérias heterotróficas. Este meio não é, contudo, muito selectivo visto que
também podem crescer outros tipos de microrganismos heterotróficos tais como alguns
fungos, embora com um crescimento mais lento do que o observado para as bactérias (i.e.
as suas colónias somente aparecerão após 5-7 dias de incubação, dependendo da
temperatura);
 Placas de Petri com meio PDA + CT (“Potato Dextrose Agar” suplementado com 10 mg/L
de clortetraciclina) (ver composição e preparação no anexo A).
O meio base PDA (“Potato dextrose agar”) suporta preferencialmente o crescimento de
fungos por causa do pH moderadamente ácido (pH~5,5) e do conteúdo nutricional baixo
(maioritariamente amido de batata), o que contribui para reduzir a competição de
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 bactérias. A adição do antibiótico clortetraciclina (antibiótico bacteriostático de largo
espectro que inibe a multiplicação celular de uma grande diversidade de bactérias Gram-
positivas e Gram-negativas) torna o meio selectivo para o isolamento de fungos (como
bolores e leveduras);
 Discos de papel de filtro (diâmetro ~6 mm) esterilizados (na autoclave);
 Soluções stock dos antibióticos ampicilina (2 mg/mL) e gentamicina (0,4 mg/mL) - A
ampicilina (A) é um antibiótico que actua sobre a síntese de peptidoglicano, um
componente essencial na parede celular da maioria das bactérias. A gentamicina (G) actua
sobre os ribossomas bacterianos, inibindo a síntese proteica;
 Solução stock de fluconazole (3,2 mg/mL) - O fluconazole (F) é um agente antifúngico que
actua sobre a síntese de ergosterol, um dos componentes mais importantes na membrana
citoplasmática dos fungos;
 Solução desinfectante de etanol 70% (v/v) – o etanol (E) é um agente antimicrobiano de
largo espectro que contribui para dissolver lípidos e desnaturar proteínas;
 Lixívia (solução de hipoclorito de sódio a 13% (p/v)) – a lixívia (L) é um desinfectante de
largo espectro que causa a oxidação de macromoléculas celulares, tais como lípidos,
proteínas e ácidos nucleícos.
 Solução salina [solução de NaCl a 0,9% (p/v)] esterilizada na autoclave;
 Tubos Eppendorf autoclavados;
 Esferas de vidro autoclavadas;
 Pontas (para pipetas automáticas) esterilizadas na autoclave;
 Contador de colónias

3. Procedimento experimental (no laboratório)

(pode consultar a Fig.1 para uma representação esquemática do procedimento a utilizar,
incluindo no manuseamento de pipetas automáticas)

NOTA IMPORTANTE: As operações indicadas deverão ser realizadas em condições

de assépsia, junto à chama do bico de Bunsen ou numa câmara de fluxo laminar
(a(o) docente dará instruções mais concretas, durante a aula).

a) Assegure que a superfície da bancada é (ou foi) limpa com papel absorvente embebido
em solução de álcool etílico 70%(v/v) (deixar secar bem ao ar). Traga para junto da sua
estação de trabalho o seu kit de recolha com as amostras.

b) Marque uma das placas de TSA e de PDA+CT (que tem na sua estação de trabalho) com a
designação “Swab” e escreva de que tipo de superfície recolheu a amostra (veja o esquema
na Fig.1 - meio). Inclua o número do seu grupo e turno;
(Nota: estas marcações devem ser feitas no verso/parte de baixo da placa)

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FIGURA 1. Representação esquemática do protocolo experimental associado ao trabalho TL4-B,
incluindo explicação sobre o manuseamento correcto de pipetas automáticas (em cima),
procedimento para deteção (isolamento) de colónias de microrganismos (bactérias ou fungos) a
partir do “swab” recolhido na superfície sólida (ao meio) e procedimento para isolamento do mesmo
tipo de microrganismos a partir da amostra ambiental (por ex., solo) e observação do efeito de
agentes antimicrobianos no seu crescimento (em baixo).

c1) Em condições de assépsia, retire o cotonete do tubo Falcon e faça uma repicagem do
material que recolheu na “cabeça de algodão” sobre a superfície do meio sólido TSA. Para

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fazer a repicagem use o cotonete como se fosse uma ansa e faça riscados nas várias direcções
(em ziguezague), aproveitando a maior área de meio disponível possível.
(nota: Tenha sempre em atenção a zona do algodão que usou para fazer o swab sobre a
superfície onde recolheu a amostra)

c2) Repita o procedimento sobre o meio PDA+CT.

d) Incube as duas placas de Petri a 30 ºC, até aparecerem colónias (pode demorar 2-3-dias)

Nota: Durante a incubação, as placas devem estar em posição invertida (ou seja, com a tampa
para virada para baixo) para evitar que a humidade se deposite sobre a superfície do meio de
cultura durante o crescimento das colónias.

e) Pese o tubo Falcon que contém a amostra ambiental (leve consigo um tubo vazio do mesmo
volume para tirar a tara do tubo). Registe o peso da amostra (em g);

f) Em condições de assépsia, coloque 10 mL de solução salina no tubo Falcon que contém a

amostra ambiental. Agite, usando o vórtex regulado para intensidade máxima, durante cerca
de 30 segundos, para libertar as unidades celulares (células vegetativas e esporos) de
microrganismos adsorvidas às partículas da amostra. Esta será a “suspensão inicial B”. Registe
o volume aproximado de “suspensão inicial” obtida;

g) Em condições de assépsia, coloque uma ponta azul numa pipeta automática P1000 e use-
a para colocar 900 L de solução salina estéril em 3 tubos Eppendorf de 1.5 mL vazios
previamente esterilizados (veja instruções no esquema da Fig.1 em cima). Numere os tubos
como B1, B2 e B3;

h) Agite no vórtex a “suspensão inicial B” contida no tubo Falcon e, usando uma pipeta
automática com a ponta de plástico adequada, transfira 100 L da suspensão para o tubo B1
(corresponde a uma diluição 1:10 do conteúdo inicial; veja o esquema na Fig.1). Agite no
vórtex (intensidade máxima);

i) Transfira 100 L da suspensão contida no tubo B1 para o tubo B2 (corresponde a uma

diluição 1:100 do conteúdo inicial; veja o esquema na Fig.1). Agite no vórtex (intensidade
máxima);

j) Transfira 100 L da suspensão contida no tubo B2 para o tubo B3 (corresponde a uma

diluição 1:1000 do conteúdo inicial; veja o esquema na Fig.1). Agite no vórtex (intensidade
máxima);

k) Verifique que tem na sua estação de trabalho ainda sobrantes 8 placas de meio TSA (para
detectar/isolar as colónias de bactérias heterotróficas da amostra) e 6 placas de meio PDA+CT
(para detectar/isolar as colónias de fungos da amostra) (veja o esquema na Fig.1);

l) Marque duas placas do meio TSA com a designação “Suspensão inicial B” no verso/base da
placa de Petri. Marque, em seguida, duas placas de TSA com “diluição B1/1:10”, duas com

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“diluição B2/1:100” e outras duas com “diluição B3/1:1000”. Inclua o número do seu grupo
e turno, em cada placa de Petri;

m) Repita o procedimento para as 6 placas de PDA+CT (neste caso, para “suspensão inicial
B”, “diluição B1/1:10”, e “diluição B2/1:100”);

n) Agite bem a “suspensão inicial B” no vórtex e, em condições de assépsia, pipete 50 L

para a superfície agarizada de uma das placa de meio TSA que marcou como “Suspensão inicial
B”. Junte cerca de 6-8 esferas de vidro estéreis. Agite bem as esferas sobre o meio sólido,
várias vezes em direções diferentes, mantendo a placa na horizontal sobre a bancada. O
objectivo é espalhar as unidades celulares presentes na suspensão o mais uniformemente
possível sobre a área disponível de meio sólido.

o) Em condições de assépsia, remova as esferas para o recipiente contendo lixívia, para

desinfeção e posterior lavagem (para reutilização);

p) Repita o procedimento para a outra placa de meio TSA que está marcada com “Suspensão
inicial B”;

q) Repita os procedimentos n), o) e p) para as suspensões diluídas B1, B2 e B3 (veja o

esquema na Fig.1);

r) Repita os procedimentos n), o) e p) para a “suspensão inicial B” e as diluições B1 e B2, mas

espalhando sobre o meio PDA+CT (veja o esquema na Fig.1);

s) Agrupe (empilhando) as placas que preparou para cada suspensão celular (se tudo correu
bem deve ter 2 placas TSA e 2 PDA+CT para a suspensão inicial, diluição B1 e diluição B2, e 2
placas TSA para a diluição B3);

t) De cada pilha que fez, retire uma das placas, e coloque o conjunto sobre a bancada, perto
da janela, durante 2-3 dias. Pretende-se assim incubar os meios de cultura com a amostra
ambiental (suspensão inicial e diluições) a uma temperatura próxima da ambiente (~202 ºC)
e exposta ao ciclo natural dia/noite (presença/ausência de luz solar), até ao aparecimento de
colónias.
Não se esqueça de inverter estas placas (ou seja, colocá-la com a tampa virada para baixo)
para evitar que a humidade se deposite sobre as colónias em formação.

u) Observação do efeito de agentes antimicrobianos no crescimento dos microrganismos

(veja o esquema na Fig.1):
Vamos usar as placas sobrantes de PDA+CT e TSA inoculadas com a amostra ambiental para
avaliar a susceptibilidade das comunidades microbianas presentes nas amostras a dois
antibióticos diferentes (a gentamicina e a ampicilina), um antifúngico (o fluconazole) e dois
desinfectantes de largo espectro (o etanol e a lixívia). Para a determinação do efeito de cada
agente sobre o crescimento das populações vamos recorrer ao método da difusão em disco.
Este método baseia-se na capacidade dos compostos presentes no disco se difundirem através
do agar acabando assim por inibir o crescimento, à volta do disco, dos micróbios que sejam

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sensíveis (isto é, impedindo que estes formem colónias). Abaixo encontra uma figura que
representa, de forma esquemática, o modo de funcionamento dos testes em disco para avaliar
a susceptibilidade de microrganismos a agentes antimicrobianos.

Para tal, em condições de assépsia, abra uma das placas TSA que lhe sobrou e disponha
gentilmente 5 discos de papel sobre a superfície do meio de cultura sólido oude espalhou as
suspensões com as amostras. Repita o processo para as outras placas de TSA e para as placas
de PDA+CT.

v) Com uma pipeta automática P10 equipada com ponta amarela esterilizada, coloque 10 L
de cada uma das soluções stock de agentes antimicrobianos fornecidas (ver “2. Material”
acima) sobre cada um dos discos. Na parte de trás das placas coloque as designações A, G, F,
E e L nas áreas correspondentes aos discos para facilitar a identificação de qual o agente
antimicrobiano testado. Coloque todas as placas, em posição invertida, a incubar à
temperatura ambiente, como indicado em t).

x) Após 48-72 h (a combinar com o(a) docente) faça o registo fotográfico das placas de Petri
onde testou o efeito dos agentes antimicrobianos (este registo deverá acompanhar o seu
relatório, na “Ficha de registo de resultados_relatório”);
- não abra as placas de Petri na ausência de cuidados de assépsia

w) Relativamente às placas de Petri onde não aplicou discos (passo t) do procedimento), após
48-72 h de incubação (a combinar com o(a) docente) selecione as placas de Petri de cada meio
de cultura e diluição que têm colónias isoladas e contáveis, i.e. em que o número de colónias
isoladas é superior a 10-15 e inferior a 300-350 (Atenção: estes limites não são muito rígidos,
e a seleção das placas a usar deve ser feita caso a caso).
Conte o número total de colónias nessas placas. Registe e analise os resultados tendo em
conta as orientações indicadas a seguir (em 4.), e complete a ficha “Registo de
resultados_relatório”.
- não abra as placas de Petri na ausência de cuidados de assépsia

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4. Orientação no registo, análise e discussão dos resultados do TL4-B
(Completar a “Ficha de registo de resultados_relatório” fornecida à parte)
a) Nas placas TSA e PDA+CT onde não aplicou discos com agentes antimicrobianos e que têm
colónias isoladas, observe as colónias (através da tampa da placa de Petri), tente distinguir
tipos morfológicos diferentes e descreva a sua morfologia. Para tal pode usar como guia as
designações que se encontram na Fig. 2, para além de outras características fenotípicas como
cor, brilho/mucosidade, etc.

Nota: A presença de maior ou menor número de colónias morfologicamente diferentes em

cada meio de cultura, que poderão corresponder a espécies microbianas diferentes, é
indicador do grau de biodiversidade microbiana na amostra (em termos de microrganismos
“cultiváveis”).

Figura 2. Designações usadas para a descrição da morfologia das colónias microbianas.

b) Tente perceber se alguma(s) dessas colónias possuem características que possam indicar
interesse industrial/comercial do microrganismo, como por exemplo: i) um halo circular à
volta de uma colónia com ausência de crescimento de outras colónias, pode indicar produção
de antibiótico/metabolito antimicrobiano por esse microrganismo; ii) colónia mucosa
(brilhante e alta) pode indicar produção de exopolissacárido (aplicação potencial como
espessante, gel, etc.); iii) colónia colorida pode indicar a produção de pigmento (aplicação
potencial como antioxidante ou corante, para a indústria de materiais, alimentos, etc.).

c) Calcule o número total de Unidades Formadoras de Colónias (UFCs) por g de amostra, das
comunidades microbianas de bactérias heterotróficas (meio TSA) ou de fungos (meio PDA+CT)
presentes na amostra ambiental que analisou.
Para tal, deve calcular a concentração de UFC na “suspensão inicial” expressa em “número
de UFC/mL de suspensão inicial” a partir do número de colónias contadas em cada placa de
Petri de TSA ou de PDA+CT (ver explicação a seguir), e, em seguida, ter em conta os valores

14
correspondentes ao volume de suspensão inicial (em mL) e à quantidade de amostra (em g)
presente na suspensão inicial (ver passos f) e e) do procedimento experimental).
Para calcular o “número de UFC de bactérias heterotróficas / mL de suspensão inicial”,
deve ter em conta o número total de colónias contadas sobre o meio TSA nas placas de Petri
“contáveis” (i.e. selecionadas como indicado no passo w) do procedimento experimental),
bem como o factor de diluição entre a “suspensão inicial” e a “suspensão diluída” que
espalhou sobre o meio sólido em cada uma das placas de Petri selecionadas e o facto de ter
espalhado em cada placa apenas 50 L de cada suspensão. Se tiver resultados de contagem
de colónias de duas ou três diluições distintas, deverá fazer uma média aritmética dos valores
de “número de UFC/mL de suspensão inicial” obtido com as várias diluições.
Para calcular o “número de UFC de fungos / mL de suspensão inicial”, deve proceder de
forma idêntica, mas com as colónias contadas nas placas PDA+CT selecionadas (passo w) do
procedimento experimental).

d) Compare os resultados que obteve nos meios PDA+CT com os obtidos no meio TSA em
termos da diversidade (tendo em conta diferenças fenotípicas na morfologia das colónias que
lhe pareçam mais relevantes) e quantidade (tendo em conta o número de UFC / g de amostra)
das diferentes comunidades microbianas presentes na amostra;

e) Estime a quantidade (em g ou L, consoante os casos) de cada agente antimicrobiano

(ampicilina, gentamicina, fluconazole, etanol e hipoclorito de sódio) presente nos discos, e
discuta o seu efeito antimicrobiano nas diferentes comunidades microbianas, de bactérias ou
de fungos, que caracterizam a sua amostra;

f) Discuta se encontra algumas semelhanças macroscópicas entre algumas das colónias

isoladas nos meios TSA e PDA+CT a partir da superfície sólida (“swab”) e isoladas a partir da
amostra ambiental. Se sim, dê pelo menos uma razão plausível.

TL4-C. O mundo microscópico que habita a superfície da nossa pele:

isolamento de colónias microbianas e efeito da lavagem ou desinfeção das
mãos
Introdução
A microbiota do corpo humano inclui, entre outros, o conjunto de microrganismos que
vivem na superfície da pele, considerada o maior órgão do corpo humano. A microbiota
residente na pele encontra-se, principalmente, na camada superior da epiderme e à volta dos
folículos capilares; inclui diversas espécies de bactérias benéficas cujas atividades ajudam a
prevenir a colonização da pele por microrganismos patogénicos ao competirem por
nutrientes, sintetizarem e excretarem metabolitos antimicrobianos, e estimularem o sistema
imunitário do hospedeiro. Outros microrganismos (várias espécies de bactérias, fungos, vírus)
são transientes e podem permanecer durante períodos mais ou menos curtos (por ex.,
algumas horas, em certos casos) na nossa pele. Estes microrganismos transientes podem ser
provenientes do ambiente circundante, de pessoas ou animais e dos materiais e
equipamentos onde tocamos frequentemente. Em particular a pele das mãos pode ser um
veículo preferencial de transporte de microrganismos. Na ausência de cuidados de higiene

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adequados, alguns micróbios nocivos podem ser facilmente disseminados, contribuindo para
aumentar o risco de ocorrência de infeções.

1. Material necessário
- Placas de Petri com meio TSA (composição e função em TL4-A e -B)
- Solução de etanol 70% (v/v)
- Sabão azul e branco (ou equivalente)

2. Procedimento experimental
a) Marque o verso de uma placa de meio TSA com as letras “ALM” (“Antes de lavagem mãos)”.
Escreva também uma identificação do grupo/turno.
b) Por debaixo da zona protectora da chama do bico de Bunsen, abra a placa de Petri e
pressione levemente, durante 10 segundos, as extremidades de dois dedos (extensão ~2-2,5
cm) sobre a superfície do meio sólido de forma a fazer impressão digital (Nota: Cada elemento
do grupo repete este processo na mesma placa de Petri, usando um lado diferente da área
disponível de meio sólido. A posição onde cada aluno fez a sua impressão digital deve ser
marcada com uma caneta no verso da placa de Petri).
c) Para lavar as mãos, desinfecte primeiro o bocal da torneira com papel embebido em solução
de etanol a 70% (v/v) e deixe secar ao ar. Em seguida, cada elemento do grupo lava as mãos
com sabão azul e branco e água corrente* (Peça a um colega para fechar a torneira, de forma
a evitar contaminação das mãos lavadas com sujidade que esteja na superfície do manípulo
da torneira), e deve secar as mãos ao ar durante alguns minutos.
(*Nota: em alternativa, pode desinfectar as mãos com alcool-gel ou com solução alcoólica
70% (v/v), mas tenha cuidado em manter-se afastado do bico de Bunsen porque o alcool
etílico é muito inflamável)
d) Repita o passo b) com os mesmos dedos mas agora lavados ou desinfectados; não se
esqueça de escrever no verso da placa de Petri “DLM” (Depois de lavagem mãos) ou “DDM”
(Depois de desinfeção mãos) bem como a sua identificação na zona onde fez a sua impressão
digital.
e) Incube as placas de Petri a 30 ºC até aparecerem colónias (poderá demorar 2-3 dias).

3. Análise e discussão dos resultados

a) Observe as colónias formadas sobre o meio sólido (através da tampa das placas de Petri):
tente distinguir tipos morfológicos diferentes e descreva a sua morfologia. Para tal pode usar
como guia as designações que se encontram na Fig. 2 do TL4-B para além de outras
características fenotípicas como cor, brilho/mucosidade, etc..
Fotografe as placas de Petri viradas para cima, de forma a mostrar as colónias isoladas no
relatório. - não abra as placas de Petri na ausência de cuidados de assépsia
b) Registe os resultados e responda às questões colocadas na “Ficha de Registo de
resultados_relatório”, fornecida à parte.

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ANEXO A. Composição e preparação dos meios de cultura
MEIO TSA (“Tryptic Soy Broth” agarizado) – ver TL4-A
Meio PDA+CT (suplementado com clortetraciclina)
“Potato Dextrose Agar” (Difco) 39 g/L
Água destilada q.b. (para o volume pretendido)
(pH ~5,5)
Esterilizar na autoclave, a 121 °C (1 atm), durante 15 minutos. Deixar arrefecer o meio até
cerca de 45-50 °C, e adicionar o volume adequado de uma solução concentrada (500×) de
clortetraciclina (5 mg/mL, em etanol 70% v/v), de modo a que a concentração final no meio
de cultura seja igual a 10 mg/L. Guardar as placas de Petri no escuro e a 4 ºC, até à sua
utilização.

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