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Oxignio (O)
(~ 20% do peso seco da clula)
Azoto (N)
(~ 14% do peso seco da clula)
Hidrognio (H)
(~ 8% do peso seco da clula)
Protenas, cidos nucleicos, polissacridos, lipidos Fosfolpidos, cidos nucleicos, ATP Protenas, coenzimas
Fsforo (P)
(~ 3% do peso seco da clula)
Enxofre (S)
(~ 1% do peso seco da clula)
Fontes de Carbono
- CO2 - Compostos orgnicos
Fontes de energia
Maior parte dos microrganismos usam um de trs tipos de fontes de energia
Chlorophyll or bacteriochlorophyll
Macronutrientes ( )
(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)
Fig. 9.1
(g/l)
(mg/l)
Meios de cultura sintticos ou definidos meios de cultura cuja composio qumica perfeitamente conhecida. Meios de cultura complexos - meios de cultura cuja composio exacta desconhecida. Podem ter como componentes diversos ingredientes, tais como Peptonas, Extracto de Levedura, Extracto de Carne, etc.
PEPTONAS Hidrolizados de protenas preparados por digesto proteolitica parcial de fontes proteicas (p.ex. extracto de carne, casena, soja, gelatina, etc.). Os aminocidos e pequenos pptidos resultantes servem como fonte de carbono (C), de energia e de azoto (N), para os microrganismos. EXTRACTO DE LEVEDURA (Yeast extract) Obtido a partir da lise de clulas de levedura da cerveja e hidrlise dos seusconstituintes. Fonte de vitaminas, compostos de Carbono (C), de azoto (N) e sais minerais.
Meios selectivos
suprimem o crescimento de determinados microrganismos em benefcio de outros. (ver aula sobre cultura de enriquecimento)
Meios diferenciais
permitem a distino entre diferentes grupos de microrganismos com base na capacidade de metabolizar componentes especficos presentes no meio de cultura e/ou na morfologia (aparncia) das colnias. Permitem, por vezes, a identificao de microrganismos com base nas suas caractersticas fisiolgicas.
ar
lngua
(In J. Black, Microbiology, principles and exploration, 6th ed, J Wiley & Sons)
. Refutao final da teoria da gerao expontnea . Desenvolvimento de tcnicas de esterilizao eficientes (pasteurizao)
Esterilizao no Laboratrio
ESTERILIZAO Morte ou remoo de todos os organismos vivos, estruturas biolgicas e virus de um material, meio de cultura, etc. (in Brock Biology of Microorganisms)
CALOR
CALOR SECO - em estufa (160C/2horas; 180C/1 hora) - pouco eficiente - em desuso; s aplicvel a material de vidro ou outro resistente a temperaturas altas CALOR HMIDO na AUTOCLAVE
FILTRAO
Esterilizao
* Vapor de gua saturado, sob presso (1 bar) CONDIES DE ESTERILIZAO NA AUTOCLAVE 121C (presso: 1 bar) Durao depende de: Volume de material dentro da autoclave; Grau de contaminao do material a esterilizar (usual 15 min)
APLICADA A:
- Meios de cultura sem componentes termolbeis (p.ex. muitos aucares, aminocidos, vitaminas, no so estveis a 121C) - Materiais de plstico ou vidro
(In Brock Biology of Microorganisms, 10th edition, Prentice Hall)
Esterilizao na autoclave
Condies que causam a MORTE CELULAR: Levedura Bolor Bactria Vrus Clulas vegetativas 5 min a 50-60C 30 min a 62C 10 min a 60-70C 30 min a 60C Esporos 5 min a 70-80C 30 min a 80C 2-800 min a 100C ou 0,5-12 min a
Endsporo
121C
-
ENDSPOROS:
- Presentes na gua, solo, etc - Podem permanecer viveis durante muito tempo (dcadas; milhares/milhes(?) de anos encontrados em locais arqueolgicos, no intestino de abelha extinta preservada em ambar) - Algumas bactrias que os produzem so agentes de doenas graves (ex. Ttano, Botulismo)
TESTE QUE PODE SER USADO PARA VERIFICAR O FUNCIONAMENTO EFICIENTE DA AUTOCLAVE
(1) (2)
Spore strip = Tira de papel esterilizada contendo sobre a superfcie endsporos de uma bactria (p.ex. do gnero Bacillus)
APLICADA A: Lquidos - Solues de compostos sensveis a temperaturas altas (p.ex. antibiticos, vitaminas, aminocidos, aucares podem sofrer alteraes, incluindo degradao, a 121C) - Meios de cultura liquidos com componentes termossensveis Gases
Ansa de repicagem
(filamento metlico)
...
1 gerao
2 gerao
3 gerao
...
Exemplo: Suspenso de solo em gua (Populao mista de microrganismos) Aps incubao T ambiente durante 24 h
Morfologia de colnias
forma e tamanho dependem do microrganismo mas, tambm podem depender das condies ambientais,
tais como, quantidade de oxignio e nutrientes disponveis no meio de cultura, pH,etc..
Robert KOCH (1876) primeiro cientista a definir CULTURA PURA e a isolar COLNIAS de bactrias em meios de cultura slidos.
R. Koch Microfotografia de bactrias provenientes de uma colnia isolada (confirmao de ser um nico tipo morfolgico)
0,1 ml Passo 2.
Passo1. Diluies sucessivas da suspenso de solo (10-1 ou 1: 10; 10-2 ou 1: 100; 10-3 ou 1: 1000; 10-4 ou 1: 10000; ...)
Passo 3a
Passo 3b
Passo 4.
(In R. Maier, I L Pepper, C P Gerba, Environmental Microbiology, Academic Press)
Diluio
10-2
10-3
10-4
50 colnias (diluio 10-3) N de colnias em cada placa de Petri est relacionado com o tamanho da POPULAO CULTIVVEL presente na amostra original de solo 50 x 10 x 103 UFC / ml suspenso de solo (A) 50 x 106 UFC / 100 ml de suspenso de solo /10 g de solo
Tipos morfolgicos diferentes das colnias em cada placa relacionado com a diversidade de microrganismos cultivveis presentes no solo.
Bactrias
CULTURA DE ENRIQUECIMENTO
Isolamento de microrganismos pouco abundantes e com requerimentos nutricionais especficos, a partir de populaes mistas
(p.ex. bactrias que so capazes de degradar benzoato, i.e. usam benzoato como fonte de C e energia).
Crescimento em meios de cultura selectivos 1) enriquecimento em meio liquido (nas bactrias em causa) 2) isolamento de colnias em meio slido
Outros exemplos: - Isolamento de bactrias que degradam um certo pesticida ou hidrocarbonetos do petrleo ou outros poluentes orgnicos do Ambiente.
versus
vs
4.2 x 10
6
Bactrias observveis numa amostra de solo (observao directa atravs de microscpio de fluorescncia)
4.2 x 10
10
Diversidade microbiana no solo uma fonte importante para explorao biotecnolgica de NOVOS microrganismos, produtos e processos
Explorao das potencialidades dos microrganismos no-cultivveis nos meios de cultura laboratoriais conhecidos
- Desenvolvimento de mtodos moleculares (no dependentes do cultivo) para pesquisa e identificao ( ex. Anlise de DNA, RNA, protenas) -Procura de novas frmulas para cultivo de microrganismos
Manuteno de microrganismos viveis no Laboratrio e em Coleces de Culturas Vrias metodologias permitem a manuteno de culturas viveis, no contaminadas e inalteradas nas suas propriedades durante perodos de tempo mais ou menos longos, nomeadamente:
. Em rampas ou placas de Petri contendo meio slido
(viabilidade das clulas: dias ou semanas)
. Congelao
(clulas suspensas em meio de cultura + glicerol (anti-criognico) (viabilidade das clulas: anos)
. Liofilizao
(liofilizao - desidratao das cluas por sublimao de gua congelada, sob vcuo) (viabilidade das clulas: anos; dcadas)