CULTURA

DE
AMOSTRAS

Profª. Drª. Regina H. Pires

 CULTIVO DE MICRORGANISMOS

O cultivo de microrganismo requer

um meio esterilizado (isento de
formas vivas), o qual se adiciona ou
semeiam-se células vivas do
organismo que se deseja cultivar
contidas em pequena amostra de
material (inóculo). Após inoculação
(ato de adicionar inóculo) o meio de
cultura ou cultivo (sólido ou líquido
deve conter todos os nutrientes
exigidos pelo organismo) é incubado
por tempo determinado (tempo de
incubação) sob condições
apropriadas de oxigenação,
temperatura, etc.
 CRESCIMENTO EM MEIO SÓLIDO
Semeadura em placas: técnica do esgotamento

Semeadura é realizada na
região 1 a partir da cultura
original. A alça de inoculação
deve ser esterilizada nas
1 2 fases subsequentes de
maneira a diluir o número de
4
microrganismos.
3
INOCULAÇÃO EM MEIO SÓLIDO – TÉCNICA POR ESGOTAMENTO

Profª. Drª. Regina H. Pires

 MANUSEIO ASSÉPTICO

Esterilização de alça de inoculação e boca de tubos

(b)

Esterilização da boca de tubos contendo meio esterilizado (a) em

chama de bico de gás (b), esterilização da alça de inoculação através
da chama (c) e cuidados com a alça contendo células, não descanse
sua alça de inoculação sobre a bancada de trabalho (d).
 PREPARO E INOCULAÇÃO DOS MEIOS SÓLIDOS
O preparo e inoculação de um meio solidificado (agar inclinado) para
manutenção de cultura requer as seguintes etapas:

1. Inclinar o frasco com meio

quando este sair da autoclave
para solidificação.

2. Inoculação com alça em estria

central, na parte inclinada do
meio.
 MANUSEIO ASSÉPTICO
FLUXO LAMINAR

Câmaras estéreis de fluxo laminar esterilizada por ar filtrado (livre de

microrganismos). Estas câmaras permitem a passagem contínua de ar
esterilizado por filtro e, assim, criam um ambiente de ar esterilizado. Esta
possui, ainda, a ajuda de uma lâmpada UV.
 ASSEPSIA E ESTERILIZAÇÃO
• Meio de cultura
- autoclave: calor úmido (121 °C/15 - 20 min)

- filtração: 0,22 µm

• Área de trabalho/materiais

- esterilização de vidraria
calor seco (estufa: 140 - 180C/2 h)
calor úmido (autoclave) + secagem (estufa)
raios gama: plástico descartável

- limpeza do laboratório e vidraria

álcool: balcão e capela
detergente + água destilada: vidraria
desinfetante: chão
Profª. Drª. Regina H. Pires
 PREPARO DE MEIOS DE CULTURA
• Distribuição

- antes de autoclavar: frascos e tubos de ensaio

- após autoclavar: placas de Petri

• Armazenamento

- meio ambiente: 2 semanas

evaporação
degradação de componentes
contaminação

- geladeira: 4 °C
- freezer: meio líquido, solução estoque
Profª. Drª. Regina H. Pires
 CULTIVO DE MICRORGANISMOS

Meios de cultura
consistem da associação
qualitativa e quantitativa
de substâncias que
fornecem os nutrientes
necessários e as condições
ambientais favoráveis ao
desenvolvimento de
microrganismos fora do
seu meio natural.

Profª. Drª. Regina H. Pires

 MEIOS DE CULTURA
Principais produtos e compostos utilizados

a)Hidrolizados de proteínas : Peptonas, infusão de carne, triptona,

caseína

b)Carboidratos: Dissacarídeos (lactose, sacarose e maltose)

Hexoses (glicose)
Pentoses (xilose)

c)Tampões: Fosfatos monossódicos e dissódicos ou potássicos

d)Enriquecimento: Sangue, soro, vitaminas, extratos de leveduras

e)Inibidores: Corantes de anilina (eosina, verde brilhante etc)

Metais pesados (bismuto)
Produtos químicos (azida de sódio, citrato, desoxicolato)
Agentes antimicrobianos (oxacilina, vancomicina, novobiocina)
Profª. Drª. Regina H. Pires
 MEIOS DE CULTURA
Principais produtos e compostos utilizados

a)Indicadores de pH: vermelho de fenol, vermelho neutro,

púrpura de bromocresol, azul de bromotimol;

b) Outros indicadores: íons férrico e ferroso – H2S (sulfeto

ferroso)

c) Agar: extrato gelatinoso extraído de algas vermelhas

d) Substrato para ação de enzimas: uréia, tiossulfato de sódio,

triptofano, lisina
Profª. Drª. Regina H. Pires
 CLASSIFICAÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA
• I- QUANTO AO ESTADO FÍSICO
- Líquido: Nutrientes em solução aquosa e inexistência de ágar;
- Semi-Sólido: Presença de nutrientes e ágar em concentração de
0.8%;
- Sólido: Presença de nutrientes e ágar em concentração maior
que 18g/L ou 1,8%.
- Bi-fásico: semi sólido coberto com meio líquido ou dois meios
diferentes separados com uma interface.

Profª. Drª. Regina H. Pires

 Classificação dos Meios de Cultura
II- QUANTO A PROCEDÊNCIA DOS CONSTITUINTES
a) naturais ou complexos, quando usa
ingredientes com composição química
não definida, tais como extratos de
vegetais (malte, tomate, amido de
tubérculos, peptona de soja, etc.) de
animais (carne, cérebro, fígado,
caseína, etc.) e de microrganismos
(levedura)
b) artificiais, sintéticos ou quimicamente
definidos quando a composição
química é conhecida e seus
componentes servem para suprir
necessidades nutricionais específicas
dos microrganismos.
Profª. Drª. Regina H. Pires
 Classificação dos Meios de Cultura
III- QUANTO A COMPOSIÇÃO QUÍMICA

a)Simples (meios básicos) são

aqueles que permitem o
crescimento bacteriano, sem
satisfazer contudo nenhuma
exigência em especial (Ex.
caldo e ágar simples)
b)Complexos: quando
cumprem com as exigências
vitais de determinados
microrganismos (ex. meio de
Lowenstein-Jenssen).
Profª. Drª. Regina H. Pires
Aplicação dos Meios de Cultura

De acordo com a finalidade

bacteriológica empregam-se
diferentes meios de cultura

Profª. Drª. Regina H. Pires

Profª. Drª. Regina H. Pires
Profª. Drª. Regina H. Pires
UTILIZAÇÃO DE AGAR SANGUE PARA CLASSIFICAÇÃO DE ESTREPTOCOCOS:

Os estreptococos podem ser

designados baseando-se nos
tipos de hemólise em placas de
ágar sangue. Se a hemólise for
total, diz-se que o estreptococo
é beta-hemolítico, se parcial,
alfa-hemolítico e, não havendo
hemólise, diz-se que o
estreptococo é do tipo gama ou
não hemolítico.

Profª. Drª. Regina H. Pires

Profª. Drª. Regina H. Pires
ÁGAR SALMONELLA-SHIGELLA (SS)

PRINCÍPIO

❑ Ágar SS possui componentes (sais de bile, verde

brilhante e citrato de sódio) que inibem
microrganismos Gram positivos.
❑ A incorporação de lactose ao meio permite
diferenciar se o microrganismo é lactose positiva
(bactérias que fermentam a lactose produzem ácido
que na presença do indicador vermelho neutro
resultando na formação de colônias de cor rosa), e
bactérias que não fermentam a lactose formam
colônias transparentes.
❑ Tiossulfato de sódio e o citrato férrico permitem a
detecção de H²S evidenciado por formação de
colônias de cor negra no centro.

Profª. Drª. Regina H. Pires

Profª. Drª. Regina H. Pires
METODOLOGIA DE DISCO-DIFUSÃO

Kirby-Bauer e pelo CLSI (Clinical & Laboratory

Standards Institute) – condições de crescimento
das principais bactérias.

Avaliação da sensibilidade aos antimmicrobianos

– métodos de difusão em disco e E-test
(enterobactérias, não fermentadores,
Staphylococcus e Enterococcus)

A zona de inibição (halo) é particular para cada

fármaco e organismo, sendo comparados com
diametros padronizados pelo CLSI que determina
cada organismo como sensível, dose dependente
e resistente.
TSI (TRÍPLICE AÇÚCAR E FERRO)

Profª. Drª. Regina H. Pires

 AGAR CITRATO DE SIMMONS
❑é indicado para determinar a
capacidade de certas bactérias de
utilizarem o citrato como única fonte de
carbono para o seu metabolismo;
❑ contém citrato de sódio como única
fonte de carbono, fosfato de amônia
como única fonte de nitrogênio e o azul
de bromotimol como indicador de pH;
❑ Quando a bactéria utiliza o citrato,
CO2 é liberado. O CO2 combina-se com
o sódio, do citrato de sódio e água para
formar carbonato de sódio, um produto
alcalino. Isto aumenta o pH, mudando a
cor do meio de verde (negativo) para
azul (positivo).
Profª. Drª. Regina H. Pires
 AGAR MOTILIDADE

❑ A utilização de um ágar semi-sólido para a A B

detecção da motilidade em bactérias foi
reportado por Tittsler e Sandholzer em
1936.

❑ A motilidade em bactérias é observada

macroscopicamente através de uma zona
de crescimento que se propaga a partir da
linha de inoculação

❑ A = bactéria móvel

❑ B= bactéria imóvel

Profª. Drª. Regina H. Pires

Profª. Drª. Regina H. Pires