CENTRO UNIVERSITÁRIO UNA - ICBS

CURSO: BIOMEDICINA/FARMÁCIA
BIO4AM-GJA e FAR4BN-GJB e BIO4AN-GJB
DISCIPLINA: MICROBIOLOGIA CLÍNICA
PERÍODO: 7° e 8º TURNO: MANHÃ/NOITE
PROFa: Lucienne França Reis Paiva

AULA PRÁTICA 1B

MEIOS DE CULTURA E TÉCNICAS DE PLANTIO

1- MEIOS DE CULTURA:

CONSIDERAÇÕES GERAIS:

A grande maioria dos meios de cultura utilizados no Laboratório de Microbiologia está

disponível comercialmente na forma de pó desidratado e requer para o seu preparo alguns
cuidados básicos que devem ser seguidos para garantir sua qualidade, a saber:

● as recomendações do fabricante devem ser rigorosamente seguidas

● o pH do meio deve ser exatamente o indicado
● a água utilizada deve ser destilada ou deionizada
● a distribuição dos meios deve ser de forma asséptica
● as balanças devem estar calibradas
● a vidraria utilizada deve ser adequada e estar rigorosamente limpa

VOLUME DE MEIO A SER UTILIZADO:

Meios líquidos: 3 a 5 ml por tubo 12x120 mm

10 a 15 ml por tubo 18x180 mm

Ágares: camada de 3 a 4 mm por placa de Petri

Placa 90 mm - 25 a 30 ml de meio
Placa 150 mm - 40 a 45 ml de meio

ESTOCAGEM:

● Ágares:

- em geladeira 2 – 8 º C por 2 semanas no máximo

- em sacos hermeticamente fechados, em geladeira 2 – 8 º C por 3 a 4 semanas

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● Meios líquidos:

- com rolha de algodão em geladeira 2 – 8 ° C por 2 semanas

- com rolha de borracha em geladeira 2 – 8 ° C por 6 meses

OBS: O meio de Tioglicolato de sódio deve ser estocado à temperatura ambiente.

ESTERILIZAÇÃO:

● Autoclave 121° C por 15 minutos

● Vapor fluente

CONTROLE DE QUALIDADE DOS MEIOS DE CULTURA:

● Teste de esterilidade:
- Consiste em incubar, por amostragem, placas de ágares e caldos em
estufa 37 ° C por 72 horas:
< 100 unidades preparadas = 01 unidade em prova de cada lote preparado
> 100 unidades preparadas = 5 % do total de cada lote preparado

● Teste de qualidade:
- utilizar microrganismos de referência, seguindo as especificações do
fabricante:

Cepa Escherichia coli ATCC 25922

Cepa Pseudomonas aeruginosa ATCC 27583
Cepa Staphylococcus aureus ATCC 25923

CAUSAS DE ERRO NO PREPARO DOS MEIOS DE CULTURA:

● Alteração do pH
● Solubilidade incompleta
● Aquecimento inadequado
● Homogeneização inadequada
● Erro de pesagem da base desidratada ou do volume de água

CLASSIFICAÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA:

● Meio nutritivo não seletivo

● Meio nutritivo e diferencial
● Meio enriquecedor
● Meio enriquecedor e seletivo
● Meio seletivo

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● Meio seletivo e diferencial
● Meio de transporte
● Meio de manutenção de microrganismos

PRINCIPAIS MEIOS DE CULTURA UTILIZADOS EM PLANTIO

PRIMÁRIO:

1 – MEIOS DE CULTURA EM PLACAS:

ÁGAR SANGUE:

Meio nutritivo não seletivo que permite o crescimento da maioria dos micro-organimos
Gram positivos e Gram negativos, inclusive de alguns fungos.
Utilizado para classificar a atividade hemolítica de alguns microrganismos (diferencial).

ÁGAR CHOCOLATE:

Meio nutritivo não seletivo que permite o crescimento de Haemophilus e

Neisseria por conter Suplemento II ou B (enriquecedor).

ÁGAR THAYER – MARTIN:

Meio enriquecedor e seletivo para o crescimento de Neisseria e Haemophilus.

Contém os Suplementos I ou A (antibióticos) e II ou B (enriquecedor).

ÁGAR MAC-CONKEY:

Meio seletivo e indicador de lactose para micro-organismos Gram negativos.

Impede o crescimento de micro-organismos Gram positivos por conter em sua
formulação cristal violeta e sais biliares.

ÁGAR MUELLER – HINTON:

Meio utilizado como padrão pelo CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) para
realização de testes de susceptibilidade aos antimicrobianos.

ÁGAR CLED OU BROLACIN:

Meio nutritivo indicador usado para isolamento e quantificação de micro-organismos

presentes na urina.
A deficiência em eletrólitos inibe a formação de véu pelas cepas de Proteus.

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ÁGAR SS:

Meio seletivo usado para o isolamento de Salmonella e Shigella.

Permite diferenciar micro-organismos Gram negativos lactose positiva e lactose negativa e
produtores de H2S.

ÁGAR EMB OU TEAGUE:

Meio seletivo usado para o crescimento de micro-organismos Gram negativos.

Inibe (“parcialmente”) o crescimento de Gram positivos devido aos corantes presentes em
sua formulação.

ÁGAR HEKTOEN:

Meio seletivo usado para o isolamento de Salmonella e Shigella, exercendo um efeito

inibidor da microbiota habitual das fezes.
Possui indicador de lactose e produção de H2S.

2- MEIOS DE CULTURA EM TUBOS:

TIOGLICOLATO DE SÓDIO:

Meio de enriquecimento utilizados para crescimento de micro-organismos aeróbios,

anaeróbios facultativos e microaerófilos.

TS CALDO – TRIPTICASE SOY BROTH:

Meio de cultura utilizado para promover o crescimento de numerosos micro-organismos

para confecção do antibiograma.

BHI – BRAIN HEART INFUSION:

Meio de cultura utilizado para promover o crescimento de numerosos micro-organismos.

Quando acrescido de 6,5 g% de NaCl é usado na identificação de Streptococcus,
Enterococcus e outros cocos Gram positivos catalase negativa.
O caldo de BHI Duplo Concentrado é utilizado para cultura de materiais biológicos sólidos
e líquidos corporais em grande volume.

SELENITO CALDO:

Meio de cultura enriquecedor e seletivo utilizado em cultura de fezes para o isolamento,

principalmente, de Salmonella. Inibe (“parcialmente”) o crescimento de coliformes.

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MEIO DE KAUFFMAN – TETRATIONATO:

Meio de cultura enriquecedor e seletivo utilizado em cultura de fezes para o isolamento,

principalmente, de Salmonella. Inibe (“parcialmente”) o crescimento de coliformes.

MEIO GN HAJNA BROTH:

Meio de cultura enriquecedor e seletivo utilizado em cultura de fezes para o isolamento

Salmonella e Shigella. Inibe (“parcialmente”) o crescimento de coliformes.

ÁGAR SABOURAUD:

Meio utilizado para o isolamento de fungos.

ÁGAR MYCOSEL:

Meio seletivo e indicador para o isolamento de dermatófitos.

ÁGAR LOWESTEIN-JENSEN:

Meio de cultura utilizado para o isolamento e testes de identificação de micobactérias.

ÁGAR LOEFFER:

Meio de cultura utilizado para o isolamento de Corynebacterium diphtheriae.

2 - PLANTIO PRIMÁRIO E ESCOLHA DOS MEIOS DE CULTURA

O plantio primário realizado de forma adequada, segundo as técnicas de plantio

recomendadas, o conhecimento da microbiota residente do sítio de coleta em questão e a
escolha correta dos meios de cultura permitem obter resultados confiáveis e reais do
processo infeccioso.

CONSIDERAÇÕES GERAIS:

- A temperatura dos meios de cultura utilizados deve ser próxima da temperatura ambiente
– Retirar da geladeira e deixar pelo menos 30 minutos à temperatura ambiente.
- Antes do plantio deverá ser feita uma avaliação macroscópica do meio de cultura para
certificar-se da sua esterilidade.
- A identificação dos meios de cultura é obrigatória.
- Todo material biológico deve ser manipulado rapidamente e seguindo as normas de
biossegurança.
- A flambagem da alça bacteriológica é indispensável.

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- É obrigatória a realização do esfregaço para coloração de Gram de todo material
biológico.

-As placas de Ágar Sangue devem ser picadas em profundidade para avaliação da
capacidade de hemólise de alguns micro-organismos.

- As placas de Ágar Sangue, Ágar Chocolate e Ágar Thayer-Martin devem ser incubadas a
35 ± 1ºC em atmosfera de CO2 (método da vela).

- Inocular primeiramente os meios não seletivos.

PROCEDIMENTO TÉCNICO PARA PLANTIO:

Meio ágar sólido em placa

Flambar a alça bacteriológica e semear a amostra biológica em toda a superfície do ágar.

No plantio primário em ágar Sangue, fazer picadas em profundidade com alça
bacteriológica.

Meio ágar sólido em tubo

Flambar a agulha bacteriológica

Inocular a amostra até o final do tubo, de forma reta e firme.
Em meios em tubos inclinados, repicar também no bisel.

Caldo enriquecimento e provas de identificação / ágar semi - sólido

Com auxílio de swab, alça ou agulha bacteriológica flambada, depositar o material no

caldo específico.
Agitar vagarosamente o tubo.

OBS: - O material biológico deverá ficar totalmente envolvido pelo meio de cultura.
- Materiais biológicos sólidos devem ser fragmentados em placa de Petri estéril e
semeado no caldo com pinça estéril.

Nota: - Alguns caldos e meios sólidos em tubos de provas de identificação requerem a

adição de vaselina ou óleo mineral , a saber:
• caldo lisina/ornitina/arginina
• meio de OF glicose (apenas em um dos tubos).

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OBSERVAÇÕES GERAIS

1. Todo material biológico deverá ser semeado e processado o mais rápido possível.

2. Durante o plantio, ao passar de uma placa para outra flambar a alça.

3. A ordem de plantio poderá sofrer modificações quando a amostra enviada for

insuficiente.

4. Ao incubar em CO2, lata com vela, não se esquecer da umidade, poderá ser usado
algodão umedecido.

5. Numerar a placa, se preferir colocar as iniciais do nome do paciente e datar.

6. Procurar ter sempre uma só referência do início do plantio, por exemplo, na direção do
número da cultura escrito na placa.

7. Antes de iniciar o plantio observar os meios de cultura e certificar-se da sua esterilidade.

8. O esfregaço para confecção do Gram deverá ser fino e homogêneo; material rico como
fezes e secreções purulentas, poderão ser diluídos com salina para preparar o esfregaço;
fixar a lâmina antes da coloração.

9. Amostras liquefeitas ou enviadas em grande volume deverão ser centrifugadas; usar o

sedimento para plantio e o esfregaço.

10. O material enviado em swab deverá ser semeado em 3 pontos do ágar e estriado com a
alça bacteriológica.

11. O material enviado em frasco deverá ser processado com a alça bacteriológica.

12. O material enviado em seringa deverá ser inoculado na placa e estriado com alça
bacteriológica.

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TÉCNICAS ESPECÍFICAS DE PLANTIO

1. SEMEADURA QUANTITATIVA COM ALÇA CALIBRADA:

 Homogeneizar a amostra biológica (urina) ou a diluição da amostra (lavado,

brônquico, escarro, escovado brônquico).
 Inserir a alça calibrada (10 –3 para urina e 10 –2 para outras amostras biológicas
submetidas à diluição ) de forma vertical.
Semear uma estria central e perpendicular ou em três quadrantes.
 Flambar a alça bacteriológica e semear em toda a superfície do ágar.
 Seguir orientação da figura 1.

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2 – SEMEADURA PARA SEMI-QUANTIFICAÇÃO:

Flambar a alça bacteriológica

Com auxílio da alça bacteriológica, inocular a amostra na superfície do ágar
Estriar a superfície do ágar seguindo orientação da figura 2.

Obs: Em casos de materiais biológicos com possibilidade de crescimento de grande número

de micro-organimos, tais como fezes, conteúdo abdominal e trato respiratório superior,
flambar a alça bacteriológica entre a primeira e a segunda estria quando forem processados
ou dar picadas em profundidade na placa, a fim de esgotar e obter colônias isoladas.

3 - TÉCNICA DE MAKI E COLS. (1977) PARA SEMEADURA DE

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 CATETERES:

Ao receber o catéter observar se ele está devidamente acondicionado, isto é, em frasco

esterilizado e seco, e se está dentro do tamanho padronizado, de 5 a 7 cm de comprimento.
Neste caso, fazemos a rolagem do catéter em meio de ágar sangue e em seguida, colocamos
no Tioglicolato.

Procedimento passo-a-passo:

- Retirar o cateter – dentro do tamanho padronizado – do frasco com auxílio de uma

pinça estéril.
- Colocar o cateter sobre a superfície do ágar sangue.
- Com auxílio da pinça, rolar o cateter por toda a superfície do meio para frente e para
trás, duas vezes.
- Seguir orientação da figura 3.

Catéteres intravasculares aceitáveis para realização de cultura semiquantitativa (método de

Maki e cols.(1977)):

- Catéter Central (venoso e arterial) - Broviac

- Catéter Periférico - Umbilical
- Catéter Epicutâneo - Hiperalimentação
- Catéter de Hickman - Swan Ganz

AVALIAÇÃO DE CULTURAS

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APÓS INCUBAÇÃO 24 HORAS

SEM CRESCIMENTO reincubar mais 24 horas

 até 48 horas – Urocultura

 até 72 horas – Secreções

 15 dias para Bolsa de CAPD / líquido de diálise peritoneal

 7 dias para hemocultura / micro-organismos comuns Hemocultura manual

 21 dias para hemocultura / endocardite
 5 dias para hemocultura / micro-organismos comuns Hemocultura automatizada
 14 dias para hemocultura / endocardite e fungos

 30 dias para cultura de fungos

Resultado: Não houve crescimento após ________ de incubação

COM CRESCIMENTO

1. Para materiais sem microbiota residente

A) 01 tipo de colônia > Gram > identificação e antibiograma

Meio de enriquecimento > Gram > Repicar, por exemplo Ágar-sangue e Ágar MacConkey.
Após 24 horas > observar colônias

B) Mais de 01 tipo de colônia > fazer Gram de cada colônia > repicar para os respectivos
meios.

Exemplo:

CGP reisolar para Ágar Sangue / CO2; bastonetes Gram negativo > para Ágar MacConkey

Meio de enriquecimento > Gram > repicar para Ágar Sangue e Ágar MacConkey

Após 24 horas de incubação, observar o crescimento e proceder da mesma maneira.

2. Para materiais com microbiota residente

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 Lembrar sempre do patógeno importante do sítio, causador de infecção naquele sítio;
observar se crescimento predominante.

 Observar se crescimento predominante de alguma bactéria.

 Comparar sempre com o esfregaço corado pelo Gram.

Exemplos:

Swab de orofaringe > Observar colônias puntiformes com beta hemólise

Fezes > Colônias lactose negativa (transparentes) ou colônias negras (H2S+)
Secreção vaginal > Colônias brancas com aspecto de cerâmica – leveduras – ou colônias
mucosas e brancas com ou sem hemólise > Streptococcus agalactiae.

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