IFSP - Campus So Roque

CURSO DE CINCIAS BIOLGICAS DISCIPLINA: MICROBIOLOGIA PROF.: Sandro Gazzinelli

APOSTILA DE AULAS PRTICAS DE MICROBIOLOGIA

Nome do aluno: _____________________________________________________________ Perodo: _________

IFSP - Campus So Roque

Normas de segurana e recomendaes que devero ser observadas no laboratrio de aulas prticas de Microbiologia 1. 2. 3. 4. 5. 6. obrigatrio o uso de avental e deve permanecer abotoado. No permitido comer, beber ou fumar no laboratrio. O material pessoal (bolsas, livros, etc.) deve ser mantido longe das bancadas de No inicie uma prtica sem que tenha lido cuidadosamente as instrues e Manter qualquer lquido inflamvel longe da lamparina. Em caso de acidentes (derramamento de culturas, quebra de placas, respingo de

trabalho. compreendido os objetivos e modo de execuo das experincias.

cultura, ferimentos, etc): Comunicar imediatamente o professor responsvel pela aula prtica. Colocar papel toalha com lcool sob o material contaminado. 7. Descarte do material: Material contaminado (pipetas e lminas preparadas pelos alunos, devem ser colocados nos recipientes prprios para descarte). Lminas e tubos com cultura fornecidos pelos professores devero ser deixados sobre a bancada e nas estantes, respectivamente. Material para incubao, previamente identificado, por grupo, sero colocados em recipientes prprios. Fsforo riscado, algodo e papel utilizado, colocar nas caixas de lixo. 9. A bancada deve ser desinfetada com lcool 70% antes e aps o experimento. 10. 11. 12. 13. 14. Lavar bem as mos antes e aps a realizao do trabalho em bancada. Culturas, lminas, reagentes e outros materiais no devem ser removidos do laboratrio No inalar qualquer substncia diretamente. A ala de inoculao dever ser flambada antes e depois de ser utilizada, para isso, O microscpio um instrumento valioso e deve ser manipulado e usado

sem a autorizao do responsvel.

aquecer at o rubro e deixar resfriar mantendo prxima chama. cuidadosamente. Qualquer dano ou defeito deve ser comunicado ao professor. No fim de cada aula, limpar a lente ocular e as objetivas com papel macio. 15. Identificar todo o material com o nmero do grupo e data e anotar cuidadosamente os resultados de ser trabalho. Essa anotaes servem de base para o aprendizado

IFSP - Campus So Roque

AULA PRTICA N 1 PARTE 1 ASSUNTO - Normas de Biossegurana, identificao e manipulao de materiais para as aulas prticas de microbiologia OBJETIVOS - Reconhecer os procedimentos que devem ser adotados para biossegurana no laboratrio - Identificar os materiais utilizados nas prticas de microbiologia PROCEDIMENTO - Fazer a identificao de materiais no laboratrio de Microbiologia - Manipular corretamente a vidraria principal e outros objetos de uso mais freqente em microbiologia. MATERIAIS - Meios de cultura - Vidraria Tubos de ensaio Placas de Petri Erlenmeyers Para transferncia e inoculao de microrganismos Alas de inoculao Swab Equipamentos do Laboratrio de Microbiologia Autoclave Estufa Fonte de chama QUESTES 1. Identifique as funes dos seguintes materiais utilizados em laboratrio de microbiologia: a) Agar bacteriolgico b) Tubos de ensaio c) Erlenmeyers e bales d) Placas de Petri e) Ala de inoculao f) lamparina g) Lminas 2. Qual a funo da autoclave? Por que ela um equipamento indispensvel ao laboratrio de Microbiologia? 3. Por que necessrio a utilizao da estufa no laboratrio de Microbiologia? 4. Como os meios de cultura so classificados de acordo com o seu estado fsico? 5. Qual a diferena dos meios de cultura bsicos e especiais? Classifique os meios utilizados nesta prtica de acordo com este item. 6. O que um meio de cultura seletivo? E diferencial? 7. Qual a diferena na verificao do crescimento de cultura bacteriana em meio slido e meio lquido?

IFSP - Campus So Roque

PARTE 2

ASSUNTO Manobras asspticas e Tcnicas de Semeadura OBJETIVOS - Conhecer as manobras utilizadas com os materiais utilizados nas prticas de microbiologia - Aprender as tcnicas para inoculao de microrganismos em meios de cultura slidos e lquidos sem que ocorra contaminao MATERIAIS - Ala de inoculao - Placas de petri com meio de cultura slido (Agar + Caldo de Carne) - Tubos de ensaio com meio lquido PROCEDIMENTOS Manobras asspticas e Tcnicas de semeaduras So tcnicas que impedem a entrada de microrganismos onde estes no so desejados, ou seja, garantem uma boa assepsia. Assim as manobras asspticas vo impedir que microrganismos presentes no ar, ou depositados sobre as vrias superfcies junto com a poeira, venham contaminar materiais estreis do laboratrio tais como os meios de cultura, solues e equipamentos ou, ainda, culturas puras de microrganismos. Por outro lado impedem tambm que os microrganismos com os quais estamos trabalhando nos contaminem ou ao ambiente. As manobras asspticas referentes manipulao de culturas envolvem basicamente o uso de um bico de Bunsen ou lamparina e a realizao de toda a manipulao dentro da chamada zona de segurana, que nada mais do que a regio ao redor da chama, a mais prxima possvel sem que haja perigo de superaquecimento ou queimaduras. Toda vez que se fizer uma semeadura siga as regras abaixo mencionadas para evitar a contaminao dos meios de cultura pelos microrganismos ambientais. 1) Tanto a ala como o fio de platina deve ser flambado antes e depois de qualquer operao de semeadura. Para tanto, devem ser passada na chama de 2 a 3 vezes. A posio correta para a flambagem da ala que a mesma faa um ngulo de 45C em relao mesa de trabalho. Deve ser utilizado o cone interno da chama do bico de Bunsen ou lamparina. Para retirar o material, quer seja para a feitura de um esfregao, quer para semeadura, esfriar previamente a ala. Esta dever ser esfriada na parede interna do tubo de ensaio ou na tampa da placa de Petri.

IFSP - Campus So Roque

2) Toda vez que se fizer uma semeadura utilizando tubos de ensaio, deve-se flambar a boca dos mesmos imediatamente retirada do tampo de algodo. Este dever ser mantido seguro pelo dedo mnimo da mo que est segurando a ala. Aps a retirada do material com a ala, flambar a ala, aps o uso.

3) As placas de Petri devero ser abertas prximas ao bico de Bunsen ou lamaprina para evitar contaminao com germes do ar. Uma vez semeadas, as placas devem ser incubadas em estufas com a tampa voltada para baixo. 5) Para a cultura de microrganismos em meio slido, deve-se seguir o mtodo de semeadura mostrado abaixo:

IFSP - Campus So Roque

AULA PRTICA N 2 Assunto: Observao de microrganismos do ambiente e da microbiota natural do corpo Introduo: Os microrganismos se encontram praticamente em todos os ambientes. No ar, gua e principalmente no solo. Destes locais podem ser arrastados por partculas de poeira e aerossis. Do ar, passam para nossa superfcie contaminando ainda a gua e alimentos. Uma vez que as condies que favorecem a sobrevivncia e o crescimento de muitos microrganismos (nutriente, umidade e temperatura adequada) so as mesmas sob as quais vivem as populaes humanas, inevitvel que vivamos entre grande quantidade de germes. O nosso corpo habitado por milhares de microorganismos que, quando so inofensivos, so chamados de microbiota ou flora normal. Materiais: - Placas de Petri contendo meio slido (Agar + Caldo de Carne) - Tubos de ensaio com caldo nutritivo - Swab Metodologia: - Retirar a tampa de placas contendo Nutriente Agar e deixar abertas no ambiente durante 15 minutos em diferentes ambientes. - Coletar com swab estril material de partes do corpo de alunos da turma. Atravs do procedimento de manobras asspticas, inocular o material coletado pelo swab no meio de cultura lquido. - Incubar as placas e tubos de ensaio por 3 a 5 dias a 37C em estufa. - Aps o perodo de incubao analisar macroscopicamente as colnias de bactrias e fungos que se desenvolveram. Resultados: - Descrever em termos gerais a aparncia das colnias crescidas e meio de cultura slido (tamanho, textura, cor, etc.). - possvel estimar quantas colnias cresceram nas placas do seu experimento? Enumere se possvel. - Como voc classifica os ambientes utilizados para o experimento? Justifique. - De todos os locais analisados qual obteve o maior nmero de colnias bacterianas? E o menor? (Colete informaes dos outros grupos para responder a esta questo) - No seu experimento houve crescimento de fungos? Qual a diferena entre a colnia de bactrias e fungos? - Quais as precaues que devem ser tomadas para controlar os contaminantes do local que foi verificado pelo seu grupo? Obs: Bactrias geralmente formam colnias circulares, ou com aspecto de creme (sem forma definida) e os fungos muitas vezes formam esporos e tem colnias mais desorganizadas (exceto leveduras, que formam colnias circulares como a de muitas bactrias). Isso no uma regra, mas ajuda a separar a maioria das colnias. Alm disso, o crescimento das bactrias favorecido em temperaturas acima de 30 graus Celsius (estufas) enquanto os fungos se desenvolvem bem na temperatura ambiente (15 a 25 graus Celsius).

IFSP - Campus So Roque

ANEXO: PRODUO DE MEIO DE CULTURA PARA BACTRIAS - CALDO DE CARNE Material utilizado: - Bales de Erlenmeyer; - Filtro de papel para caf; - Funil; - gua destilada; - Fita adesiva; - Vareta de vidro; - Placas de Petri; - Agar agar; - Caldo de carne; - Autoclave; - Algodo cardado; - Papel de Kraft; - Estufa; Protocolo experimental: Preparao do meio de cultura: 1 Colocou-se um caldo de carne num litro de gua destilada a ferver. Deixou-se ferver durante 5 minutos; 2 Filtrou-se e juntou-se, cuidadosamente, 20g de Agar Agar; 3 Baixou-se a temperatura e deixou-se ferver durante algum tempo, mexendo sempre com a vareta de vidro; Preparao das placas: 1 Tapou-se o erlenmeyer com uma rolha de algodo cardado e protegeu-se com papel de Kraft; 2 Embrulhou-se as placas de Petri em papel Kraft; 3 Colocou-se as placas de Petri na autoclave a 1atm. durante 15 minutos (em alternativa esterilizar as placas de Petri em estufa, a 160C durante 2horas ou 170C durante 1hora); 4 Distribuiu-se o meio de cultura, ainda quente pelas placas de Petri esterilizadas: para o efeito levanta-se ligeiramente a tampa, de modo a ficar destapado s o espao necessrio colocao do meio de cultura; 5 Manteve-se as placas tapadas e deixou-se arrefecer at o meio de cultura solidificar;

IFSP - Campus So Roque

AULA PRTICA N 3 Assunto: Observao de bactrias presentes no iogurte Introduo: As bactrias do iogurte medeiam a transformao do leite em iogurte. Utilizam a lactose como fonte de carbono e de energia, levando a cabo uma fermentao lctica, como principal processo gerador de energia. So eubactrias Gram positivas. Os iogurtes devem conter quantidades aproximadamente iguais de Streptococcus e de Lactobacillus. Parte 1: OBSERVAO MICROSCPICA DAS BACTRIAS DO IOGURTE Material: - Iogurte magro natural; - Ala; - Lminas - Lamnulas - Azul de metileno - leo de imerso; - Vela - Microscpio ptico Metodologia: - Mergulhar a ala no iogurte. - Fazer um esfregao fino numa lmina limpa. - Observar ao microscpio, comeando pela objetiva de menor ampliao. - Tentar distinguir os dois tipos de bactrias lcticas. Obs: Procurar bactrias redondas (Streptococcus) e bactrias alongadas (os mais raros Lactobacillus). Obs: Pode corar-se com uma gota de azul de metileno para facilitar a visualizao caso no seja possvel observar adequadamente as bactrias. PARTE 2: ISOLAMENTO DE BACTRIAS DO IOGURTE Material: - Iogurte magro natural - Ala - Placas com meio slido - Parafilme ou pelcula aderente - Chama - Placas de petri com meio de cultura slido (Agar + Caldo de Carne) - Estufa a 37C, ou iogurteira
8

IFSP - Campus So Roque

Metodologia: (Trabalhar junto chama) - Abrir o iogurte perto da chama. - Esterilizar a ala chama (deixar ir ao rubro). - Deixar arrefecer e mergulhar no soro do iogurte. - Fazer um riscado numa placa contendo meio slido. - Selar a placa com tiras de parafilme ou pelcula aderente. - Colocar na estufa a 37C. - Alguns dias depois tentar observar os 2 tipos de colnias: a) Colnias muito transparentes em forma de flor (Lactobacillus) b) Colnias brancas, pequenas e redondas (Streptococcus) - Retirar, junto chama, uma poro de clulas dum tipo de colnia isolada, com uma ala. Depositar essas clulas numa gota de gua, colocada sobre uma lmina. Cobrir com lamnula. - Observar ao microscpio, tentando identificar os microrganismos. Observao microscpica a partir de colnias isoladas - Retirar, junto chama, com uma ala de repicagem, uma poro pequenina de clulas duma colnia isolada de uma placa de isolamento ou de individualizao. - Depositar essas clulas numa gota de gua, colocada sobre uma lmina. - Cobrir com uma lamnula. - Observar ao microscpio ptico.

IFSP - Campus So Roque

AULA PRTICA N 4 Assunto: Arqueas presentes em cortes de bacalhau Introduo: As halobactrias so contaminantes habituais do bacalhau seco salgado. Crescem sua superfcie, como manchas avermelhadas, e exalam um cheiro caracterstico a bacalhau podre, mesmo quando o bacalhau est em perfeitas condies de utilizao. Material: - Bacalhau que apresente zonas vermelhas e cheiro intenso. - Tubo de ensaio - gua destilada - Sal - Ala de repicagem - Lmina - Lamnula - Microscpio ptico Metodologia: - Retirar ou raspar um pedao pequeno de bacalhau duma zona que esteja vermelha. - Colocar num tubo de ensaio contendo 1 a 2 ml de soluo salina de NaCl (20%) - Agitar bem. - Mergulhar a ala na soluo. - Colocar uma gota numa lmina limpa. - Colocar lamnula. - Observar ao microscpio, comeando pela objetiva de menor ampliao.

10

IFSP - Campus So Roque

AULA PRTICA N 5 ASSUNTO Anlise da ao de anti-spticos OBJETIVO - Verificar a ao de anti-spticos sobre a microbiota das mos MATERIAIS - Placas de petri com meio de cultura slido (Agar + Caldo de Carne); - Sabonete; - Antispticos diferentes; - Gaze estril. PROCEDIMENTO - Dividir uma placa de Petri contendo os meios de cultura em 4 quadrantes - Fazer a semeadura do 1 quadrante utilizando a ponta do polegar (fazer a impresso digital suavemente para no ferir a camada do meio de cultura); - Um segundo aluno lava seu polegar com sabo e gua por 1 minuto, seca com gaze estril e inocula o segundo quadrante fazendo a impresso do dedo; - Um terceiro aluno faz a antissepsia de seu polegar com gaze embebida no 1 antissptico por 1 minuto, seca o dedo com gaze estril e faz depois a impresso no terceiro quadrante; - Um quarto aluno faz a antissepsia de seu polegar com gaze embebida no 2 antissptico por 1 minuto, seca o dedo com gaze estril e faz depois a impresso no quarto quadrante. - Incubar a placa a 37 C por 24 horas e analisar o crescimento. RESULTADOS E QUESTES 1. Faa uma representao esquemtica dos resultados obtidos na avaliao da microbiota das mos. Anote os dados referentes a mais 4 grupos alm do seu, para comparao. Smbolos: Pouco Contaminada + Mais ou menos contaminada +++ Muito contaminada +++++ No contaminou 2. Como voc interpreta os resultados obtidos? 3. Qual a importncia da assepsia das mos? 4. Qual a diferena entre anti-sepsia e assepsia? 5. Qual o modo de ao do calor seco? E do calor mido? Qual o mais eficaz? 6. Qual o tipo de calor mais utilizado para a indstria de alimentos? Por qu? 7. Por que o lcool etlico utilizado como desinfetante e anti-sptico deve ser hidratado? 8. Por que a autoclave, embora funcione numa temperatura muito mais baixa que os fornos ou estufas de esterilizao, tambm possuem ao esterilizante?
11

IFSP - Campus So Roque

AULA PRTICA N 6 ASSUNTO Estudo de microrganismos presentes no solo e na gua MATERIAIS - Placas de Petri contendo meio slido (Agar + Caldo de carne) - Diferentes amostras de solo - Recipiente contendo gua coletada de lagoa, represa, rio ou outro curso dgua - Swab estril - Lmina - Lamnula - Microscpio ptico PROCEDIMENTO Preparao das culturas - 1 placa com Agar deve ser dividida em 4 quadrantes - Em cada quadrante deve ser inoculado um material diferente utilizando swab estril. - Aps a execuo de todas as inoculaes, incubar os meios a 37C por 24 a 48 horas. Observao microscpica a partir de colnias isoladas - Verificar o nmero de colnias de fungos e bactrias desenvolvidas em cada quadrante. - Retirar, junto chama, com uma ala de repicagem, uma poro pequena de clulas de colnias originadas de cada material inoculado; - Depositar essas clulas em uma gota de gua, colocada sobre uma lmina; - Cobrir com uma lamnula; - Observar ao microscpio ptico. - Registrar as observaes

12

IFSP - Campus So Roque

AULA PRTICA N 7 ASSUNTO Verificao da ao de antibiticos Anlise de Antibiogramas Introduo: Antibitico: Agente bacteriano produzido por biossntese, obtido a partir do microrganismo, sendo que algumas substncias podem tambm ser produzidas por sntese in vitro (sintobiticos). Pode ser classificado de acordo com seu espectro de atividade e natureza qumica: a) Antibiticos que atuam predominantemente sobre bactrias Gram (+) b) Antibiticos que atuam predominantemente sobre bactrias Gram (-) c) Antibiticos de largo espectro d) Antibiticos de ao antimicobacteriana e) Antibiticos de ao antimictica Alguns antibiticos podem ser utilizados apenas em aplicaes tpicas, quer porque sejam txicos administrao parenteral, quer porque no se absorvem pela via oral. Os antibiticos atuam sobre os microrganismos de diversas maneiras: - Inibem a sntese do peptideoglicano da parede celular bacteriana, fazendo com que a clula morra por absoro de gua, aumento do volume e conseqentemente rompimento. - Lesam a membrana citoplasmtica, destruindo a permeabilidade da membrana e causando morte celular. - Interferem na sntese de cido nuclico e protenas. O aparecimento inicial de uma bactria resistente em uma populao sensvel muitas vezes causado pela mutao em um nico gene bacteriano. A freqncia de mutao inicial baixa. Entretanto, outra bactria pode se tornar resistente ao antibitico em uma freqncia muito maior, simplesmente adquirindo um gene de uma bactria que j resistente. O desenvolvimento da resistncia pode ser minimizado dos seguintes modos: - Evitar o uso indiscriminado de antibiticos. - Utilizar dosagens suficientemente altas de um antibitico apropriado para dominar uma infeco rapidamente. - Utilizar uma combinao de antibiticos de eficincia comprovada para dominar uma infeco rapidamente ( mais difcil um microrganismo tornar-se resistente contra dois antibiticos do que apenas contra um). OBJETIVOS - Verificar a ao dos antibiticos em bactrias - Verificar a presena de bactrias resistentes ou sensveis ao dos antibiticos - Analisar antibiogramas MATERIAL - Placas de petri com meio de cultura - Discos de antibiticos - Ala de inoculao - Cultura de bactrias
13

IFSP - Campus So Roque

PROCEDIMENTO: - Flambar a ala de platina no fogo, at que sua colorao se torne vermelha; - Abrir o tubo de ensaio, com a colnia de bactrias perto da lamparina ou do bico de bunsen - Esfriar a ala de platina nas bordas do tubo de ensaio; - Colher a cultura com a ponta da ala de platina; - Flambar o tubo de ensaio trs vezes e tampa-lo novamente; - Abrir a placa de Petri contendo gar, perto da chama, para evitar contaminao; - Estriar a cultura de bactrias na placa contendo gar da seguinte maneira:

Com ala de platina, distribuir a cultura pelo gar, conforme o desenho abaixo;

Fechar a placa de Petri e flambar novamente a ala de platina, at que ela fique vermelha; Pegar uma rodela de antibitico e coloc-la no centro da placa; Levar para uma estufa, a 37C, por aproximadamente 48 horas. RESULTADOS Fazer o desenho dos resultado observado.

a) Qual antibitico foi utilizado no experimento? ______________________________________________________________________ b) Aps observao, voc verificou que as bactrias so sensveis ou resistentes ao antibitico testado? ______________________________________________________________________ QUESTES a) Quais so os maiores motivos para o aparecimento destas superbactrias?
14

IFSP - Campus So Roque

________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________ b) Como os antibiticos conseguem interferir na morte da clula bacteriana? ________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________ ____ c) Em qual grupo de seres vivos est presente o organismo que responsvel pela produo da penicilina? ___________________________________________________________________________________________ AULA PRTICA N 8 Assunto: Isolamento e identificao de fungos anemfilos Material: - Placas de Petri contendo meio slido (BDA) - Lmina - Lamnula - Microscpio ptico Metodologia: - Escolher um ambiente para investigar a presena de fungos anemfilos. Neste local, as placas de Petri contendo os meios de cultura devero ser abertas e expostas ao ar, por aproximadamente 15 minutos. Em seguida, as placas sero fechadas, identificadas e incubadas temperatura ambiente. - Os alunos devero retornar ao laboratrio todos os dias para acompanhar o experimento e verificar se est havendo crescimento de colnias de fungos na superfcie dos meios de cultura. Anotar o tempo de crescimento, o nmero e variedade de colnias. Comparar com a de outros colegas e tentar determinar possveis diferenas ou semelhanas. - Aps o desenvolvimento dos fungos no meio de cultura, escolher uma colnia e descrever a sua macromorfologia. - A colnia de fungo anemfilo escolhida ser agora analisada sob o aspecto microscpico, utilizando a tcnica de fragmento de colnia. Com a agulha de platina flambada e fria, raspar a superfcie da colnia escolhida para obter pequenos fragmentos. Estes sero colocados sobre uma lmina, juntamente com 1 gota de lactofenol e cobertos por lamnula. Em seguida, observar ao microscpio no menor, mdio e maior aumento. Resultados: - No seu experimento houve crescimento de Bactrias? Caso positivo, cite 3 explicaes para seu surgimento em um meio de cultura que favorece o desenvolvimento de fungos. - Anotar (ou desenhar) as caractersticas observadas. Estes dados podero permitir a identificao do fungo escolhido. - Baseando-se na anlise da macro e micromorfologia do fungo por sua equipe escolhido, d sua descrio final, e se possvel, o gnero a que este fungo pertence. - Preencher a tabela no anexo 2 para auxiliar na identificao do fungo analisado -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ANEXO 1: PREPARAO DO MEIO DE CULTURA PARA FUNGOS, O EXTRATO BDA (BATATA DEXTROSE AGAR).

15

IFSP - Campus So Roque

MATERIAIS - Batata; - gua destilada; - Acar; - gar; - Erlenmeyer; - Algodo; - Gaze; - Autoclave; METODOLOGIA preparo do meio de cultura BDA. - 200 g/L de batata picada com casca; - 1 litro de gua destilada; - 4 g de Acar; - 4 g de Agar; Aps o cozimento da batata em gua destilada descartou-se a batata, e filtrou-se o liquido. Depois foram adicionados os demais reagentes. O volume foi completado para um litro com gua destilada, e depois foi colocado no erlenmeyer, fechado com algodo e gaze e autoclavado a 121C por 20 minutos. ANEXO 2: Tabela para identificao macromorfolgica dos fungos

16

IFSP - Campus So Roque

AULA PRTICA N 8 Assunto: Observao de ascsporos de Saccharomyces cerevisiae

17

IFSP - Campus So Roque

Material: - Fermento fresco - Agar - cido actico laboratorial ou vinagre de cozinha - Hidrxido de potssio (ou potassa custica - KOH) - Saquetas de acar (sacarose) para adoar caf - Extracto de levedura - gua destilada - Medidor de pH - Caixas de Petri, de preferncia esterilizadas - Copo de vidro com vareta de vidro dobrada em L - lcool - Esptula ou ansa de repicagem - Balana - Copos de vidro de 100 e 250ml - Pipetas de 0,5ml - Chama - Placa de aquecimento Metodologia: - Preparar uma suspenso espessa de fermento fresco: suspender 1g de fermento fresco em 1ml de gua. - Colocar, utilizando uma pipeta, 0,2ml da suspenso de clulas para o meio contido numa placa contendo meio de cultura BDA - Espalhar com a vareta de vidro dobrada em L. - Deixar temperatura ambiente. - Aps pelo menos 1 dia, retirar, junto chama, uma poro de clulas, com uma esptula ou uma ansa de repicagem. - Suspender essas clulas numa gota de gua, colocada sobre uma lmina. - Cobrir com lamela. - Observar ao microscpio ptico. - Registrar o que foi observado.

AULA PRTICA N 9 ASSUNTO

18

IFSP - Campus So Roque

Mtodo de colorao de Gram A colorao de Gram foi desenvolvida em 1884 pelo bacteriologista holands Hans Cristian Gram. Esta colorao uma das mais importantes e rotineiramente utilizada no laboratrio de Microbiologia. Ela divide as bactrias em dois grandes grupos: Gram positivas e Gram negativas, alm de permitir o estudo da clula bacteriana quanto sua morfologia (cocos ou bacilos) e arranjo. Aquelas bactrias capazes de reter o complexo formado pelo cristal violeta (CV) mais iodo (complexo iodo pararosanilina) coram-se em violeta (Gram positivo), enquanto as que no retm o complexo cora-se em vermelho (Gram negativo). A colorao de Gram uma colorao diferencial porque no cora todos os tipos de clulas igualmente. Essa maneira de reagir diferentemente, frente ao Gram, em razo das diferenas na estrutura da parede celular das bactrias Gram (+) e Gram (-). Bactrias Gram (+) possuem uma camada de peptideoglicano mais espessa que as Gram (-). Quando aplicado em clulas Gram (+) e Gram (-) o cristal violeta (CV) e o iodo penetram facilmente, e dentro das clulas eles se combinam para formar o complexo CV-Iodo, que maior que a molcula de CV que penetrou. Por causa do seu tamanho o complexo no pode ser lavado das clulas de Gram (+) pelo lcool e ento estas clulas permaneceram coradas pelo CV e aparecem azuis. Nas clulas Gram (-) o lcool rompe a camada lipopolissacardica e o complexo lavado atravs da camada fina de peptdeoglicano, que no consegue reter o complexo. Estas clulas so ento contracoradas pelo segundo corante, a Safranina ou Fucsina e aparecem em vermelho. A colorao de Gram no est relacionada com os constituintes qumicos da parede celular, mas sim com sua estrutura fsica, o que confere a caracterstica de positividade ao Gram. Esta colorao o ponto de partida na identificao bacteriana, mas no deve nunca ser utilizada como um diagnstico definitivo. importante ressaltar que a colorao de Gram somente ser um recurso rpido e til, quando corretamente realizada e interpretada. OBJETIVOS - Aprender a tcnica utilizada para a classificao das eubactrias em grupos - Compreender como a tcnica funciona para a colorao das eubactrias em todas as fases do procedimento - Verificar ao microscpio a diferena existente entre bactrias Gram Positivas e Gram Negativas MATERIAL - Cultura de bactrias - Alas de inoculao - Bateria de Gram: Picetas com corantes Cristal Violeta, Soluo de Lugol, lcool 70%, Fucsina ou Safranina - gua - Lminas de microscpio - Microscpio - leo de imerso PROCEDIMENTO Sobre uma lmina de vidro, colocar uma gota de gua. Com a ala de platina tocar levemente na superfcie da colnia e emulsionar o material na gota de gua (caso o microrganismo seja fornecido em suspenso, colocar uma gota desta sobre a lmina). Deixar secar. Passar o esfregao na chama da lamparina trs vezes a fim de fixar o material. Cobrir o esfregao seco com violeta genciana e deixar por 1 minuto. Lavar a lmina com gua e cobrir com soluo de lugol e deixar 1 minuto. Lavar a lmina a lmina e, mantendo a mesma inclinada, pingar gotas de lcool at que no se desprenda mais corante da preparao. Lavar com gua. Cobrir a lmina com soluo de fucsina e deixar por 30 segundos. Lavar a lmina e deixar secar ao ar livre.
19

IFSP - Campus So Roque

Examinar ao microscpio com a objetiva de imerso.

Observar ao microscpio, com objetiva de imerso, as preparaes indicadas. Desenhar e identificar, nos espaos abaixo, as observaes microscpicas

Aumento do microscpio: ______________ Forma da bactria: ______________________________________ Arranjo (se possuir): _____________________________________ Cor: _____________________________________________________ Classificao quanto ao mtodo de Gram: _____________________________

Aumento do microscpio: ______________ Forma da bactria: ______________________________________ Arranjo (se possuir): _____________________________________ Cor: _____________________________________________________ Classificao quanto ao mtodo de Gram: _____________________________ Questes 1) Como voc explica o comportamento das bactrias G + e G - na colorao de Gram? 2) As bactrias do gnero Mycobacterium no se coram pelo mtodo de Gram. Qual seria uma explicao para esse fato? 3) Sabe-se que se ocorrer um aquecimento exagerado no momento da fixao do material, as bactrias G+ passam a se comportar como G-. Qual seria uma explicao para esse fato?

20

IFSP - Campus So Roque

ANEXO: TCNICA PARA COLORAO DE GRAM

21

IFSP - Campus So Roque

22

IFSP - Campus So Roque

23

IFSP - Campus So Roque

24