Laboratório de Microbiologia

DEQ/UFPE

Recife - Pernambuco

1998
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Apresentação

A inexistência de um texto de práticas de Microbiologia

Geral adaptado às nossas condições do nosso laboratório, e destinado
aos cursos superiores de Engenharia Química, Química Industrial e
outros, nos motivaram à realização deste manual. Os experimentos
foram selecionados de modo a englobar a maioria dos assuntos contidos
no programa referentes à primeira unidade do curso e podem ser
facilmente efetuados em laboratórios de recursos limitados.
Cada experimento, poderá ser efetuado por um grupo de
dois ou mais alunos. Muitas vezes o experimento pode ser dividido
entre vários grupos da classe, sendo que cada grupo deve fazer o
experimento numa determinada condição. Neste caso, o instrutor dever
fazer uma discussão a posteiori e global do problema apresentado.
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PRÁTICA N 1

OBJETIVOS:
 Discriminar as funções e/ou aplicações
 Limpar
 Acondicionar

1. FUNÇÕES E/OU APLICAÇÕES DO MATERIAL DO

LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA

1.1. Material Permanente

a. Autoclave - câmara de vapor com parede dupla, equipada com

dispositivos que permitem o enchimento da câmara com vapor
saturado e sua manutenção em determinadas temperatura e pressão
por quaisquer períodos de tempo. O autoclave é um equipamento
indispensável ao laboratório de microbiologia na esterilização de
meios de cultura, água, suspensões etc.(ver modo de operação)

b. Estufas de Esterilização (Fornos de Pasteur) - esteriliza a seco

toda vidraria convenientemente acondicionada, a temperatura de 170
a 200 o C por 1-2 horas.

c. Refrigerador - utilizado na conservação de culturas de

microrganimos sob baixa temperatura, diminuindo o tempo de geração

d. Estufa bacteriológica - favorece o crescimento de microrganismos

pela incubação na temperatura adequada.

Incubação = manutenção do meio semeado em determinadas

condições para promover o desenvolvimento dos microrganismos.
e. Mesa agitadora (rumbeira) - favorece o crescimento de
microrganismos aeróbios, pela dissolução do oxigênio no meio,
através da agitação da mesa, em movimentos rotatórios.

f. Cabine de fluxo laminar - câmara asséptica, dotada de exaustor e

lâmpada fluorescente, sendo utilizada em repiques de microrganismos

g. Fermentador - equipamento onde ocorrem as fermentações, podendo

ser dotado de sistemas de agitação, aeração, refrigeração.

1.2. Vidraria
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a. Tubo de ensaio (tubo de cultura) - utilizado no cultivo de

microrganismos em pequeno volume de meio e na conservação de
culturas puras de microrganismos.

b. Placa de Petri - facilita o isolamento de microrganismos devido à

grande superfície de crescimento que apresenta, possibilitando o
aparecimento de colônias separadas.

Colônia = aglomerado de células em meio sólido, geralmente

originadas de uma única célula progenitora.
c. Pipeta - para diluir preparações diversas e inocular culturas líquidas

Inocular = inserir, intr oduzir

Inóculo (ou semente) = concentração de células suficientes para
cultivar uma de meio com bom rendimento
d. Pipeta Pasteur - é um tubo de vidro espichado em capilar, utilizada
para transportar pequenos volumes de líquido

e. Alça de Drigalsky - obtida a partir de uma pipeta Pasteur longa,

dobrada em ângulo reto e depois em 45 C na chama. É utilizada para
espalhar microrganismos em meio de cultura sólido.

f. Balão de fundo chato - utilizado geralmente para guardar meios de

cultura.

g. Erlenmeyer - utilizado para propagação celular de microrganismos

em meio líquido sob agitação em mesa agitadora.

h. Fernbach - idem

i. Lâmina - para examinar microrganismos ao microscópios

Lâmina Escavada - possui uma ou duas depressões possibilitando

observar a mobilidade de microrganismos suspensos numa gota de
líquido (Ensaio em gota pendente)

j. Lamínula - utilizada para recobrir preparações microscópicas “in

vivo

1.3.Materiais utilizados em titul ações, destilações,

preparações de solução e de meios de cultura - Bequer, bastão
de vidro, bureta, funil, proveta, balão volumétrico, condensador dentre
outros.

1.4. Diversos

a.Lápis dermatográfico - utilizado para escrever em superfície de

vidro
b.Algodão bruto (ou cardado) - serve para proteger o material
esterilizado, do contato com o ar ambiente.
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c.Cabo de Kolle - feito com material isolante, adaptado em três formas

(círculo, ele, agulha). Serve de suporte para um fio de platina ou uma
liga níquel-cromo, sendo utilizado em inoculação de microrganismos.

2. DESINFECÇÃO

a. Desinfecção do ar:

- através da vaporização de uma solução de hipoclorito de sódio a

1%;

- pelo uso de lâmpadas de luz ultravioleta.

- pode ser feita periodicamente com a vaporização de uma

solução de formalina (formol a 40%), no entanto, esta solução não se
pode usar para a desinfecção de ambientes ocupados;

b. Desinfecção da bancada:

Antes da realização de um determinado trabalho de microbiologia,

a bancada deve ser limpa com uma solução detergente seguida de uma
solução alcoólica a 70%.

c. Desinfecção da vidraria:

- vidraria contaminada - deverá ser inicialmente esterilizada em

autoclave para que toda flora presente seja destruída e, em seguida
lavada com uma solução detergente ou sabão neutro;

- vidraria sem contaminação - idem ao anterior, porém sem

necessidade de autoclavação.

Observação: não é costume se utilizar solução sulfocrômica na lavagem

dos materiais do laboratório de microbiologia, uma vez que esta solução
contém cromo que é um metal que pode intoxicar as células vivas e
também por ser de difícil remoção no material

3. ACONDICIONAMENTO

a. Placas de Petri - embrulhadas com papel, geralmente formando

conjunto de 3 unidades. A quantidade depende da necessidade do
trabalho.

b. Pipetas - obtura-se as boquilhas com mecha de algodão (1cm) para

filtrar o ar soprado e para proteger o operador durante a manipulação;
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em seguida são enroladas uma a uma com papel, anotando a capacidade

de cada uma.

c. Tubos de ensaio, balões de fundo chato, Erlenmeyers, fernbachs -

são preparados introduzindo-se um tampão de algodão cardado na boca
do recipiente. Esse tampão deve ser feito, enrolando o algodão no
sentido da fibra em quantidade suficiente para facilitar o manuseio, isto
é, não deve ser nem muito apertado, nem muito frouxo.

d. Lâminas - mergulhadas em solução alcoólica, ficam aptas a serem

utilizadas a qualquer momento, evitando paralelamente que sejam
arranhadas.

ATENÇÃO: Toda vidraria utilizada no laboratório de microbiologia

antes de ser preparada para esterilização deverá estar limpa e seca.

ESTERILIZAÇÃO EM AUTOCLAVE

Operação: ligar o aparelho à rede elétrica. Após a colocação do

material dentro do autoclave, a tampa é fechada e a torneira de remoção
de ar ou vapor é deixada aberta para remover todo o ar. Quando todo o
ar for removido, deixe que um fluxo de vapor fluente persista por cerca
de 5 minutos, antes de fechar a torneira. A partir de então a pressão
internamente irá aumentar e chegar à pressão de esterilização usada,
que é de 15 lb/pol 2 , ou 1atm, ou 1 kgf/cm 2 , correspondendo a uma
temperatura de 121 0 C. O tempo de exposição do material no interior
deste equipamento irá depender do volume de líquido a ser esterilizado.
Para pequenos volumes, até 3 litros, podem ser esterilizados durante 20
a 30 minutos a uma pressão de 15 lb/pol 2 . Com relação a maiores
volumes, será necessário, uma exposição mais prolongada. Quando a
temperatura requerida para a esterilização é alcançada, deve-se começar
a contar o tempo, usando um relógio de laboratório (com alarme).
Decorrido o tempo desliga-se o aparelho da corrente elétrica e mantém-
se a autoclave e a torneira de ar e vapor fechados, até o manômetro
voltar ao ponto zero, pois quando a pressão da autoclave é aliviada
rapidamente, os líquidos dentro dos tubos e frascos fervem
violentamente, fazendo com que os tampões sejam arremessados para
fora dos mesmos.
Concluída a esterilização, abre-se a torneira de vapor; em seguida
a tampa do autoclave é levantada.

PRÁTICA N 2

OBJETIVOS:
 Trabalhar assepticamente
 Cultivar microrganimos
 Diferenciar macroscopicamente fungos, leveduras, bactérias
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INTRODUÇÃO

O homem no seu meio ambiente convive com inúmeras formas de

vida. Os microrganismos ocupam lugar de destaque tanto pelos
benefícios como pelos malefícios que proporcionam ao homem, sendo
encontrados na natureza em abundância e variedade de formas. Para que
os mesmos sejam cultivados artificialmente é necessário conhecer suas
exigências nutricionais e suas condições físicas de crescimento,
trabalhar com material esterilizado e obdecer às normas de prática
asséptica.
Dependendo da finalidade da operação, os microrganimos podem
ser cultivados em: lâminas, placas, tubos, balões, fernbach ou
recipientes de maior capacidade. O cultivo em lâmina é utilizado quando
se deseja acompanhar microscopicamente o crescimento e reprodução de
um microrganismo. Emprega-se o cultivo em placas quando se quer
isolar espécies microbianas distintas, devido à extensa área de superfície
que apresenta. Porém, devido à pequena quantidade de meio em
exposição ao ar, com frequência ocorre ressecamento e/ou aparecimento
de contaminações.
Cultivando os microrganismos em tubos, há facilidade de
manipulação das culturas, além da vantagem de economizar meio e
espaço físico. Para se obter grandes volumes de cultura, o
microrganismo é cultivado inicialmente em balões, fernbach, para depois
ser transferido para recipiente maior, cuja capacidade é função da
necessidade do trabalho.

NORMAS DE PRÁTICA ASSÉPTICA

1. Não trabalhar em corrente de ar, nem ambiente agitado pelo acúmulo

de pessoas;
2. Não falar nem respirar em frente ao recipiente aberto contendo
material de estudo;
3. Abrir o recipiente inclinado junto à chama, onde o ar está rarefeito de
formas vivas;
4. Retirar o tampão de algodão com o dedo mínimo e a palma da mão
sem tocar na boca do recipiente e sem encostar o tampão em lugar
algum;
5. Flambar a boca do recipiente sempre que for iniciar uma inoculação,
para que uma corrente de ar quente seja formada de dentro para fora;
6. Introduzir o mais rápido possível a alça ou pipeta sem tocar nas
paredes do recipiente;
7. Ao terminar a inoculação, flambar a boca do recipiente e ajustar o
tampão, conservando o material ao abrigo da poeira e umidade.
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PROCEDIMENTO PRÁTICO
 Limpar a bancada;
 Marcar todo material (placa e tubos), especificando o tipo de meio e
a fonte da inoculação;
 Fundir dois meios de cultura diferentes (por exemplo AN e CZ);
 Distribuir os meios em placas de Petri e tubos (inclinar);
 Esperar solidificar;
 Fazer inoculações nas superfícies dos meios distribuídos em placas;-
Incubar na temperatura ambiente por 2 a 5 dias, não esquecendo de
guardar placas sem inocular, uma de cada meio utilizado para
controle da esterilização e da eficácia da técnica utilizada.

FONTES: água poluída, fermento de padaria, ar, garganta, mãos,

cabelo, suor etc.

DIFERENCIAÇÃO MACROSCÓPICA DOS MICRORGANISMOS

Os microrganimos crescem e reproduzem quando cultivados e

inoculados adequadamente. Podemos fazer avaliação dos grupos aos
quais eles pertencem, por observações das características das colônias
nos meios em que eles foram cultivados. O crescimento em meio líquido
pode ser evidenciado pela turvação, pela formação de pequena massa de
célula que flotam (velo) ou por sedimentação das células. Em placas de
Petri estuda-se o crescimento dos microrganismos em meio sólido,
observando-se o aparecimento de colônias cujos aspectos
macroscópicos auxiliam na diferenciação de grupos microbianos.

I) Descrição de colônias em placas de Petri:

Após o período de incubação preestabelecido as colônias de

microrganismos cultivados em placas de Petri podem ser descritas de
acordo com os seguintes critérios:
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a. forma:

circular rizoide irregular filamentosa

b. quanto à dimensão

puntiforme com menos de 1 mm de diâmetro

c. cromogênese

-cor do pigmento
-pigmento solúvel ou insolúvel no meio

d. superfície

plana ,elevada, convexa, lisa, rugosa, seca, brilhante, translúcida,

opaca, pregueada, pulverulenta

II) Descrição da cultura em caldo nutriente

O crescimento em caldo de cultura pode apresentar- se sob

diferentes formas.

a. turbidez: mais ou menos acentuada

b. forma da película: uma massa de células que flutua à superfície do

caldo

c. sedimento: depósito de células no fundo do tubo.

Observação:.
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0
. As colônias de fungos são geralmente grandes e filamentosas, algumas
vezes ocupam toda a placa onde estão cultivadas.
. As colônias de leveduras são pequenas e leitosas, enquanto as de
bactérias são menores e brilhantes sendo algumas tão pequenas que se
denominam puntiformes.

PRÁTICA N 3

OBJETIVOS:

 Distinguir os diversos componentes de um microscópio ótico

composto
 Focalizar “in vivo”: células de leveduras em suspensão,
microrganismos (algas, protozoários e bactérias móveis em água)

COMPONENTES DE UM MICROSCÓPIO ÓTICO COMPOSTO

I - PARTE MECÂNICA:

1. Base ou pé - dispositivo de tamanho e peso suficiente para assegurar

o equilíbrio estável do instrumento, evitando trepidações;

2.Corpo, braço ou coluna - haste destinada a sustentar o tubo

microscópico e conter os mecanismos de movimento; alguns apresentam
articulação, facilitando a observação do pesquisador;

3.Tubo ou canhão microscópico - cilindro oco que serve de suporte

para os dois sistemas de lentes (oculares e objetivas);

4. Revólver - peça giratória onde ficam fixadas as lentes objetivas,

permitindo que cada lente possa ser colocada em foco ( uma de cada
vez),
isto é, em coincidência com o eixo ótico;

5. Platina - plataforma horizontal com uma abertura circular no centro

por onde passam os raios luminosos. Existem platinas móveis;

6. Pinça ou presilhas - alças flexíveis e ajustáveis, situadas na platina.

São utilizadas para fixar a lâmina;

7. “Charriot”- dispositivo facultativo que permite a movimentação da

lâmina em dois sentidos: horizontal e vertical, pela manipulação de dois
parafusos;
8. Sistema de cremalheira - peça munida de dentes, controlada pelos
parafusos macrométrico e micrométrico;
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a) Macrométrico - ocasiona diferentes aproximações entre a objetiva e a

preparação, variando a distância vertical de vários centímetros. Serve
para trazer o objeto ao foco aproximado;

b) Micrométrico - permite mínimos deslocamentos verticais da ordem de

centésimos de milímetros, sendo utilizado na focalização final;

Observação: Nos microscópios mais modernos existe um único

parafuso que oferece o controle destes dois movimentos.

II - PARTE ÓTICA

1. Fonte luminosa:

1.1. Natural - luz solar

1.2. Artificial - lâmpada
1.2.1. Direta - quando a lâmpada está fixada no eixo ótico
1.2.2. Indireta - quando se utiliza fonte luminosa anexa ao
microscópio.

2. Espelho - girando em torno de um eixo, é utilizado para refletir os

raios luminosos; pode ser côncavo ou plano, aumentando ou diminuindo
a intensidade da luz, respectivamente;

3. Diafrágma - controla a extensão angular do feixe luminoso,

reduzindo o ângulo do cone de luz, de modo que não exceda o diâmetro
da objetiva após atravessar o objeto;

4. Condensador - conjunto de lentes convergentes que projeta sobre a

preparação o feixe de luz em forma de um amplo cone; por
deslocamentos verticais diminui ou concentra a luz no objeto;

5. Lentes objetivas - são as lentes que ficam próximas ao objeto,

formando na parte superior do tubo microscópico uma imagem invertida
e ampliada do objeto. Podem ser: a) a seco - quando o meio entre o
objeto e a lente é o ar, podendo ser de pequeno, médio ou grande
aumento; b) de imersão - quando a lente fica mergulhada numa camada
de líquido;

6. Sistema de lentes oculares - apresenta um conjunto de lentes: lente

de campo (corretora) que corrige a esfericidade da imagem e a lente
ampliadora que atua em conjunto com o observador como uma simples
lente de aumento, aumentando a imagem formada pela objetiva.

MANIPULAÇÃO DO MICROSCÓPIO

1. Instalação do aparelho
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Retirar o microscópio da caixa ou armário pelo braço e colocá-lo
na mesa apropriada (chumbada e nivelada); a seguir ligar a fonte
luminosa e dispor a objetiva no revólver e regular a altura do banco, de
maneira a permitir um trabalho confortável.

2. Iluminação de campo

Se a luz utilizada é uma luz natural, usar a face plana do espelho,

caso contrário, a face côncava. Em qualquer caso, a luz deve cobrir
completamente a superfície do espelho e este deve estar centrado de
maneira que o cone luminoso refletido atravesse completamente o
condensador (que deve estar completamente levantado, com o diafragma
aberto) bem como a abertura da platina, de tal sorte que o campo do
microscópio (isto é, o espaço da platina visualizado com a ocular) fique
totalmente iluminado.

3. Adaptação da preparação

Colocar a lâmina contendo a preparação sobre a platina e prendê-

la, depois, com o auxílio do Charriot, deslocar o conjunto de tal forma
que a preparação contida na lâmina, fique sobre a abertura da platina,
perfeitamente iluminada pelo cone luminoso.

4. Escolha da objetiva

a) preparações a fresco (“In vivo”): trabalhar apenas com objetivas a

seco, começando pela de menor aumento;

b) preparações coradas (“In vitro”):

- focalizar inicialmente com a objetiva a seco de menor aumento;

- girar o revólver de maneira que nenhuma das objetivas fique em uso;

- colocar sobre a preparação uma pequena gota de óleo de imersão;

- colocar no eixo ótico a objetiva de maior aumento (imersão)

5. Iluminação da preparação

Para as preparações coradas que dão imagens por absorção, usar

o máximo de iluminação com o condensador completamente elevado e o
diafragma totalmente aberto. Para as preparações a fresco, que dão
imagens por refração, iluminar menos a fim de que o fenômeno seja mais
perceptível. Começar descendo o condensador, a uns dois terços da sua
abertura, depois olhando pela ocular, regular o cone luminoso, fechando
aos poucos o diafragma.

6. Focalização
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É a operação que consiste em trazer o objeto para o foco da
objetiva, formando a imagem que, ampliada pela ocular, será vista pelo
observador. A focalização consta das seguintes etapas:

a) girar o revólver colocando a objetiva de menor aumento no eixo

ótico;

b) ajustar a iluminação de campo;

c) centralizar a preparação;

d) aproximar ao máximo a preparação, da objetiva de menor aumento,

por meio do mecanismo de movimento. Durante este trabalho deverá ser
observada a aproximação diretamente com a vista, não devendo ser
utilizado a ocular;

e) observando então pela ocular, imprimir movimento moderado de

afastamento entre a preparação e a objetiva, até que seja distinguida a
imagem do objeto;

f) movimentar o micrométrico para focalização final;

g) regular o diafragma e o condensador para visualizar com mais

nitidez;

h) para trocar de objetiva basta o revólver e em seguida ajustar o foco

imprimindo movimentos lentos no micrométrico;

i) ao término da observação, girar o revólver até a menor objetiva e

apagar a luz. Retirar a lâmina e colocar num recipiente com detergente.

OBSERVAÇÃO: Quando o microscópio é binocular deve-se ajustar a

distância inter-ocular de tal forma que o observador visualize um só
campo de luz. Trabalhando com microscópio monocular, procurar
manter ambos os olhos abertos, a fim de evitar fadiga.

7. Causas de erro na observação

a) Obscuridade total do campo - má centralização do aparelho de

iluminação

b) Obscuridade parcial - revólver mal centrado, verificar se o ponto em

que há resistência não foi atingido ou foi ultrapassado.

c) Falta de nitidez da imagem

- preparação invertida ou com sujos;

- ocular suja - verificar se rodando-a, o sujo acompanha o movimento;

limpar a objetiva;
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- objetiva suja ou com arranhão - limpar com mistura xilol-éter;

- aparelho de iluminação - falta de centralização, poeiras depositadas ou

objetos estranhos interpostos na marcha dos raios;

d) Dificuldade subjetiva

Corpúsculos de forma diversas que parecem deslocar-se no

campo. Com alguma prática, verifica-se que eles são independentes da
preparação, e provêm do observador; repousar um pouco e repetir a
operação;

e) Movimento Brauniano

Quando os microrganismos deslocam-se num só sentido devido à

correntes líquidas formadas por evaporação da água durante a
observação nas preparações “In vivo”. Salientando que o movimento
dos microrganismos é aleatório.

8. Conservação dos microscópios

O aparelho deve estar sempre protegido, seja com capa plástica,

seja com caixa própria e guardado em ambiente provido de luz artificial
para evitar o crescimento de fungos. A cada utilização o pó do
microscópio deverá ser removido com um pano limpo.

Evitar a ação de vapores ácidos e contato com reativos; só

manuseá-lo com mãos limpas; só observar preparações limpas e ter o
cuidado de não deixar escorrer nada sobre a platina ao adaptar a
preparação. Se isto ocorrer, limpar imediatamente, se necessário com
água destilada, enxugando a seguir.

As oculares devem ser limpas externamente com papel de seda e

internamente, por um técnico, só quando necessário.

A objetiva de imersão é limpa com papel de filtro ou algodão

umedecido com uma mistura de xilol e éter na proporção de 1:1, que
deve ser imediatamente removido com papel ou algodão limpo.

A permanência de xilol sobre a lente causa desvitrificação da

mesma.

Nunca deixe ficar óleo na lente, pois ali resinifica e depois para
limpar, exige excesso de dissolvente, podendo este penetrar no sistema,
dissolvendo o bálsamo que liga as diversas partes.

As objetivas a seco são limpas com um linho macio e

ocasionalmente, com papel umedecido com água destilada.

A parte interior das objetivas não deve ser limpa usualmente e

quando é feito deverá ser praticada por pessoa habilitada. Deve-se
remover a objetiva e passar suavemente um pincel macio ou uma bucha
de pano macio na extremidade de uma haste. Não se deve assoprar para
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evitar a umidade. Esta operação deverá ser feita com muito cuidado
para não descentralizar as objetivas.

As lentes do aparelho de iluminação são limpas como as demais,

com freqüência, pois delas depende a boa iluminação fornecida.

A parte mecânica é limpa e polida com uma flanela e a cremalheira

com óleo detergente fino.

Para uma boa conservação do microscópio o operador deverá

seguir uma rotina diária que vai desde uma simples remoção do pó até
uma lubrificação mensal de todas as partes móveis com um óleo fluido.
A cada trimestre o aparelho deve ser enviado a um técnico especializado
para uma inspeção rigorosa, limpeza e lubrificação geral.

PRÁTICA N 4

OBJETIVOS:
 Realizar coloração simples
 Observar microrganismos diferentes sob objetiva de imersão
 Diferenciar leveduras de bactérias considerando o tamanho celular

OBSERVAÇÕES “IN VITRO”

Os microrganismos são usualmente transparentes, t ornando difícil

o estudo de detalhes morfológicos quando são examinados em seu
estado natural, assim torna-se necessário a utilização de técnicas de
coloração.
As observações microscópicas “in vitro” são realizadas com o
microrganismo previamente fixado ã lâmina. Nestas condições as células
microbianas são observadas mortas.
Após a fixação, submete-se a preparação à etapa de coloração
pela adição de soluções adequadas em função da técnica de coloração
desejada.
As técnicas de coloração não só facilitam a visibilidade das
células microbianas, como também, propiciam a visualização de
determinadas estruturas celulares em função de afinidades específicas
com determinados corantes, e facilitam identificação de microrganismos
devido a comportamento diferentes frente à ação de soluções
diferenciadoras.
A menos que algum aspecto morfológico específico, dependente
de idade da cultura, deva ser demonstrado, o microbiologista deve usar
sempre cultura nova nas observações microscópicas. As células com o
tempo de cultivo, modificam o metabolismo, alterando a afinidade com
muitos corantes. Excluindo os organismos que têm um tempo de geração
especialmente grande, uma cultura com 24 horas de cultivo dará sempre
bons resultados.
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SUBSTÂNCIAS CORANTES

Segundo Langeron, corantes são substâncias coradas que gozam

da propriedade de transmitir cor a outros corpos.
Muitas são as substâncias corantes empregadas na rotina diária
dos laboratórios, a maioria derivados da anilina, podendo ser
classificados em naturais e artificiais. Entre os naturais destacam-se: o
carmim, a hematoxilina. Os artificiais são agrupados em função dos
grupos químicos presentes e da afinidade com estruturas celulares,
podendo ser:

a) Básicos ou nucleares: violeta de genciana, cristal violeta, verde de

malaquita, azul de metileno, fucsina básica, azul de toluidina, verde de
metila etc.

b) Ácidos ou citoplasmáticos : eosina, fluoresceína, fucsina ácida,

orange G, vermelho congo, ácido picrico etc

c) Neutros: eosinato de azul de metileno e de azul AZUR, giensa etc.

PREPARAÇÃO E FIXAÇÃO DE ESFREGAÇO

Em processos de coloração de rotina, uma boa observação

microscópica depende tanto da preparação do esfregaço como de sua
fixação à lâmina.

TÉCNICA

. Flambar a alça de platina (“em círculo”) ao rubro, deixar esfriar,

conservando-a próxima à chama;

. Depositar com o auxílio da alça, gotas da suspensão microbiana na

lâmina, se for o caso, suspender a amostra da cultura na própria lâmina;

. Espalhar bem o material na lâmina, empregando movimentos

rotacionais na alça de platina ( do centro para a periferia), a fim de se
obter um esfregaço de forma oval, bem fino e uniforme;

. Secar a fina película do material (esfregaço) ao ar ou pela passagem

na chama do bico de Bunsen;

. Fixar o esfregaço, passando o dorso da lâmina três vezes ou mais na

chama, a fim de que o material fique bem aderido à lâmina;

. Deixar a preparação esfriar ao ar e corar.

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A fixação do esfregaço com água pode formar aerossóis
(partículas projetadas durante a fervura de líquidos); evita-se
introduzindo a lâmina no cone azul da chama (parte redutora, a mais
quente), permanecendo alguns instantes a fim de secar o material.

A preparação e fixação do esfregaço requer cuidados evitando-se

tratamentos bruscos, para que as células da amostra a serem observadas
não fiquem aglomeradas dificultando a observação, como também não
tenham seus arranjos característicos destruídos.

COLORAÇÃO SIMPLES

Denomina-se de coloração simples à coloração em que se adiciona

qualquer solução corante ao esfregaço fixado durante um determinado
tempo (30s a 3 min) em função do corante utilizado. Depois lava-se a
lâmina em água corrente, seca-se e observa-se usando a objetiva de
imersão.
Essa coloração tem a finalidade de nos dá uma visão da forma, do
tamanho e dos arranjos das células, bem como de outros detalhes
estruturais.

TÉCNICA

1. Preparar e fixar o esfregaço;

2. Cobrir com algumas gotas de uma solução corante (azul de metileno,
cristal violeta, fucsina, safranina);
3. Deixar o corante agir por 60s;
4. Lavar em água corrente;
5. Secar cuidadosamente na chama ou com papel absorvente;
6. Observar com a objetiva de imersão (não esquecer de colocar 1 gota
de óleo de imersão antes de adaptar a referida objetiva no eixo ótico).

Obsevação: Não se deve facilitar com os papéis absorventes usados,

especialmente se os microrganismos em estudo forem patógenos.

PRÁTICA N 5

OBJETIVOS:
 Realizar coloração Diferencial de Gram
 Observar ao microscópio sob imersão as preparações
in vitro 
 Diferenciar as formas de bactérias (cocos, bacilos) e arranjos
celulares ( em cadeia, tétrades, cúbicos, em cachos).
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COLORAÇÕES DIFERENCIAIS
As colorações diferenciais distinguem grupos de microrganismos
entre si, devido à diferenças químicas existentes entre as células
microbianas.
Nesta técnica de coloração utiliza-se inicialmente soluções de
corantes e mordentes; numa segunda etapa um agente diferenciador;
para finalmente realizar outra coloração que contrasta com a primeira.

COLORAÇÃO DIFERENCIAL DE GRAM

Em 1884, CHRISTIAN GRAM descobriu um método de
coloração, baseado no fato de que, quando certas bactérias são coradas
pelo cristal de violeta e depois tratadas pelo iodo (solução iodo-
iodetada, dita lugol),forma-se um composto de coloração escura entre o
iodo e o corante, o qual é fortemente removido pelo tratamento
subseqüente com álcool (diferenciador). São as bactérias Gram
positivas, as que tomam o corante de Gram (cristal violeta). Outras
bactérias, ditas Gram negativas, deixam-se descorar facilmente pelo
álcool. Assim sendo, se após a ação do álcool, fizermos uma coloração
de fundo pela safranina ou pela fucsina básica, as bactérias Gram
negativas aparecerão vermelhas.

MECANISMO DA COLORAÇÃO DE GRAM

As bactérias Gram positivas e Gram negativas interagem com o
corante cristal violeta devido à ligações irônicas entre os grupos básicos
dos corantes e grupos ácidos dos constituintes celulares. O iodo em
solução penetra nos dois tipos de células e forma um precipitado com o
corante. O agente descorante (álcool etílico ou acetona) nas células
Gram negativas passa facilmente através da membrana celular
dissolvendo o complexo corante-iodo, deixando a célula incolor. Nas
células Gram positivas o álcool penetra com dificuldade e a dissolução
do complexo é lenta. A maior parte do complexo corante-iodo
permanece na célula que retém assim a sua coloração. Pela adição do
contra-corante (safranina ou fucsina básica) as células Gram positivas
permanecem violetas enquanto as Gram negativa interagem com o
mesmo, ficando vermelhas.
As diferenças químicas entre os constituintes da parede celular
das bactérias são responsáveis pela retenção ou não do cristal violeta.
Todas as células desprovidas de parede celular (certos
protozoários), bem como as células artificialmente despojadas de parede
celular (mesmo que sejam Gram positivas), comportam-se como Gram
negativas.
As bactérias Gram negativas contêm uma concentração elevada de
lipídeos, e suas paredes são também mais delgadas com relação às
bactérias Gram positivas. O descoramento extrai os lipídeos aumentando
a porosidade ou permeabilidade da parede favorecendo a retirada do
complexo cristal violeta-iodo.
As paredes celulares das bactérias Gram. positivas em virtude de
sua composição diferente (menos conteúdo lipídico, presença de ácido
 1
9
teicóico, maior quantidade de peptoglicano (mucocomplexo) cujos
aminoácidos encontram-se mais intercruzados, deixando a parede mais
compacta), tornam-se desidratadas durante o tratamento com o
descorante; a porosidade diminui, a permeabilidade se reduz e o
complexo cristal violeta-iodo não é extraído.
O método de Gram é dentre os processos de coloração para
bactérias, o mais importante.
Todas as leveduras quando submetidas a esta coloração
comportam-se como Gram positivas, enquanto os fungos filamentosos e
para os protozoários, geralmente não se aplica esta técnica por não ser
conveniente.

REGRAS GERAIS DA COLORAÇÃO PELO MÉTODO DE GRAM

1 - Os cocos, são geralmente Gram-positivos, com exceção dos
pertencentes ao gênero Neisseria (Gonococos , Meningococos ).
2 - Os bacilos, são geralmente Gram-negativos, excetuando-se os
pertencentes aos gêneros: Corynebacterium (bacilo diftérico); Bacillus
(B. subtilis ), B. antracis (do carbúnculo) e Clostridium (bacilo do
tétano
Cl . tetani ; Cl. botulinum (do botulismo).

TÉCNICA DA COLORAÇÃO DE GRAM

1. Preparar um esfregaço;
2. Depois de frio cobrir o esfregaço com solução de cristal de violeta
(1 minuto);
3. Cobrir com solução de lugol (mordente) - 1 minuto;
4. Lavar em água corrente;
5. Descorar pelo álcool absoluto (evitar o descoramento deficiente ou
em excesso;
6. Lavar em água corrente;
7. Contrastar, rapidamente com safranina (30 segundos);
8. Lavar em água corrente;
9. Secar com papel fino;
10.Examinar com objetiva de imersão.

AMOSTRAS:

 Bacillus subtilis
 Escherichia coli
 Aerobacter aerogenes
 Staphylococcus aureus
 Sarcina lutea
 Micrococcus
 2
0

PRÁTICA N 6

OBJETIVOS:
 Realizar coloração Especial de esporos
 Observar ao microscópio sob imersão as preparações coradas

COLORAÇÃO DE ESPOROS

Os esporos são células de resistência, não sendo característica

predominante de todos os microrganismos. Algumas bactérias são
capazes de formar esporos, como por exemplo: bactérias do gênero
Bacillus e Clostridium.

TÉCNICA

1. Preparar o esfregaço e fixar;

2. Cobrir o esfregaço com papel de filtro;
3. Adicionar o corante verde malaquita;
4. Aquecer até emissão de vapores;
5. Repetir as operações 3 e 4 por 3 minutos;
6. Lavar em água corrente;
7. Adicionar safranina (0,5 a 1 minuto);
8. Lavar em água corrente;
9. Secar e observar em imersão

RESULTADO: Os esporos coram-se em verde e o resto da célula em

vermelho.

PRÁTICA N 7

OBJETIVOS:
 Preparar meios de cultura de usos em práticas microbiológicas
 Distribuir convenientemente, esterilizar em autoclave

PREPARAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA

 2
1
Meios de cultura são associações de substâncias que permitem o
cultivo dos microrganismos fora do seu meio natural.
Nas preparações dos meios de cultura todos os nutrientes devem
ser dissolvidos em água para que possam ser absorvidos pelas células
microbianas.
Nos laboratórios geralmente utiliza-se água destilada no preparo
destes meios, no entanto nas unidades industriais costuma-se utilizar
água de rios ou poços. A água deve ter boa origem e composição
química constante; quando necessário, deve ser devidamente tratada.
Como constituinte básico dos meios de cultura, além da água,
pode-se especificar: as fontes de carbono, as fontes de nitrogênio, os
sais. Em meios de cultura solidificados, além destes componentes deve-
se introduzir agar, gelatina ou sílica gel com a função específica de
solificar esses meios.

NORMAS DE PREPARAÇÃO

 Pesagem dos componentes: os diversos componentes dos meios de

cultura podem ser pesados separadamente, ou consecutivamente num
único recipiente (Béquer). Para quantidades inferiores a 1g utiliza-se
uma balança analítica (semi-analítica).
O agar-agar geralmente é pesado separadamente, sendo o valor da
pesagem em função da quantidade do meio a ser distribuído nos
recipientes. Utiliza-se de 10 a 20g deste agente solidificante em pó para
cada litro de solução nutriente.

 Solubilização dos componentes: adicionar os nutrientes previamente

pesados a um Béquer contendo água destilada em quantidade suficiente
para dissolvê-los. Os extratos de carne e de leveduras podem ser
aquecidos ligeiramente para facilitar a solubilização. Deve-se evitar o
uso de fogo direto e prolongado para não haver queima do material e
consequente escurecimento do meio.
O agar não é solúvel a frio, devendo se necessário ser
solubilizado em um banho-maria ou em autoclave a vapor fluente.

 Ajuste do pH nos meios: deve-se deixar resfriar ao máximo os meio

líquidos, antes de acertar o pH. No caso dos meios solidificados ajustar
na menor temperatura em que não haja solidificação.
São empregadas para ajuste do pH soluções de hidróxido de
sódio ou ácido clorídrico a 0,1 N, conforme o caso. Na maioria dos
casos pode-se verificar o pH através do uso de um papel de tornassol.
Em meios solidificados, o pH ácido só deverá ser ajustado depois
da esterilização para evitar a hidrólize do agar quando em temperatura
elevada. Neste caso o pH ácido é ajustado com uma solução estéril de
ácido lático.

 Clarificação: em alguns casos há necessidade de clarificação dos

meios que durante o preparo tornam-se turvos. A clarifição pode ser
feita simplesmente pelo calor ou pelo uso de clara ou albumina de ovo,
 2
2
aquecendo em seguida até ebulição e filtrando-se em gase ou algodão
hidrófilo.

 Distribuição, esterilização e conservação: os meios de cultura

depois de preparados são distribuídos em recipientes adequados (tubos,
balões, Erlenmeyeres), especificando o respectivo nome ou sigla e a
data do preparo dos mesmos. Terminada a distribuição, os tubos, balões
ou Erlenmeyers são arrolhados com algodão ou tampas metálicas
especiais, acondicionados em cestas e levados à esterilização em
autoclave. A temperatura e o tempo de exposição neste equipamento
depende da composição e da quantidade de meio de cultura recipiente
(vide esterilização).
Após a esterilização, os meios são resfriados espera-se 72 horas
antes de usá-los ou estocá-los em geladeira, a fim de que se possa
detectar algum tipo de contaminação, ou falha de esterilização.

COMPOSIÇÃO DE MEIOS DE CULTURA

AGAR NUTRITIVO

Extrato de carne..................................... 3,0g

Peptona................................................. 5,0g
Agar..................................................... 20,0g
Água destilada....................................... 1000ml
pH = 6,8 - 7,0

BATATA GLICOSE AGAR - BGA

Batatas descascadas e cortadas em fatias ..... 300g

Água destilada.......................................... 1000ml

As batatas devem ser manuseadas com o mínimo de exposição ao ar.

Aquecer em 500ml de água até completamente cozidas. Filtrar através
de gase, completar o volume para 1000ml e adicionar:

Agar ........................................................ 15,0g

Glicose..................................................... 20,0g

pH = 6,8 - 7,0

CZAPECK (CZ)

NaNO 3 (nitrato de sódio)........................... 3,0g

K 2 HPO 4 (fosfato monoácido de potássio)...... 1,0g
MgSO 4 (sulfato de magnésio)...................... 0,5g
KCl (cloreto de potássio).......................... 0,5g
 2
3
FeSO 4 (sulfato ferroso).............................. 0,01g
Sacarose.................................................. 30,0g
Agar........................................................ 20,0g
Água destilada..........................................1000ml
pH = 6,6

CALDO GLICOSADO

Extrato de carne....................................... 3,0g

Peptona................................................... 5,0g
Glicose...................................................10,0g
Água destilada.........................................1000ml
pH = 6,8 - 7,0

CALDO LACTOSADO

Peptona.................................................. 5,0g
Extrato de carne...................................... 3,0g
Lactose.................................................. 5,0g
Água destilada........................................1000ml
pH = 6,8 - 7,0

GODOY

Peptona................................................. 1,0g
Caldo-de-cana........................................ 500g
Agar...................................................... 15g

Juntar ao caldo-de-cana uma clara de ovo batida. Aquecer até

fervura, filtrar completando o volume até 1000ml. Juntar a peptona e o
agar.

GLICOSE LEVEDURA (GL)

Peptona .................................................. 10,0g

Extrato de carne....................................... 3,0g
NaCl....................................................... 5,0g
Extrato de levedura................................... 10,0g
Glicose.................................................... 10,0g
Agar........................................................ 12-15g
Água destilada.......................................... 1000mL
pH 6,9 -7,1

EMB

Peptona ................................................... 10,0g

Lactose..................................................... 5,0g
Sacarose................................................... 5,0g
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4
K 2 HPO 4 .................................................... 2,0g
Agar......................................................... 12-15g
Água destilada........................................... 1000mL

Dividir em balões de 250 mL, 100mL e 200mL de meio.

Esterilizar a 120 o C por 20 minutos.

Quando for distribuir em placas para uso, fundir e adicionar

para cada 100 mL de meio, 1mL de solução estéril de eosina (4%) e
1mL de solução estéril de azul de metileno (0,65%). As placas podem
ser guardadas por uma semana em refrigerador.

GLICOSE AGAR (GA)

Extrato de carne .................................... 3,0g

Peptona................................................. 5,0g
Glicose................................................. 10,0
Agar..................................................... 20,0g
Água destilada....................................... 1000ml
pH = 6,8 - 7,0

VERDE-BRILHANTE

Peptona ................................................... 10,0g

Lactose..................................................... 10,0g
Bile de boi................................................ 20,0g
Verde brilhante....................................... 0,0133g
Água destilada........................................... 1000mL
pH = 7,2

Autoclavar a 115 o C por 15 min. Para adicionar o verde brilhante

pode-se preparar uma solução a 0,1% em água destilada (0,1g de verde
brilhante em 100mL de água destilada) e dela juntar 13,3 mL ao meio de
cultura.
Distribuir 10mL do caldo em tubos grande com tubinhos de
Duhran.

SORO DE LARANJA

Triptona................................................ 10,0g
Extrato de leveduras............................... 3,0g
Glicose................................................. 4,0g
Fosfato dipotássico................................ 15,0g
Soro de laranja......................................200,0ml
Água destilada.......................................800,0ml
 2
5
Preparar o soro de laranja aquecendo 1 litro do suco recém-
extraído, a aproximadamente 93 C. Adicionar 30g de diatomácea e
misturar. Filtrar com sucção através de um funil de Buchner usando
papel de filtro grosseiro recoberto com o auxílio de filtração. Refiltrar
os primeiros mililitros. Ajustar o pH a 5,5 , distribuir em recipientes
adequados.

PRÁTICA N 8

OBJETIVOS:
 Isolar bactérias, fungos filamentosos e leveduras de ambientes
diversos
 Identificar morfologicamente as espécies isoladas

Os microrganismos em seus ambientes naturais (água, solo, ar

etc) existem como uma população mista. Para que possamos estudar
uma determinada espécie de microrganismo nas suas características
morfológicas e bioquímicas individuais é necessário separá-la das
diversas espécies contidas nessa população , obtendo uma cultura pura e
é formada por microrganismso derivados de uma única célula original.

O isolamento de microrganismos requer técnicas adequadas de

inoculação destes microrganismos em meios de cultura adequados que
possibilitem o seu rápido crescimento, livre de contaminações.
Para o cultivo, em condições laboratoriais, de microrganismos é
necessário o conhecimento de suas exigências nutritivas e das condições
físicas requeridas. Extensas pesquisas determinaram exigências
nutritivas de muitas espécies de microrganismos e esta informação
resultou no desenvolvimento de numerosos meios de cultura. Por causa
da grande variedade das necessidades nutritivas dos microrganismos há,
também, grandes diferenças na composição dos meios utilizados. Do
mesmo modo, existem amplas variações no que se refere ao ambiente
físico que favorece seu crescimento. Alguns microrganismos, por
exemplo crescem abaixo de 0 C; outros exigem temperatura acima de
45C e podem desenvolver-se até mesmo a 70 C. certas bactérias
necessitam do oxigênio atmosférico; outras são indiferentes ou inibidas
pelo oxigênio.

MÉTODO DE ISOLAMENTO DE CULTURAS PURAS

 2
6

 Técnica de sementeira em superfície e de esgotamento do inóculo:

- Com o uso de uma alça de platina, coloca-se uma porção de

espécime na superfície de um meio de cultura com ágar.

- Espalhar a amostra de lado a lado, na superfície da placa ,

tracando linhas de acordo com as figuras 1 e 2 , de modo que as
bactérias individuais se separem umas das outras.

- Incubar as placas na temperatura adequada

- Examinar as placas que apresentarem colônias isoladas

- Selecionar uma colônia característica da espécie estudada e

anotar seus aspectos macroscópicos, tais como: tamanho, forma,
consistência, cor da colônia e de seu reverso, se há pigmento solúvel
etc.

- Transferir com a ajuda de uma alça de platina, material da

colônia escolhida para um tubo contendo meio inclinado e incubar à
temperatura e tempo adequados.

- Examinar as características do microganismo através de

observações microscópicas “in vivo” e “in vitro” com colorações
específicas utilizando para isso um microscópio ótico luminoso.

 Técnica da placa derramada (pour-plate): O princípio da técnica é

o da diluição do material em tubos de agar liquefeito.

- Transfere-se uma alça de platina da suspensão original para o

tubo A (agar fundido). O tubo é rolado entre as mãos, permitindo a
mistura completa do inóculo com o meio. Transferências similares são
efetuadas do tubo A para o B e, deste, para o C.

- Os conteúdos de cada tubo são derramados em placas separada

- Incubar as placas na temperatura e período de tempo adequados

- Examinar as placas que apresentarem colônias isoladas

- Selecionar uma colônia característica da espécie estudada e

anotar seus aspectos macroscópicos, tais como: tamanho, forma,
consistência, cor da colônia e de seu reverso, se há pigmento solúvel
etc.
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7
- Transferir com a ajuda de uma alça de platina, material da
colônia escolhida para um tubo contendo meio inclinado e incubar à
temperatura e tempo adequados.

- Examinar as características do microganismo através de

observações microscópicas “in vivo” e “in vitro” com colorações
específicas utilizando para isso um microscópio ótico luminoso.

 Técnica das diluições sucessivas: se o microrganismo suspeito,

numa população mista, está presente em número maior do que outros
germes, pode ser obtido em cultura pura por meio de uma série de
diluições em meios apropriados.

- Transfere-se 1ml ou 1g do material a ser examinado para um

Erlenmeyer A contendo 99ml de água estéril. Homogeniza-se
permitindo a mistura completa do inóculo com a água. A partir daí,
transfere-se 1ml para um tubo B com 9ml de água estéril, agita-se e
repete a operação para os tubos restantes (C, D, E). Obtém-se assim
uma série de diluições decimais.

- De cada tubo transferir para duas placas estéreis, amostra de

1ml, depois adicionar a cada placa cerca de 15 ml de meio fundido e
resfriado a 45 o C;

- Incubar as placas na temperatura e período de tempo

adequados;

- Examinar as placas que apresentarem colônias isoladas.

Maiores detalhes sobre esta técnica estão no esquema apresentado

na figura 2.

FIGURA 2 - Esquema de diluição da técnica das diluições sucessivas.

Visando facilitar o entendimento e treinar o alunos nas técnicas

de isolamento acima referidas, foram selecionadas de algumas técnicas
sobre bactérias, bolores e leveduras. Estas técnicas deveram ser
 2
8
realizadas em grupo de três alunos e realizadas num período de 1 a 2
semanas.

ISOLAMENTO DE Streptomyces sp. DO SOLO

MATERIAL

Amostra de terra seca

Erlenmeyer com 99 ml de água estéril
4 tubos de ensaio contendo cada um 9 ml de água estéril
1 balão com meio de Czapeck (CZ)
Placas de Petri esterilizadas
Tubos de ensaio com meio Cz
Placa com meio AVP

TÉCNICA

1 o DIA - Pesar um grama de terra e suspender no Erlenmeyer que

contém água estéril. Agitar para obter uma suspensão dos
microrganismos existentes.
Transferir com pipeta estéril, 1 ml da suspensão para um dos
tubos de água estéril; agitar bem e deste tubo retirar 1ml e
transferir para outro tubo com água e assim sucessivamente
sendo realizada uma série de diluições 10 - 2 , 10 - 3 , 10 - 4 ,10 - 5 ,10 - 6 .
De cada tubo transferir para duas placas estéreis, amostra de
1ml, depois adicionar a cada placa cerca de 15 ml de meio de
CZ fundido e resfriado a 45 o C.

Agitar para homogenizar. Esperar o meio solidificar em

repouso por mais ou menos 3 minutos, inverter as placas e
incubar à temperatura ambiente durante 5 a 7 dias.
2 o DIA - Observar as colônias que cresceram e escolher colônias típicas
 2
9
de Streptomyces: pequenas, secas, de cores variadas. Na
escolha da colônia devem ser anotados aspectos
macroscópicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos,
características da superfície da colônia, brilho, presença de
pigmento solúvel. Transferir com alça de platina parte da
colônia para um tubo com CZ e para uma placa com meio de
CZ e para uma placa com AVP, fazendo nesta última uma
estria no centro com auxílio de uma alça em L. Incubar.

3 o DIA - Observar o crescimento no tubo de cultura. Testar a atividade

anti-microbiana da cepa utilizando a placa de AVP que
apresenta uma estria central; inocular diferentes germes
(bactérias, leveduras) fazendo estrias perpendiculares à estria
central, começando a 30 mm da estria central e terminando
junto à mesma. Fazer placas testemunhas inoculando apenas as
estrias de microrganismos-testes. Incubar as placas a 30 o C ou
37 o C dependendo da temperatura dos microrganismos-testes.

4 o DIA - Observar se houver inibição e medir (o halo correspondente) a

distância em milímetros do crescimento do microrganismo-
teste até a estria de Streptomyces.

OBSERVAÇÃO: A prática deverá ser encerrada mediante a entrega

do relatório e do tubo de cultura isolada.
 3
0

ISOLAMENTO DE BACILOS ESPORULADOS DO SOLO

MATERIAL

Amostra de terra seca

1 Erlenmeyer com 99 ml de água estéril
1 tubos de ensaio contendo 10ml de caldo glicosado
4 tubos de ensaio contendo cada um 9 ml de água estéril
1 balão com meio de Agar Nutritivo (AN)
Placas de Petri esterilizadas
Tubos de ensaio com meio AN

TÉCNICA

1 o DIA - Pesar um grama de terra e suspender no erlenmeyer que

contém água estéril. Agitar para obter uma suspensão dos
microrganismos existentes.
Transferir com pipeta estéril, 1 ml da suspensão para um tubo
de caldo glicosado. Imergir o tubo em água fervente pelo
espaço de tempo de 5 minutos. Resfriar e transferir 1 ml do
caldo para um tubo com 9ml de água estéril, agitar para
homogenizar e repetir a operação para mais 3 tubos. Obtém-se
assim uma série de diluições decimais 10 - 4 ,10 - 5 ,10 - 6 . De cada
diluição transferir para duas placas estéreis, amostra de 1ml,
depois adicionar a cada placa cerca de 15 ml de meio de AN
fundido e resfriado a 45 o C.

Agitar para homogenizar. Esperar o meio solidificar em

repouso por mais ou menos 3 minutos, inverter as placas e
incubar à temperatura ambiente durante 48 horas.
2 o DIA - Observar as colônias que cresceram e escolher colônias típicas
 3
1
de bacilos esporulados: grandes, com bordos irregulares, de
superfície rugosa. Na encolha da colônia devem ser anotados
aspectos macroscópicos, tais como: tamanho, cor, forma,
bordos, brilho, presença de pigmento solúvel. Transferir com
alça de platina parte da colônia para um tubo com AN e
incubar à temperatura ambiente.

3 o DIA - Observar o crescimento no tubo de cultura em AN. Fazer

lâmina ïn vivo” para observar se há movimento. Realizar uma
coloração de Gram e uma de esporos.

OBSERVAÇÃO: A prática deverá ser encerrada mediante a entrega

do relatório e do tubo de cultura isolada.
 3
2

ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS MESOFÍLICAS DE ÁGUA

MATERIAL

Amostra de água poluída

1 Erlenmeyer com 99 ml de água estéril
4 tubos de ensaio contendo cada um 9 ml de água estéril
1 balão com meio de Agar Nutritivo (AN)
Placas de Petri esterilizadas
Tubos de ensaio com meio AN

TÉCNICA

1 o DIA - Pesar 1 mL da amostra e suspender no Erlenmeyer que contém

99mL de água estéril. Agitar para obter uma suspensão dos
microrganismos existentes.
Transferir com pipeta estéril, 1 ml da suspensão para um dos
tubos de água estéril; agitar bem e deste tubo retirar 1ml e
transferir para outro tubo com água e assim sucessivamente
sendo realizada uma série de diluições 10 - 3 , 10 - 4 ,10 - 5 ,10 - 6 . De
cada diluição transferir para duas placas estéreis, amostra de
1ml, depois adicionar a cada placa cerca de 15 ml de meio de
AN fundido e resfriado a 45 o C.

Agitar para homogenizar. Esperar o meio solidificar em

repouso por mais ou menos 3 minutos, inverter as placas e
incubar à temperatura ambiente durante 48 horas.
2 o DIA - Observar as colônias que cresceram e escolher colônias típicas
de bactérias. Na escolha da colônia devem ser anotados
 3
3
aspectos macroscópicos, tais como: tamanho, cor, forma,
bordos, consistência, características da superfície da colônia
brilho, presença de pigmento solúvel. Transferir com alça de
platina parte da colônia para um tubo com AN e incubar à
temperatura ambiente.

3 o DIA - Observar o crescimento no tubo de cultura em AN. Fazer

lâmina ïn vivo” para observar se há movimento. Realizar uma
coloração de Gram e uma de esporos.

OBSERVAÇÃO: A prática deverá ser encerrada mediante a entrega

do relatório e do tubo de cultura isolada.
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4

ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS MESOFÍLICAS DE

SORVETE

MATERIAL

Amostra de sorvete
1 Erlenmeyer com 90 ml de água estéril
4 tubos de ensaio contendo cada um 9 ml de água estéril
1 balão com meio de Agar Nutritivo (AN)
Placas de Petri esterilizadas
Tubos de ensaio com meio AN

TÉCNICA

1 o DIA - Pesar 10 mL da amostra e suspender no Erlenmeyer que

contém 90mL de água estéril. Agitar para obter uma suspensão
dos microrganismos existentes.
Transferir com pipeta estéril, 1 ml da suspensão para um dos
tubos de água estéril; agitar bem e deste tubo retirar 1ml e
transferir para outro tubo com água e assim sucessivamente
sendo realizada uma série de diluições 10 - 2 ,10 - 3 , 10 - 4 ,10 - 5 ,10 - 6 .
De cada diluição transferir para duas placas estéreis, amostra
de 1ml, depois adicionar a cada placa cerca de 15 ml de meio
de AN fundido e resfriado a 45 o C.

Agitar para homogenizar. Esperar o meio solidificar em

repouso por mais ou menos 3 minutos, inverter as placas e
incubar à temperatura ambiente durante 48 horas.
2 o DIA - Observar as colônias que cresceram e escolher colônias típicas
de bactérias. Na escolha da colônia devem ser anotados
 3
5
aspectos macroscópicos, tais como: tamanho, cor, forma,
bordos, consistência, características da superfície da colônia
brilho, presença de pigmento solúvel. Transferir com alça de
platina parte da colônia para um tubo com AN e incubar à
temperatura ambiente.

3 o DIA - Observar o crescimento no tubo de cultura em AN. Fazer

lâmina ïn vivo” para observar se há movimento. Realizar uma
coloração de Gram e uma de esporos.

OBSERVAÇÃO: A prática deverá ser encerrada mediante a entrega

do relatório e do tubo de cultura isolada.
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6

ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS COLIFORMES

MATERIAL

Amostra de água de banheiro, ou pedaço de queijo coalho ou carne de

sol;
Tubos com meio de verde-brilhante-lactose-bile (VB)
Tubos de ensaio contendo caldo lactosado
1 balão com meio de Agar Nutritivo (AN)
Placas de Petri com meios diferenciais (EMB ou Endo ouTTC)
Tubos de ensaio com meio AN

TÉCNICA

1 o DIA - Inocular o tubo de Verde-brilhante com o material a ser

pesquisado, incubar a 35 o C por 48 horas.

2 o DIA - Inocular o tubo fermentado em placas de Petri com meio

diferencial seguindo um dos esquemas abaixo.

Incubar à 35 o C durante 48 horas.

o
3 DIA - Observar as colônias que cresceram e escolher colônias típicas
 3
7
de coliformes. Na escolha da colônia devem ser anotados
aspectos macroscópicos, tais como: tamanho, cor, forma,
bordos, consistência, brilho, presença de pigmento solúvel.
Transferir com alça de platina parte da colônia para um tubo
com AN e para um tubo com caldo lactosado (CL) incubar à
35 o C.

4 o DIA - Observar se o tubo de caldo lactosado fermentou e então se o

tubo tiver dado resultado positivo (presença de bolha de ar)
prosseguir a análise com o tubo de cultura com o meio de
agar-nutritivo (AN). Realizar uma coloração de Gram e uma de
esporos. Anotar os resultados e comparar com a literatura.

OBSERVAÇÃO: A prática deverá ser encerrada mediante a entrega

do relatório e do tubo de cultura isolada.
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8

ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS DO IOGURTE

(Lactobacillus e Streptococcus )

MATERIAL

Uma amostra de Iogurte natural

Placa de Petri com meio de Agar-glicose-levedura (GL)
Tubos de ensaio com meio de leite desengordurado
Tubos de ensaio com meio de Agar-glicose-levedura (GL)

TÉCNICA

1 o DIA - Fundir e resfriar o meio de cultura; em seguida distribuir em

placas de Petri. Quando o meio solidificar fazer estrias com o
material pesquisado na superfície de cada uma das placas.
Cada aluno deverá realizar a técnica de esgotamento utilizando
apenas uma placa, segundo o desenho abaixo:

ou então, com uma alça em L fazer estrias paralelas a partir da

gota depositada na primeira placa e continuando em mais duas
placas do mesmo meio, segundo o esquema abaixo:

Agitar para homogenizar. Esperar o meio solidificar em

 3
9
repouso por mais ou menos 3 minutos, inverter as placas e
incubar em condições anaeróbicas ou sob tensão de CO 2 (por
exemplo, utilizando uma lata cuidadosamente no fundo da lata
e a seguir fechar bem, por um período de 48 a 72 horas.

2 o DIA - Observar as colônias que cresceram e escolher colônias

distintas.
Na escolha da colônia devem ser anotados aspectos
macroscópicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos,
consistência, brilho, presença de pigmento solúvel. Transferir
com alça de platina parte da colônia para um tubo com meio
de GL e para um tubo com meio de leite (o qual pode conter
um corante indicador). Incubar.

3 o DIA - Observar o se há coagulação no tubo com meio de leite.

Verificar se há crescimento no tubo de GL e realizar uma
coloração de Gram. Incubar. Comparar com os dados obtidos
na prática com os fornecidos pela literatura.

OBSERVAÇÃO: A prática deverá ser encerrada mediante a entrega

do relatório e do tubo de cultura isolada.
 4
0

ISOLAMENTO DE BOLORES DO SOLO

MATERIAL

Uma amostra de terra seca

Um Erlenmeyer com 99 ml de água estéril
4 tubos com 9 ml de água estéril
Um balão com meio de Czapeck (CZ) fundido
8 placas de Petri estéreis
4 tubos e quatro placas com meio de Czapeck

TÉCNICA

1 o DIA - Pesar um grama de terra e suspender no Erlenmeyer que

contém água estéril. Agitar para obter uma suspensão dos
microrganismos existentes.
Transferir com pipeta estéril, 1 ml da suspensão para um dos
tubos de água estéril; agitar bem e deste tubo retirar 1ml e
transferir para outro tubo com água e assim sucessivamente
sendo realizada uma série de diluições 10 - 2 , 10 - 3 , 10 - 4 ,10 - 5 ,10 - 6 .

De cada tubo transferir para duas placas estéreis, amostra de

1ml, depois adicionar a cada placa cerca de 15 ml de meio de
CZ fundido e resfriado a 45 o C.

Agitar para homogenizar e incubar à temperatura ambiente

durante 5 a 7 dias.
2 o DIA - ( 5 a 7 dias depois) Observar as colônias que cresceram e
escolher colônias típicas de bolores: filamentosas, grandes, de
cores variadas.
Na escolha da colônia devem ser anotados aspectos
 4
1
macroscópicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos,
consistência, brilho, presença de pigmento solúvel. Transferir
com alça de platina parte da colônia para um tubo com CZ e
para uma placa com meio de CZ. Incubar.

3 o DIA - Observar o crescimento da colônia gigante na placa e a partir

da cultura crescida no tubo, preparar um cultivo em câmara
úmida. Incubar

4 o DIA - Observar a lâmina ao microscópio para determinar tipos de

hifas, tipo de esporos assexuados, e se possível a classe e o
gênero do fungo em estudo

OBSERVAÇÃO: A prática deverá ser encerrada mediante a entrega

do relatório e do tubo de cultura isolada.
 4
2

ISOLAMENTO DE BOLORES DO MATERIAL MOFADO

MATERIAL

Uma amostra de pão, queijo, fruta ou outro material mofado

Placa de Petri com meio de Czapeck (CZ) e Batata- glicose-agar (BGA)
Tubos de ensaio com meio de CZ e BGA

1 o DIA - Fundir e resfriar os meios de BGA e CZ; em seguida acidificar

com ácido lático a pH 3,5. Distribuir em placas de Petri.
Esperar solidificar. Com o auxílio de uma alça em agulha
incubar material mofado no centro de cada um dos meios
contidos em placas. Incubar à temperatura ambiente durante 5
dias.

2 o DIA - ( 5 a 7 dias depois) Observar as colônias que cresceram e

escolher colônias típicas de bolores: filamentosas, grandes, de
cores variadas.
Na encolha da colônia devem ser anotados aspectos
macroscópicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos,
consistência, brilho, presença de pigmento solúvel. Transferir
com alça de platina parte da colônia para um tubo com CZ e
para uma placa com meio de CZ. Incubar.

3 o DIA - Observar o crescimento da colônia gigante na placa e a partir

da cultura crescida no tubo, preparar um cultivo em câmara
úmida. Incubar

4 o DIA - Observar a lâmina ao microscópio para determinar tipos de

hifas, tipo de esporos assexuados, e se possível a classe e o
gênero do fungo em estudo
 4
3

OBSERVAÇÃO: A prática deverá ser encerrada mediante a entrega

do relatório e do tubo de cultura isolada.
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4

ISOLAMENTO DE FUNGOS DO AÇÚCAR CRISTAL

MATERIAL

Açúcar cristal
Erlenmeyer com 99 ml de água estéril
Balão com batata- glicose-agar (BGA) acidificado a pH 3,5
Balão com meio de Czapeck (CZ)
Placas de Petri estéreis
Tubos de ensaio com BGA e CZ

TÉCNICA

1 o DIA - Pesar 11g de açúcar e transferir para o Erlenmeyer com água

estéril, agitando bem para dissolver.
Transferir porções de 1 e 2 ml para placas de Petri.
Os meios de cultura CZ e BGA devem ser fundidos, refriados
a 45 o C e em seguida acidificados com ácido lático a pH 3,5.

Adicionar os meios de cultura às placas. Deixar esfriar para

solidificar (2 a 3minutos) e incubar à temperatura ambiente
durante 5 a 7 dias.

2 o DIA - (5 a 7 dias depois) Observar as colônias que cresceram e

escolher colônias típicas de bolores: filamentosas, grandes,
de cores variadas.
Na encolha da colônia devem ser anotados aspectos
macroscópicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos,
consistência, brilho, presença de pigmento solúvel. Transferir
com alça de platina parte da colônia para um tubo com CZ e
para uma placa com meio de CZ. Incubar.

3 o DIA - Observar o crescimento da colônia gigante na placa e a partir

da cultura crescida no tubo, preparar um cultivo em câmara
úmida. Incubar
4 o DIA - Observar a lâmina ao microscópio para determinar tipos de
hifas, tipo de esporos assexuados, e se possível a classe e o
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5
gênero do fungo em estudo.

OBSERVAÇÃO: A prática deverá ser encerrada mediante a entrega

do relatório e do tubo de cultura isolada.
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6

ISOLAMENTO DE LEVEDURAS DE FRUTA

MATERIAL

Fruta (uva, maçã, abacaxi, mamão, cajá etc.)

Erlenmeyer com 50 ml de caldo glicosado (CG)
Meio de glicose-agar (GA)
Ácido lático
Placas de Petri estéreis
Tubos de ensaio estéreis
Tubos de ensaio para fermentação com caldo glicosado

TÉCNICA

1 o DIA - Acidificar o caldo glicosado com ácido lático a pH 3,5.

Cortar a fruta com casca e macerar com ajuda de uma faca.
Tranferir para o Erlenmeyer com o meio acidificado, agitar e
incubar à temperatura ambiente, durante 48 a 72 horas.

2 o DIA - Adicionar os meios de cultura às placas. Deixar esfriar em

repouso para solidificar. Com uma alça de platina, depositar
uma gota do caldo na superfície do meio contido na placa de
Petri e fazer estrias por esgotamento seguindo o esquema
abaixo:

ou então, com uma alça em L fazer estrias paralelas a partir

da gota depositada na primeira placa e continuando em mais
duas placas do mesmo meio, segundo o esquema a seguir:
 4
7

Incubar à temperatura ambiente por 48 horas.

3 o DIA - Observar as colônias que cresceram e escolher colônias

típicas de leveduras.
Na encolha da colônia devem ser anotados aspectos
macroscópicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos,
consistência, brilho, presença de pigmento solúvel. Transferir
com alça de platina parte da colônia para um tubo com GA e
para um tubo com meio de CG. Incubar.

4 o DIA - Analisar o crescimento no tubo com caldo glicosado e

observar se a levedura é fermentativa. Realizar uma
observação “in vivo” e com coloração simples. Anotar os
aspectos microscópicos do microrganismo em estudo, tais
como: tipo de reprodução (fissão, gemulação, esporulação),
presença de grânulos, de vacúolos.

OBSERVAÇÃO: A prática deverá ser encerrada mediante a entrega

do relatório e do tubo de cultura isolada.

I
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8

ISOLAMENTO DE LEVEDURAS DE CALDO-DE-CANA

MATERIAL

Caldo de cana fermentado (24horas)

Meio de glicose-agar (GA)
4 Placas de Petri estéreis
Tubos de ensaio estéreis
Tubos de ensaio para fermentação com caldo glicosado

TÉCNICA

1 o DIA - Adicionar os meios de cultura às placas. Deixar esfriar em

repouso para solidificar. Com uma alça de platina, depositar
uma gota do caldo na superfície do meio contido na placa de
Petri e fazer estrias por esgotamento seguindo um dos
esquemas abaixo:

Incubar à temperatura ambiente por 48 horas.

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9
2 o DIA - Observar as colônias que cresceram e escolher colônias
típicas de leveduras.
Na encolha da colônia devem ser anotados aspectos
macroscópicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos,
consistência, brilho, presença de pigmento solúvel. Transferir
com alça de platina parte da colônia para um tubo com GA e
para um tubo com meio de CG. Incubar.

3 o DIA - Analisar o crescimento no tubo com caldo glicosado e

observar se a levedura é fermentativa. Realizar uma
observação “in vivo” e com coloração simples. Anotar os
aspectos microscópicos do microrganismo em estudo, tais
como: tipo de reprodução (fissão, gemulação, esporulação),
presença de grânulos, de vacúolos.

OBSERVAÇÃO: A prática deverá ser encerrada mediante a entrega

do relatório e do tubo de cultura isolada.
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0

PRÁTICA N 9

OBJETIVOS:

 Determinar a densidade celular por turbidimetria

 Obter o número de células por contagem em placa
 Confeccionar uma curva de calibração de uma espécie microbiana

Um cultivo de bactérias ou leveduras em meio líquido, atua como

uma suspensão coloidal, refletindo ou pondo obstáculos a passagem da
luz através do mesmo. Até certo ponto, a luz que foi absorvida ou
refletida é proporcional a concentração de células presentes na
suspensão. A turvação que apresenta um tubo de ensaio contendo uma
cultura em crescimento é provocada pela absorção e reflexão da luz.
Portanto, ao se medir a percentagem de absorção da luz (turbidimetria)
ou a reflexão da luz (nefelometria) se pode estimar a concentração de
células presentes. Ficaremos restritos ao primeiro caso.
Para as medidas turbidiméricas da massa celular, podem ser
utilizados instrumentos como um espectrofotômetro ou fotocolorímetro.
Na turbidimetria, a capacidade do cultivo para deter a luz, se
expressa como percentagem de luz transmitida, sendo esta percentagem
inversamente proporcional à concentração de células. A percentagem da
transmitância (T) é igual a I/I 0 , sendo I 0 , a intensidade da luz incidente
e I, a intensidade da luz transmitida.
Para verificar a relação direta proporcional entre a concentração
de células e a absorbância da luz (Densidade Ótica, DO = log I 0 /I),
vamos medir a turbidez de várias diluições (Figura 3) de uma suspensão
de uma cultura de E.coli e proceder a contagem em placa destas
diluições.

Material

- Microrganismos:

Escherichia coli (bactéria)

Saccharomyces cerevisiae (levedura)

- Meios de cultura:

Caldo lactosado
Caldo glicosado

- Equipamentos:

Agitador magnético
Espectrofotômetro
- Diversos:
 5
1
Tubos ou cubetas para o espectrofotômetro
Pipetas de 5ml esterilizadas

Métodos

- Fazer a diluição das culturas, conforme mostra a figura 3.

- Calibrar o espectrofotômetro, utilizando luz com comprimento de

onda variando entre 500 e 600nm. Colocar no aparelho um tubo
contendo 5ml de meio de caldo lactosado ou caldo glicosado estéril.
Com este tubo (“branco”) o espectrofotômetro é ajustado para D.O.
igual a zero, ou transmitância igual a 100%;

- retirar o “branco” do aparelho e colocar o tubo da cultura. Fazer a

leitura da D.O. e anotar o resultado. Imediatamente proceder a
contagem em placa, da cultura no tubo que foi feita a leitura no
espectrofotômetro.

- repetir o mesmo procedimento para os demais tubos da cultura diluída,

ajustando sempre o espectrofotômetro contra o “branco”, a cada leitura,
e agitando bastante o tubo com a cultura;

- para a contagem em placa, dos tubos contendo a cultura de E.coli e S.

cerevisiae fazer diluições até 1x10 - 7 e plaquear em duplicata 1ml das
diluições de 1x 10 - 4 a 1x10 - 7 .

FIGURA 3. Diluição da cultura para leitura no espectrofotômetro

Resultados
 5
2
Anotar na tabela, os resultados das leituras das densidades óticas
e das correspondentes contagens em placas.

Após obter o número de células por contagem em placa, das

diluições, relacionar num gráfico, os valores da D.O. das diversas
diluições na ordenada, contra os números de microrganismos
correspondentes que se determinou. Assim, obtemos uma curva de
calibração para o referido microrganismo nas condições do experimento.

Diluições da cultura Densidade Ótica Concentração celular

(ml) (D.O) (células/ml)

1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64

PRÁTICA N 10

OBJETIVOS:
 Obter a concentração de células de leveduras pelo uso de câmara
de contagem (câmara de Neubauer)

A contagem direta por microscópio, é a mais rápida, e é levada a

efeito com a contagem de organismos num volume conhecido da cultura.
Esta enumeração é feita com o auxílio de lâminas espessas, conhecidas
como câmaras de contagem. As mais comuns são as de Petroff-Hausser,
Neubauer e as de Helber. estas câmaras apresentam uma área reticulada,
com pequenos quadrados de superfície conhecida. Fazendo parte do
conjunto, existe uma lamínula que recobre os pequenos quadrados, de
modo que a altura destes à lamínula é conhecida.

No nosso experimento, as leveduras serão contadas numa câmara

de Neubauer, que apresenta uma área dividida em quadrados com
1/400mm 2 ; a câmara é coberta com uma lamínula, deixando uma altura
de 1/10mm, i.é., de cada quadrado à lamínula. Assim sendo o volume
que fica acima de cada quadrado é de 1/4000 mm 3 .

Esta contagem inclui organismos viáveis e mortos, sendo

denominada de contagem total de células.

Este método de contagem direta, tem a vantagem de fornecer um

resultado quase imediato, no entanto tem a desvantagem de não se ter
a distinção entre células vivas e mortas.
 5
3

Material

- Microrganismo:
Cultura de Saccharomyces cervisiae

- Reagentes:
Solução salina fisiológica (0,85% NaCl)

-Equipamentos:

Microscópio ótico comum

Câmara de contagem de Neubauer
Bico de Bunsen

- Diversos:
Pipeta Pasteur

Métodos

-Adicionar com uma pipeta Pasteur ou similar, uma gota da

suspensão da cultura de levedura sobre a área reticulada da câmara;
-colocar a lamínula sobre a gota. Alternativamente, pode-se
colocar primeiro a lamínula, e deixar-se que a suspensão do
microrganismo, que sai da pipeta, escorra por ação capilar sob a
lamínula;
- esperar cerca de dez minutos, até que o material sedimente;
- usando a objetiva de 40-45X, contar as leveduras em cerca de
10 quadrados dispostos em “X” (ver figura 2).

Resultados

- Calcular o número de leveduras/mL, contidas em uma suspensão

utiliza-se a seguinte fórmula

Concentração Celular (leveduras/mL) = n x 25000 x diluição

onde n= número de células dos quadrados

Exemplo:

n = 232

diluição 1:100

Concentração celular = 232 x 25000 x 100 = 5,8 x 10 8 células/mL

 5
4

PRÁTICA 11

OBJETIVO: Determinar uma curva de calibração para a determinação

da concentração da levedura Saccharomyces cerevisiae a partir do
fermento prensado.

INTRODUÇÃO:

A partir do conhecimento do teor de matéria seca em fermento

prensado comercial é possível preparar uma suspensão padrão de
leveduras, de determinada concentração, com bastante confiabilidade.
Através de uma série de diluições convenientes dessa suspensão padrão
são obtidas novas suspensões de concentrações conhecidas. Finalmente,
a turbidez provocada no meio pelas diferentes suspensões de leveduras
é medida através de um instrumento adequado e os valores obtidos são
relacionados com as respectivas concentrações por intermédio de uma
expressão matemática.

As diluições adequadas são obtidas através de tentativas de forma

a abranger um intervalo de concentrações que atenda as seguintes
condições:

1 a .) Deve haver uma correlação linear entre a concentração e o

logaritmo da trasmitância e;

2 a ) Os valores das transmitâncias obtidas devem estar situadas na região

de maior sensibilidade na escala do instrumento utilizado.

TÉCNICA:

1. Em um copo de Béquer de 50ml pesar, em balança semi-analítica,

2g de fermento prensado, anotando o valor exato. Diluir em um
pouco de água e transferir, analiticamente, para um balão de 1000ml.
Completar o volume e homogeneizar;

2. A partir da concentração da suspensão padrão escolher os valores

para as concentrações, de forma a cobrir uma determinada faixa de
concentrações;

3. Realizar uma série de diluições com um conjunto de pipetas e

balões volumétricos adequados. Utilizar como sugestão os valores da
tabela abaixo.

Suspensão Conc. da Fator de Modo de

número diluição, diluição preparo
X (g/l) (ml da susp.
padrão)
1 0,1 20x 25 até 500
2 0,2 10x 25 até 250
 5
5
3 0,3 6,67x 15 até 100
4 0,4 5x 20 até 100
5 0,5 4x 50 até 200
6 0,6 3,33x 15 até 50
7 0,8 2,5x 20 até 50
8 1,2 1,67x 15 até 25

4. Homogeneizar cada suspensão e transferir para um tubo de

espectrofotômetro previamente ajustado ao comprimento de onda de
610 nm.

5. Realizar, pelo menos, duas leituras do valor da absorbância para

cada concentração. O espectrofotômetro é calibrado antes de cada
leitura, com um “branco” de água destilada.

6. Construir um gráfico, colocando no eixo das ordenadas os valores

da concentração X (g/l) e no eixo das abssissas os valores da
absorbância (D.O).

7. Fazer uma regressão linear com o auxílio de um programa de

computador ou utilizando o método dos mínimos quadrados.

8. Calcular o coeficiente de correlação, r, e determinar o intervalo

de concentrações, X 1  X 2 , no qual a expressão é válida.

Observação: A curva de calibração obtida pelos pontos descritos é

válida apenas para o fermento prensado utilizado na sua confecção.

PRÁTICA 12

OBJETIVOS:

 Avaliar o crescimento de um microrganismo em diferentes meios de

cultivo;
 Confeccionar a curvas de crescimento celular, utilizando o método
turbidimétrico;
 Calcular o tempo de geração (G )e a velocidade específica máxima
de crescimento ( m á x ) e a produtividade celular (P) em cada meio de
cultivo.

INTRODUÇÃO:
 5
6

O crescimento microbiano pode ser definido em termos, tanto da

massa, como também do número de células. Em condições de
crescimento exponencial, massa celular e número de células permanecem
proporcionais, embora a relação entre estes dois valores possa variar em
determinadas condições de cultivo. O crescimento de um microrganismo
em diferentes meios de cultivo, por exemplo, pode ser avaliado pela
determinação da massa celular que, por sua vez, pode ser medida
indiretamente pela turvação de uma suspensão.
A evolução do crescimento pode ser avaliada utilizando um
cultivo em batelada em condições de incubação controladas. Com
leituras da densidade óptica (absorbância) de uma série de amostras
retiradas a intervalos de tempo regulares, e com auxílio da curva padrão
de calibração, é possível confeccionar uma curva de crescimento
relacionando a concentração celular (ordenada) com o tempo de cultivo
(abcissa). Nesta curva são, então, identificadas as diferentes fases do
crescimento microbiano.
Durante a fase exponencial de crescimento pode-se então
determinar o tempo de geração (G) e a velocidade específica máxima
de crescimento (  M Á X . ).
Pode-se ainda determinar a produtividade celular (P)que é a
relação entre a variação da concentração celular pela variação do
tempo de cultivo. Este valor deverá ser determinado pela seguinte
equação:

P= (X f - X o )/(t f - t o ) )

Onde: X o = Concentração celular inicial, (g/l)

X f = concentração celular final , (g/l)
t f = tempo final, (h)
t o = tempo inicial, (h)

MATERIAL

- Microrganismo
Saccharomyces cerevisiae

- Meios de cultura
Caldo nutritivo suplementado com 1% de açúcar (glicose, frutose e
sacarose)

- Equipamentos:
Espectrofotômetro
Mesa agitadora (rumbeira)
Balança semi-analítica

- Diversos:
Cubetas do espectrofotômetro
Tubos de ensaio estéreis
3 Erlenmeyers, 1000ml
 5
7
Pipetas, 10ml

MÉTODOS

1. Preparar 1,5 litros de caldo nutritivo, distribuir 500ml em 3

Erlenmeyers de 1000ml de capacidade. Adicionar no primeiro 5g de
glicose, no segundo 5g de sacarose e no terceiro 5g de frutose,
homogeneizar e esterilizar a 121 o C por 15 minutos. Deixar esfriar;

2. Retirar uma amostra de 5-10ml de cada meio para servir como um

branco;

3. Colocar os Erlenmeyers na balança semi-analítica e inocular

esterilmente cerca de 0,2g a 0,4g do microrganismo Saccharomyces
cerevisiae (fermento prensado );

4. Retirar 3ml de amostra com uma pipeta estéril, imediatamente após

a inoculação, correspondente, portanto, ao tempo zero. Efetuar a
leitura da Absorbância (ou densidade óptica). Anotar o resultado;

5. Colocar os Erlenmeyers na mesa agitadora, tendo o cuidado de fixá-

los bem. Ligar a agitação a 9000 rpm. Deixá-los sob agitação
durante todo o cultivo;

6. Retirar amostras de 3ml a intervalos de 1 hora, até que se observe

um mínimo de três valores idênticos, ou muito próximos, de
densidade óptica (DO). Anotar os resultados;

7. Construir um gráfico para cada meio de cultivo, colocando no eixo

das ordenadas os valores do tempo (h) e no eixo das abcissas
concentração X (g/l);

1. Calcular a velocidade específica máxima de crescimento (  m á x ) o

tempo de geração (G ) e a produtividade celular ( X/t) em cada
meio de cultivo;

1. Comparar os resultados obtidos e tirar conclusões a respeito do meio

mais adequado ao crescimento.

Modelo de registro tabular

Meio de Cultivo:
Tempo Densidade Concentração
(h) Óptica X(g/l)
(DO)
0
1
2
3
 5
8
4
5
6
7
8