UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

Faculdade de Tecnologia – FT

ST107 - C “Biologia Aplicada I”

Relatórios:
 COLORAÇÃO DE GRAM
 CULTIVO E CONTROLE DE MICRORGANISMO
 FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA
 OBSERVAÇÃO MICROSCÓPICA DE BACTÉRIAS
 PRESENÇA DE MICRORGANISMO NO AR
 CONTROLE DE MICROORGANISMO E AÇÃO DE
AGENTES DESINFETANTES
 DILUIÇÃO EM SÉRIE E PLAQUEAMENTO DE
MICRORGANISMO DO SOLO

Profª Gisela Umbuzeiro

Andressa Nagai de Oliveira RA 104603
Ana Beatriz Almeida RA: 104551
Anna Beatriz Torrano RA 101537
Fabrício Pimpim RA 108566
Laís Luz RodriguesNeto RA 102980
Maria Allyna Pereira de Azevedo Venâncio RA 105350

Junho/2010
Limeira
 Coloração de Gram

Introdução:
A coloração de Gram foi desenvolvida em 1884 pelo bacteriologista
dinamarquês Hans Christian Gram. Ela é um dos procedimentos de coloração
mais úteis, pois classifica as bactérias em dois grandes grupos: gram-positivas
e gram-negativas [1].
Os diferentes tipos de bactérias reagem de modo diferente à coloração
de Gram por conta de diferenças estruturais em suas paredes celulares que
afetam a retenção ou liberação de uma combinação de cristal violeta e iodo,
denominada complexo violeta-iodo (CV-I) [1].
Entre outras diferenças, as bactérias gram-positivas têm uma parede
celular mais espessa de peptideoglicana (dissacarídeos e aminoácidos) que as
bactérias gram-negativas. Além disso, as bactérias gram-negativas contem
uma camada de lipossacarideo (lipídeos e polissacarídeos) como parte de sua
parede celular [1].
Em resumo, as células gram-positivas retêm o corante e permanecem
de cor púrpura e as células gram-negativas não retêm o corante [1].

Objetivo:
Identificar bactérias de acordo com a forma e coloração [2].

Materiais:
- Alça de Inoculação;
- Álcool (para descoloração);
- Bico de Bunsen;
- Lâminas;
- Lamínulas;
- Microscópio;
- Óleo de Imersão;
- Pinças;
- Pipeta Pasteur;
- Suspensão Bacteriana;
- Corantes: cristal violeta, iodo, álcool, safranina [2].
Métodos:
• Preparação do esfregaço bacteriano (para uma cultura em meio
líquido)
- passar algodão embebido em álcool para limpar uma lâmina de vidro
- coletar uma pequena porção da cultura em meio líquido com o auxílio de uma
alça de inoculação e colocá-la sobre a lâmina, espalhando-a para formar uma
película bem fina
- fixar o esfregaço passando a lâmina três vezes sobre a chama
- deixar a lâmina esfriar.

• Método de Coloração de Gram

- cobrir o esfregaço seco e fixado pelo calor com a solução de cristal violeta e
esperar por 1 minuto (esse processo é conhecido como coloração primária)
- para remover o excesso da solução de cristal violeta, basta lavar levemente a
lâmina com água corrente ou destilada
- cobrir o esfregaço com a solução de iodo (lugol) e esperar por 1 minuto
- lavar a lâmina com uma solução de álcool-acetona por 30 segundos (essa
solução de álcool-acetona é um agente descorante)
- cobrir o esfregaço com a solução de safranina por 30 segundos
- lavar levemente com água corrente
- esperar a lâmina secar naturalmente, ou secá-la delicadamente com papel
filtro.
Na análise da lâmina no microscópio, não esquecer de utilizar a objetiva
de imersão para o aumento de 100x [2].

Resultados: A tabela abaixo mostra as reações e o aspecto das bactérias

durante o processo da coloração de Gram:

Soluções em ordem de GRAM-POSITIVAS GRAM-NEGATIVAS

aplicação
Cristal violeta – CV As células ficam coradas As células ficam coradas
em violeta em violeta
Solução de iodo (lugol) Formação do complexo Formação do complexo
CV-I no interior das CV-I no interior das
células, que células, que
permanecem violetas permanecem violetas
Álcool As paredes celulares se Ocorre a extração dos
desidratam e ocorre a lipídeos da parede
diminuição da celular, o que aumenta a
porosidade e porosidade e permite
permeabilidade, o que que o complexo CV-I
impede que o complexo seja removido das
CV-I saia das células, células
que permanecem
violetas
Safranina Não afeta as células que As células tomam o
permanecem violetas corante adquirindo uma
cor avermelhada

Considerações finais: Na observação do esfregaço após ser realizada a

coloração de Gram no microscópio foi possível identificar as bactérias de duas
formas: pelo seu formato e cor. Foram observadas bactérias com a forma de
bastonetes e cocos e pela cor, foram identificadas bactérias arroxeadas (gram-
positivas) e avermelhadas (gram-negativas). A maior parte das bactérias que
foram observadas eram gram-negativas.
 Cultivo e Controle de Microrganismos

Introdução:
O material nutriente preparado no laboratório para o crescimento de
microrganismos é denominado meio de cultura. Algumas bactérias podem
crescer normalmente em qualquer meio de cultura, outras necessitam de meios
especiais e existem aquelas que não são capazes de crescer em nenhum meio
de cultura já desenvolvido. Quando microrganismos são colocados em um
meio de cultura para iniciar o crescimento, são chamados de inóculo. Os
microrganismos que crescem e se multiplicam nos meios de cultura são
denominados cultura [1].
Para o cultivo, deve conter os nutrientes corretos para que o microrganismo
cresça, a quantidade de água necessária, o pH ajustado e a quantidade
especifica de oxigênio ou mesmo sua ausência e, o meio deve ser inicialmente
estéril, onde logo após a cultura deverá ser incubada na temperatura adequada
para seu crescimento [1].

Objetivo:
Fazer a semeadura em placa de Petri contendo meio sólido em tubos contendo
meio líquido [2].

Materiais utilizados:
- Placa de Petri;
- Meio PCA;
- Bico de Bunsen
- Alça de platina;
- Inóculo microbiano;
- Pipeta de 1 mL;
- Alça de Drigalsky;
- Tubo de cultura;
- Caldo lactosado [2].

Métodos:
 Semeadura por estrias em placa de Petri
Flambe a alça de platina na chama e espere esfriar. Abra parcialmente a placa
de Petri atrás da chama do bico de Bunsen e faça as estrias em vários
sentidos.

 Semeadura pour plate em placa de Petri

Pipete 1mL do inóculo, abra parcialmente a placa de Petri atrás da chama do
bico de Bunsen e transfira o inóculo, fechando a placa de Petri.

 Semeadura por espalhamento em placa de Petri

Com o auxílio de uma pipeta estéril, retire 0,1 mL de uma cultura de
microrganismo e coloque em uma placa de Petri contendo meio de cultura
sólido. Flambe a alça de Drigalsky em álcool e fogo e espalhe por toda a
superfície da placa.
  Semeadura em meio líquido em tubo de cultura
Flambe a alça de platina na chama e espere esfriar. Introduza a alça no tubo
contendo o inóculo microbiano e transfira para o meio de cultura com caldo
lactosado, flambando sempre a boca do tubo. Feche o tubo e flambe
novamente a alça de platina. Incuba o tubo em estufa bacteriológica e as
placas de maneira invertida e o meio liquido em estufa bacteriológica a 35,5 +/-
0,5°C. [2]

Resultados:
Todos os microrganismos cresceram.

Considerações finais:
 Fermentação Alcoólica

Introdução:
A fermentação libera energia de açucares ou moléculas orgânicas. Tais
como aminoácidos, ácidos orgânicos, purinas e pirimidinas. Não requer
oxigênio (mas algumas vezes pode ocorrer na presença desse), nem o uso do
ciclo de Krebs ou de uma cadeia de transporte de elétrons. Utiliza uma
molécula orgânica como aceptor final de elétrons. Produz somente pequenas
quantidades de ATP, porque grande parte da energia original da glicose
permanece nas ligações químicas dos produtos finais orgânicos, tais como
acido lático ou etanol [1].
Durante a fermentação, os elétrons são transferidos das coenzimas
reduzidas para o ácido pirúvico ou para seus derivados. Esses aceptores finais
de elétrons são reduzidos aos produtos finais. Uma função essencial da
segunda etapa da fermentação é garantir um constante suplemento de NAD+ e
NADP+ para a glicólise poder continuar. Na fermentação ATP é gerado
somente durante a glicólise [1] .
Vários organismos podem fermentar vários substratos; o produto final
depende do microrganismo específico do substrato e das enzimas que estão
presentes e ativas [1].

Objetivo:
Análise de nove casos distintos de fermentação alcoólica [2].

Materiais:
- Agitador Magnético com Aquecedor;
- Banho Maria (Aquecedor);
- Pipetador;
- Bico de Bunsen;
- Espátula;
- Ácido forte (HCl);
- Adoçante;
- Açúcar;
- Água (Fervendo e Morna);
- Base forte (NaOH);
- Tabletes de fermento biológico;
- Gelo;
- Óleo;
- Pipeta graduada (10mL);
- 9 Tubos de Ensaio;
- Pisseta;
- Bexiga[2].

Método:
No primeiro tubo de ensaio, adicionou-se uma espátula bem cheia de açúcar e
15 mL de água morna (à 37ºC).
No segundo tubo de ensaio, com auxílio de uma pipeta graduada de 10mL,
adicionou-se 15mL de água (à 37ºC) e um cubo de fermento biológico.
Em um terceiro tubo, adicionou-se 15mL de àgua (à 37ºC), fermento e uma
espátula de açúcar.
No quarto tubo, foi adicionado 15mL de água (à 37ºC), fermento, uma espátula
de açúcar e 2mL de óleo.
No quinto tubo, foi adicionado 15mL de água (à 37ºC), fermento e cinco gotas
de adoçante.
No sexto tubo de ensaio, foi adicionado 15mL de água (à 37ºC), fermento, uma
espátula de açúcar. Este é para manter no gelo.
Nos tubos sete, oito e nove, adicionou-se água fervendo, base (0,5 mL de
NaOH), ácido (0,5 mL de HCl), respectivamente.
Em todos os tubos, a boca foi fechada com uma bexiga. E todos os tubos, com
exceção do 6, foram mantidos na estufa [2].

Resultados:
O único tubo de ensaio que a bexiga inflou foi o tubo 3 e 4. Com os outros nada
aconteceu.

Considerações finais:
 Observação microscópica de bactérias, algas, fungos, protozoários e
metazoários.

Introdução:
Bactérias estão em todos os lugares e fazem a decomposição da
matéria [1]. As algas são encontradas onde houver quantidade suficiente de
luz, CO2, umidade e nutrientes simples, capazes de sustentá-las e, a maioria é
aquática [1]. A incidência de infecções causadas por fungos tem aumentado,
que ocorrem como infecções hospitalares e em indivíduos com sistema
imunológico comprometido, o que causa bilhões de dólares anualmente.
Porém, também são benéficos, sendo importante na cadeia alimentar porque
decompõem vegetais mortos, etc [2]. Os protozoários são organismos
unicelulares, eucarióticos quimio-heterotróficos e habitam a água e o solo [2].
Organismos multicelulares, móveis e heterotróficos e se desenvolvem a partir
de embriões [1].

Objetivo:
Observar e identificar microrganismos em amostras.

Materiais:
- Pipeta;
- Lâmina;
- Lamínulas;
- Microscópio;
- Amostras.

Método:
Com a pipeta, transfira uma pequena alíquota da amostra para a lâmina
previamente esterilizada. Em seguida, ponha, cuidadosamente para não formar
bolhas de ar, a lamínula (também esterilizada) em cima do líquido. Então,
coloque a lâmina no microscópio e focalize. Para facilitar, observe com a lente
que menos amplia (no caso, a x10), e depois use uma com maior ampliação e
assim por diante.
Resultados:
No laboratório, havia amostras de água do mar, água de aquário, água de um
efluente. Foi achado, em uma lâmina contendo água de aquário, um
nematóide. Usando as folhas de identificação disponíveis no laboratório, o
nematóide foi identificado como sendo do gênero Rabditis sp.
Havia também, disponível para visualização, um microscópio com as algas do
gênero Closterium e recipiente com uma planária. Para vê-la melhor, foi usada
uma lupa.

Considerações Finais:
Em alguns casos, a lamínula pode atrapalhar, uma vez que ela pode impedir
que o microrganismo, caso seja relativamente grande, se locomova ou até
mesmo pode esmagá-lo.
O processo de identificação dos microrganismos é bem difícil, mesmo com o
auxílio das folhas disponíveis no laboratório. Para identificar exatamente um
microrganismo, é preciso um especialista no assunto.
 Presença de microrganismos no ar.

Introdução:
Os microrganismos são seres fundamentais para a existência da vida, não
podem ser visualizados sem auxílio de um microscópio e são formados por
grupos distintos como: bactérias, protozoários, algas, fungos e vírus.
Encontram-se distribuídos em praticamente todos os lugares da natureza.
Estão no ar, na água (mares, rios, lagos e água subterrânea) e no solo. Podem
ser encontrados em maiores quantidades em lugares onde existe grande
quantidade de alimentos (matéria orgânica e inorgânica), umidade e
temperatura apropriada para que possam crescer e se reproduzir.
Dos diversos tipos de microorganismos apenas alguns causam doenças como
a diarréia (origem bacteriana viral ou por protozoários), tuberculose (doença
causada pela bactéria Mycobacterium tuberculosis) e a malária (causada por
protozoários do gênero Plasmodium)

Objetivo da aula: Coletar microorganismo do ar em algum local da UNICAMP

– FT

Materiais utilizados:
- Placas de petri contendo o meio Sabouraud.

Métodos: Escolher um local da faculdade, levar a placa contendo o meio

fechado até o local escolhido, abrir e deixá-la no local por 15 minutos ao ar.
Fechá-la e voltar ao laboratório.
Com a experiência finalizada as placas serão incubadas em estufa
bacteriológica por 24 – 48 horas para que o resultado seja observado.

Resultados: Após 48 horas o meio estava limpo. O local escolhido (posto de

saúde da UNICAMP – FT) estava totalmente livre de microorganismos
presentes no ar.

Considerações finais: Apesar de incomum, a experiência mostrou que o ar do

posto de saúde da Unicamp estava sem nenhum microrganismo, felizmente.
Mas talvez não seja um resultado surpreendente, uma vez que consultórios e
hospitais tendem a ser livres de microrganismos.
 Controle de Microrganismos – Ação de Agentes Desinfetantes

Introdução:
A concentração de um desinfetante afeta sua ação, ele sempre deve ser diluído
exatamente como especificados pelo seu fabricante. [1]
A natureza do material deve ser considerada, assim como se o fato do
desinfetante entra ou não facilmente em contato com os micróbios. [1]
A desinfectação é um processo gradual, e alguns casos para se obter resultado
pode ser necessário deixar um desinfetante na superfície por várias horas. [1]

Objetivo:
Fazer a semeadura em placa de Petri contendo meio sólido em tubos contendo
meio líquido [2].

Materiais utilizados:
- Placas de Petri contendo o meio
PCA;
- Cotonetes;
- Substâncias desinfetantes (álcool
98%, formol, cloro 2%);
- Bico de Bunsen;
- Água peptonada;
- Barbante;
- Pinça;
- Inóculo microbiano [2].

Métodos:
 Método 1 - Presença de microorganismos no corpo.
Pegar o cotonete estéril e introduzi-lo no tubo que contem água peptonada,
passar este cotonete na mão suja de uma pessoa do grupo para que sejam
coletadas as bactérias que contem a flora da mão. Após coletar as bactérias
estriar a placa com PCA.
A primeira parte da experiência já esta pronta.
A mesma pessoa que coletou-se as bactérias da mão suja irá lavar bem as
mãos com detergente. Com outro cotonete estéril será introduzido novamente
na água peptonada e novamente passado nas mãos, agora limpas. Após
coletar as bactérias estriar a placa com PCA.
Com a experiência finalizada as placas serão incubadas em estufa
bacteriológica por 24 – 48 horas para que o resultado seja observado [2].

 Método 2 – Ação de substância desinfetante sobre objetos.

Com uma pinça esterilizada, pegar um barbante na ponta e mergulhá-lo no
tubo contendo inóculo microbiano, colocá-lo sobre a placa de petri contendo o
meio PCA.
Pegar outro barbante mergulhá-lo no tubo contendo inóculo, após isso
mergulhá-lo em uma das soluções desinfetantes, colocá-lo sobre a placa de
Petri contendo o meio PCA.
Com a experiência finalizada as placas serão incubadas em estufa
bacteriológica por 24 – 48 horas para que o resultado seja observado [2].
Resultados:
No método 1, foi deduzido que a integrante do grupo, que coletamos as
bactérias da mão limpa e suja, não lavou a mão o tempo o suficiente para que
as bactérias fossem eliminadas.
Na parte da placa Petri com o meio PCA que foi estriado o cotonete contendo
bactérias na mão suja, foi observados algumas pequenas colônias de
bactérias. Já na outra parte que foi estriado o cotonete contendo bactérias na
mão limpa havia mais colônias de bactérias que na parte da mão suja.
No método 2, o resultado obtido foi que a substância desinfetante
utilizada (formol) agiu no barbante e eliminou todas as bactérias que ele
continha. Na placa de Petri com o meio PCA que foi colocado o barbante
embebido no inóculo sem nenhum agente desinfetante, fungou. Já na placa
que estava o barbante embebido com o desinfetante não aconteceu nada.

Considerações finais:
No ponto de vista biológico, a mão lavada estava com mais bactéria do que a
mão considerada suja, pois, por a mão lavada e consequentemente molhada,
mais bactéria e esporos de fungos, presentes na própria água ou no ar, estão
propensas a grudar na mão.
 Diluição em série e plaqueamento de microrganismos do solo

Introdução:
Apesar de não usual, o “método direto” ou “meio de enriquecimento” é utilizado
para a verificação de certos microrganismos, em pequena quantidade em
relação a outros, em amostras de fezes ou solo. Esse método consiste em
diluir solo em água, e com a mistura obtida, diluir mais três vezes em frascos
menos concentrados [1].

Objetivo:
Contagem do número total de bactérias e fungos em uma amostra de solo [2].

Materiais:
- Amostra do solo;
- 4 placas de Petri;
- Pipetas de 10mL e 5mL;
- Espátula;
- 4 frascos com 90mL de água;
- Bico de Bunsen;
- Agar PCA e Sabouraud;
- Estufa [2].

Método:
 Método 1 - Presença de fungos no ar
Escolher um local da faculdade, levar a placa contendo o meio fechado até o
local escolhido (no caso, em cima de um caixa bancário), abrir e deixá-la no
local por 15 minutos. Fechá-la e voltar ao laboratório.
Com a experiência finalizada as placas serão incubadas em estufa
bacteriológica por 24 – 48 horas para que o resultado seja observado [2].

 Método 2 – Presença de microrganismos no solo

Pese cuidadosamente 10g e dilua em água, agitando o frasco para melhor
homogeneidade e repouse o frasco por alguns segundos para que os sólidos
decantem. Transfira, com a pipeta de 10mL, uma alíquota de 10mL (se
possível, do líquido do meio, para evitar qualquer resíduo) para o frasco
contendo 90mL de água. Assim, a concentração será de 10 -1. O mesmo
procedimento será refeito três vezes, sempre trocando de pipeta. Assim, será
obtido três frascos de concentração 10-2, 10-3 e 10-4.
Transfira, com a pipeta de 5mL, apenas 1mL do frasco de 10 -2 e 10-4 para
duas placa de Petri distintas. Com o frasco de concentração 10 -3, transfira
também 1mL, mas para duas placas de Petri distintas. Ao todo, serão: uma
placa de Petri de concentração 10 -2, uma placa de concentração 10 -4 e duas de
concentração 10-3.
Adicione 10mL de Sabouraud na placa de concentração 10-2 e em uma de
concentração 10-3. Faça, cuidadosamente, movimentos em forma de oito para
melhor diluição. Espere solidificar para levar até a estufa. O mesmo será feito
com o PCA, porém nas placas de concentração 10-4 e 10-3 [2].
Resultados:
No método 1, houve crescimento de fungos na placa de Petri. Seguem as
fotos:
No método 2, cresceram colônias de bactérias nas placas de Petri (meio PCA)
de concentração 10-3 e 10-4. Mas em pouca quantidade, comparado ao número
de fungo das placas de 10-2 e 10-3. Outra observação é que nas placas de
maior concentração houve maior número de microrganismos.

Considerações finais:
No método 1, o ambiente escolhido foi em cima do caixa bancário. Não era de
se surpreender o resultado obtido, uma vez que, no ambiente escolhido, Há
grande circulação de ar e de pessoas, e carregados com eles, esporos de
fungos e bactérias.

Bibliografia:

[1] TORTORA, GERARD J.; FUNKE, BERDELL R. ; CASE, CHRISTINE L.

tradução atual por Roberta Marchiori Martins – Microbiologia - 8.ed. - Porto
Alegre – Artmed, 2005

[2] Roteiro de aula prática ST107 – BIOLOGIA APLICADA I