Universidade Tecnolgica Federal do Paran

Campus Campo Mouro

Coordenao de Alimentos
Disciplina de Microbiologia
Profa. Mrcia R. F. G. Perdoncini

2. Treinar tcnicas fixadas e coradas de

preparao de bactrias para exame
microscpico;
3. Treinar
manuseio
adequado
do
microscpio ptico composto;
4. Diferenciar bactrias de acordo com a
morfologia (forma e arranjo) de suas
clulas.

AULA PRTICA n

MATERIAIS E MTODOS

Preparaes microscpicas a fresco, fixadas

simples e colorao de Gram.

Corantes utilizados: cristal violeta e azul de

metileno. Soluo salina estril.

Colorao simples

Tcnica de colorao a fresco

- Flambar rapidamente uma lmina de
microscopia limpa, nos dois lados, cortando,
lentamente, a chama do bico de Bunsen;
- Flambar a ala de repicagem ao rubro e, a
seguir, deix-la esfriar, conservando-a, todavia,
perto da chama;
- Tomar o tubo com a suspenso de leveduras,
agit-lo levemente com a mo esquerda e com o
dedo mnimo e anular da mo direita, remover o
tampo de algodo da boca do tubo;
- Flambar a boca do tubo de cultura;
- Introduzir a ala de repicagem, presa entre o
polegar e o indicador da mo direita, no interior
do tubo, at tocar a suspenso;
- Flambar novamente a boca do tubo de cultura;
- Tomar uma lmina (anteriormente preparada)
com a mo e depositar em seu centro uma
gotcula da suspenso;
- Pingar uma gota de azul de metileno a pequena
distncia da suspenso e, sobre a lmina,
colocar uma lamnula;
- Observar ao microscpio na objetiva de 40x.

INTRODUO
Preparaes
microscpicas
compreendem
tcnicas
de
tratamento
de
espcimes
microbianos em lminas a serem examinadas ao
microscpio. Clulas microbianas podem ser
examinadas vivas, a fresco, sobre lminas, com
auxlio ou no de corantes, vitais, ou podem ser
fixadas pelo calor sobre a lmina e coradas com
corantes qumicos especficos.
A visualizao microscpica a fresco difcil
devido ao tamanho reduzido e ao ndice de
refrao dos microrganismos que se aproximam
ao da gua, tornando-os praticamente incolores,
quando suspensos em um meio aquoso.
Apesar
da
dificuldade
de
visualizao,
preparaes microscpicas a fresco so teis
para observar a viabilidade e algumas atividades
celulares, como motilidade e fisso binria, e
para observar o tamanho e a forma natural das
clulas microbianas.
Para diferenciar os microrganismos em grupos
especficos com o propsito de diagnosticar e de
estudar suas propriedades, utilizam-se corantes e
tcnicas
de
colorao
que
constituem
ferramentas
essenciais
nas
preparaes
microscpicas. Um corante , geralmente, um
sal, no qual um dos seus ons um cromforo.
Se o cromforo positivo, o corante bsico,
como o caso do azul de metileno, do cristal
violeta ou da fucsina. Se o cromforo negativo,
o corante cido, como o cido pcrico.
Corantes bsicos, carregados positivamente, so
ideais para corar bactrias, porque os cidos
nuclicos e alguns componentes da parede
celular apresentam carga negativa e so atrados
por cromforos catinicos.
Nas tcnicas de colorao simples, clulas
microbianas fixadas sobre uma lmina so
coradas com um nico corante.
OBJETIVOS
1. Preparar
lminas
a
fresco
para
observao de algumas amostras de
leveduras;

Tcnica de colorao simples com material

slido
- Colocar no centro da lmina uma pequena gota
de soluo fisiolgica com a ala de repicagem;
- Transferir uma pequena alquota da cultura
slida para a lmina, colocar sobre ela uma gota
de soluo fisiolgica e espalhar o material com
movimentos circulares (esfregao);
- Em seguida, cortar, lentamente, a lmina na
chama do bico de Bunsen, a fim de que o
material fique bem aderente lmina (fixao);
- Cobrir a lmina com o esfregao fixado com o
cristal violeta por 1 minuto e, em seguida, lavar
com gua;
- Observar ao microscpio na objetiva de 100x.
OBS. Quando a cultura estiver em meio lquido,
no utilizar soluo fisiolgica para o esfregao.
Para faz-lo, utiliza-se a alquota da cultura
diretamente na lmina que deve ser cortada
sobre o bico de Bunsen at secar, repetindo-se a
operao cinco vezes.

EXERCCIOS DE FIXAO
1. Descreva detalhadamente o processo de
esfregao, a partir de uma cultura bacteriana
slida.
2. Qual a diferena entre o esfregao de cultura
slida e o de cultura lquida?
3. Como se faz a fixao de um esfregao
bacteriano? Qual a finalidade da fixao?
4. Esquematize as preparaes a fresco e as
preparaes coradas simples observadas.

Colorao a fresco

Colorao simples

Tcnicas de colorao de Gram

INTRODUO
Corantes so substncias que possuem a
propriedade de transmitir sua cor a outros corpos.
As coloraes em microbiologia so de vital
importncia, pois funcionam como opo na
identificao presuntiva dos diversos agentes
patognicos.
Preparaes coradas so comumente usadas no
exame microscpio de bactrias e de fungos em
microbiologia, em que esfregaos de material so
submetidos ao de um ou mais corantes aps
a fixao.
A maioria das bactrias corada pelo mtodo de
Gram, que permite observar sua morfologia e
fornece
informaes
a
respeito
do
comportamento do material celular diante de
corantes bsicos (corantes de Gram). Essa
tcnica separa as bactrias em dois grupos:
Gram-positivas e Gram-negativas.
A colorao chamada de Gram devido ao Dr.
Christian Gram, que descreveu pela primeira vez
esse processo de colorao em 1884, ao fazer
uma referncia composio da parede celular.
As bactrias Gram-positivas possuem uma
espessa camada de peptidioglicano e de cido
teicico; enquanto as Gram-negativas possuem
uma fina camada de peptidioglicano sobre a qual

se encontra uma camada de lipoprotenas, de

fosfolipdeos,
de
protenas
e
de
lipopolissacardios.
A colorao de Gram envolve a aplicao de
quatro reagentes: cristal violeta (CV) e lugol (iodo
metlico e iodeto de potssio) (I), que formam um
complexo insolvel (CV-I); lcool-acetona, que
funciona como solvente de lipdios e desidratante
de protenas, e fucsina ou safranina.
O tratamento com lcool-acetona extrai os
lipdios,
resultando
no
aumento
da
permeabilidade da parede celular das bactrias
Gram-negativas. Assim, o complexo cristal
violeta-iodo (CV-I) pode ser retirado, e as
bactrias Gram-negativas so descoradas. A
parede celular das bactrias Gram-positivas, em
virtude de sua composio, torna-se desidratada
durante o tratamento com lcool. Alm disso, a
permeabilidade reduzida, e o complexo CV-I
no pode ser extrado. Finalmente, utiliza-se
fucsina ou safranina que funciona como corante
bsico de contraste (contracorante). O tratamento
com fucsina ou safranina no altera a cor roxa
das Gram-positivas, ao passo que as Gramnegativas, descoradas pelo lcool, tornam-se
avermelhadas.
OBJETIVOS
1. Aprender a tcnica de colorao de Gram;
2. Aprender os fundamentos da colorao de
Gram;
3. Comparar a estrutura da parede celular
das bactrias Gram-positivas e Gramnegativas.

MATERIAIS E MTODOS

A. Materiais
Cultura
de
bactrias
Gram-positivas
(Streptococcus, Staphylococcus, Bacillus);
Cultura
de
bactrias
Gram-negativas
(Escherichia coli, Pseudomonas, Salmonella);
- Tubos com salina estril.
- Cristal violeta (corante);
- Lugol (mordente);
- lcool-acetona (descorante);
- Fucsina ou safranina (corante).
B. Mtodo
- Fazer um esfregao bem homogneo, fixar pelo
calor e esperar esfriar (conforme roteiro de aula
prtica parte 1);
- Cobrir com cristal violeta, e deixar agir por 1
minuto;
- Lavar rapidamente com gua;
- Cobrir com soluo de lugol durante 2 minutos;
- Lavar em gua corrente;
- Lavar a lmina com lcool-acetona at que no
se desprenda mais corante da preparao
(aproximadamente 15 segundos);
- Lavar rapidamente a lmina com gua;
- Corar com fucsina durante 30 segundos;
- Lavar a lmina com gua e, em seguida, deixar
secar ao ar ou entre papel de filtro;
- Observar ao microscpio, focalizando com a
objetiva de imerso (100x).

Figura 1:

Figura 2

EXERCCIOS DE FIXAO
(continuao da parte 1)
5. Descreva a tcnica de colorao de Gram.
6. Explique por que as bactrias Gram-negativas
apresentam colorao diferente das bactrias
Gram-positivas.
7. Preencha o quadro a seguir:
Microrganismo

Forma Arranjo Cor Gram

Referncias
OKURA, M. H. & RENDE, J. C. Microbiologiaroteiros de aulas prticas. So Paulo: Tecmedd,
2008.
NOTA:
Qualquer processo de colorao segue basicamente trs
passos:
1.

2.

8. Qual tipo de bactria (gram negativa ou gram

positiva) est representada na figura 1 e 2?

3.

Preparo do esfregao: O esfregao a

colocao dos microrganismos na lmina de
vidro para serem submetidos colorao.
Deve ser oval e delgado.
Fixao do esfregao: serve para fixar os
microrganismos do esfregao na lmina de vidro,
para que posteriormente no sejam removidos
durante o processo de colorao.
Este procedimento faz com que o protoplasma
das clulas dos microrganismos se coagule,
aderindo- os desta forma na lmina.
A forma mais utilizada de fixao de esfregao,
pass-lo pela chama umas trs vezes. H tambm
outros processos utilizando produtos qumicos.
Colorao
propriamente
dita:
so
os
procedimentos de cada tcnica de colorao.