CENTRO UNIVERSITÁRIO DE PATOS DE MINAS

DISCIPLINA: PRÁTICA FUNCIONAIS – MÓDULO 1

PROFa.:NATÁLIA TAFURI, PAULA MARYNELLA E ROSIANE GOMES

COLORAÇÃO DE GRAM

Colorações simples tornam possível a visualização das bactérias ao microscópio, mas isso
não faz distinção entre organismos de morfologia similar. Para tanto, é necessário realizar uma
coloração diferencial.
Existem diversos métodos de coloração utilizados para a análise de bactérias. Entre estes, o
mais utilizado é a coloração desenvolvida por Christian Gram em 1884. Usando duas sequências
de coloração, com diferentes corantes, este método permite a divisão das bactérias em 2 grandes
grupos.
O primeiro grupo, que retém a cor do primeiro corante (o cristal violeta), é denominado Gram
positivo. O segundo grupo perde a cor do primeiro corante e retém a cor do segundo corante
utilizado (fucsina) e é denominado Gram negativo. Uma solução de iodo (lugol) é utilizada como
mordente (um composto químico que fixa um corante ou outra substância ao se combinar com o
mesmo e formar um composto insolúvel) para a primeira etapa da coloração. Há também um agente
descorante entre a utilização de um e outro corantes. Pode-se utilizar diferentes descorantes, de
acordo com a velocidade de descoloração desejada. O álcool etílico a 95% é um agente descorante
mais devagar, enquanto a acetona agiliza essa etapa. Geralmente utiliza-se uma mistura de álcool
etílico e acetona (95:5), obtendo uma velocidade de descoloração intermediária. A maioria dos
cocos é Gram positiva com exceção dos gêneros Neisseria e Veillonella que são os únicos Gram
negativos.
Assim também acontece com os bacilos, sendo a maioria Gram negativos. Entre os bacilos
Gram positivos incluem-se aqueles pertencentes aos gêneros Corynebacterium, Listeria, Bacillus,
Lactobacillus e Clostridium. Os víbrios são Gram- negativos.
A investigação das características morfológicas e de coloração (morfo-tintoriais) das bactérias
é etapa inicial de grande importância no isolamento e identificação de bactérias de material clínico
bem como de alimentos. No entanto, a identificação completa de uma bactéria sempre necessitará
de dados fisiológicos ou genéticos da mesma.

Fundamentação teórica

A coloração de Gram baseia-se na diferença das paredes celulares das diversas bactérias e
como estas serão coradas de forma distinta.
As bactérias denominadas Gram negativas possuem uma fina camada de glicoproteína
recoberta por uma espessa camada formada principalmente por lipoproteínas e substâncias
lipídicas. Já as consideradas Gram positivas possuem uma única e espessa camada de
glicoproteína.
Antes de iniciar a coloração, é necessário fazer um esfregaço, ou seja, pegar uma colônia
previamente isolada ou uma alçada de uma cultura pura e transferir para uma lâmina limpa. Se for
utilizada uma colônia, deve-se adicionar uma gota/alçada de solução salina a 0,9%,
homogeneizando-a. É importante que o esfregaço seja bem preparado, para que, ao final da
coloração, seja possível a visualização das bactérias. Também é importante não esquecer de fixar
o esfregaço na chama do Bico de Bunsen, evitando que a massa de células a ser analisada se
perca durante as etapas da coloração.
Na primeira etapa da coloração, o corante violeta é adicionado sobre o esfregaço. O corante,
então, penetra na parede da bactéria, independente se esta é Gram positiva ou Gram negativa.
Ao adicionar o lugol, este se combina com o corante Cristal Violeta, formando um grande
complexo, o Cristal Violeta-Iodo (CV-I), fixando o corante na parede a bactéria. O álcool tem papel
fundamental neste método. Ao ser adicionado sobre o esfregaço corado com o Cristal violeta vai
diferenciar as bactérias:
Gram positivas: com sua parede rica em complexas cadeias de peptidoglicano serão
desidratadas, e os poros na parede serão reduzidos, impedindo a saída do complexo CV-I e
tornando a parede permanentemente corada de roxo (a cor do complexo CV-I).
Gram negativas: possuem uma fina camada de peptidoglicano, mas acima desta camada
encontra-se uma outra, de caráter lipídico (rica em LPS, lipoproteínas e outros componentes). Essa
camada lipídica, em contato com o álcool, dissolve-se, deixando a camada de peptidoglicano
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desprotegida e permitindo a saída do complexo CV-I, tornando a célula descorada neste momento.
É importante lembrar de lavar a lâmina após a etapa de descoloração, pois se restar algum
resíduo de álcool, a próxima etapa não será realizada adequadamente, e os resultados poderão ser
alterados.
O esfregaço então é tratado com fucsina, que não terá efeito algum sobre as células Gram
positivas, que estão com os poros de sua parede reduzidos; mas penetrará na parede das células
Gram negativas, corando-as de vermelho. Esta coloração é utilizada para a maioria das bactérias,
mas há algumas que não coram.

Metodologia

Preparo e fixação do esfregaço

Etapas Observações
Transferir uma alçada da cultura ou uma colônia Ao fazer o esfregaço a partir de diferentes culturas
da placa para uma lâmina de microscópio limpa. deve-se observar alguns detalhes:

- - de placa: deve-se coletar apenas 1 colônia,

espalhando-a pela lâmina, isso evitará a observação
de colônias diferentes na lâmina e que seja coletado
um inóculo muito carregado, o que dificultará a
visualização das células coradas.
-
- - de caldo: deve-se coletar apenas uma alçada e
espalhá-la na lâmina, isso evita que seja coletado um
inóculo muito carregado.
Com o auxílio da alça, espalhar a cultura. Se
tiver sido colhida colônia da placa, adicionar
salina estéril para facilitar o espalhamento.
Para o inóculo coletado de caldo não é necessário
adicionar solução salina. Mas para colônia coletada de
placa é necessário fazer a diluição na lâmina, evitando
que o esfregaço fique muito concentrado o que
dificulta a visualização das células coradas ao
microscópio.

Passar a lâmina com o esfregaço sobre a chama É importante fixar o esfregaço para que este não se
do Bico de Bunsen, até que este esteja perca durante as etapas de lavagem entre a utilização
completamente seco. de um e outro corante.

Coloração do esfregaço

Etapas da Coloração O que está acontecendo na parede da bactéria?

Cobrir o esfregaço com solução de Cristal Violeta O Cristal Violeta penetra a parede de ambos os tipos
por cerca de 1 minuto. de células (Gram + e Gram -)

A lavagem com água é importante após cada etapa

para que uma substância utilizada não interfira na
A seguir, lavar em água corrente com a pisseta. ação da próxima.
Nesse caso, a lavagem serve para retirar o excesso
de corante.
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O Lugol é uma solução de Iodo e funciona como

Cobrir o esfregaço com solução de Lugol mordente neta etapa da coloração, ou seja, ele fixa o
fraco por cerca de 1 minuto. corante Cristal Violeta na parede da célula, pois forma
um complexo grande: o CV-I

A fucsina age de diferentes formas nas diferentes

células: e nas Gram +, os poros estão reduzidos,
Novamente lavar com água, e então lavar com impedindo que a fucsina penetre na parede celular, não
álcool absoluto até que não saia mais corante da alterando a cor roxa:
lâmina (10 – 15 segundos). Adicionar o corante
fuccina.

e nas Gram -, os poros da camada de

peptidoglicano estão abertos, permitindo que a
fucsina penetre na célula, corando-as de vermelho:

Lavar com água e secar suavemente com Após secar suavemente a lâmina, observar ao
papel. microscópio na objetiva de imersão (100x), com
óleo de cedro/mineral e identificar a célula
corada.

Para decorar!!!
Vi Lulu Ali A Fumar
(Cristal Violeta) (Lugol) (Álcool) (Água) (Fucsina)

Responda:
1. Em que se baseia o método da coloração de Gram?
2. Por que o álcool é considerado como agente diferenciador da coloração de Gram?
3. Qual é o papel do mordente (lugol)?
4. Descreva passo a passo da coloração de Gram
5. Diferencie as bactérias Gram + de Gram-