Relatório da Atividade Laboratorial- Observação

de bactérias usando a coloração de Gram

Trabalho elaborado por:

 Tiago Freitas, 11º2, Nº15

Esta atividade laboratorial teve como principais objetivos:

 Observar bactérias;
 Poder distinguir o tipo de bactérias consoante o Gram que apresentam;
 Identificar a morfologia/forma das bactérias.

Introdução

As bactérias são seres vivos que pertencem ao Reino Monera, e são organismos que
existem em todos o tipo de habitats, designando-se assim de organismos
cosmopolitas. São seres com uma dimensão muito reduzida (1 a 5 micrómetros, em
média), e apresentam uma forma muito distinta.
As morfologias que são mais comuns nas bactérias são os cocos (esféricos), os bacilos
(em forma de bastonete), os espirilos ou espiroquetas (espiralados) e os vibriões
(forma de virgula). As bactérias podem viver de forma isolada ou em grupos, sendo
que podem formar cadeias, cachos entre muitas outras formas.
Devido as dimensões microscópicas deste conjunto de seres vivos e para a sua melhor
visualização e distinção utiliza-se o método da coloração de Gram. Este tipo de
coloração é designado diferencial pois permite distinguir dois grandes grupos de
bactérias, as Gram-positivas (Gram +) que apresentam coloração azul/violeta, e as
Gram-negativas (Gram -) que apresentam coloração rosa/vermelho.
Para a coloração de Gram é necessário fazer um esfregaço bacteriano, sendo que este
é posteriormente fixado e imerso, numa série ordenada de soluções. As soluções são,
o corante básico, o mordente, o agente descorante e por fim o agente cristalizante.
As bactérias Gram - e as Gram + possuem uma composição da parede celular distintas,
as Gram + possuem uma parede celular mais grossa e com uma menor concentração
de lípidos que as Gram-.

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No procedimento da coloração de Gram, o corante básico usado inicialmente irá corar
ambos os tipos de bactérias. Contudo o álcool irá ter um efeito diferente nas Gram- e
nas Gram +.
Nas Gram- o álcool dissolve os lípidos da membrana, havendo a formação de poros
que iram facilitar a saída do corante e conduzir à perda da coloração violeta.
Posteriormente estas bactérias adquirem a cor do corante de contraste. Por outro
lado, O álcool nas Gram + dissolve os lípidos da parede em baixa concentração,
formando pequenos poros que posteriormente se fecham devido ao efeito
desidratante do álcool. Estas permanecem com a coloração violeta.
Após a coloração de Gram o esfregaço bacteriano é observado ao microscópio ótico,
onde podemos classificar a bactéria quanto ao grupo que pertence (Gram + ou Gram-),
e muitas vezes até identificar ou dar uma boa indicação do tipo de bactéria que
estamos a observar.

Material Utilizado:

 Microscópio;  Solução violeta de cristal;

 Lâminas;  Solução lugol;
 Ansa de inoculação;  Álcool a 95% ;
 Tina de coloração;  Solução fucsina de ziehl;
 Lamparina;  Óleo de imersão;
 Fósforos;  Xilol;
 Papel de Limpeza;  Iogurte natural.

Procedimento experimental:

 Preparação e fixação do esfregaço bacteriano:

1. Colocar uma gota de água na lâmina;

2. Com o auxílio de uma ansa de inoculação, homogeneizar o iogurte e retirar
uma gota. Colocar na lâmina, sobre a gota de água, espalhar, para formar o
esfregaço;
3. Secar o esfregaço ao ar durante uns minutos;
4. Fixar o esfregaço, inundando a lâmina com álcool durante 5 minutos;
5. Secar a preparação ao ar, antes de efetuar a coloração.

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  Coloração de Gram:

1. Colocar a lâmina na tina de coloração e inundar o esfregaço com a solução

violeta-de-cristal, e deixar atuar durante 1 minuto;
2. Escorrer o corante e remover do esfregaço, colocando a lâmina paralelamente
ao fio de água da torneira;
3. Lavar com lugol e escorrer o corante;
4. Cobrir o esfregaço bacteriano com a solução lugol, e deixar atuar durante 1
minuto;
5. Escorrer o lugol e descorar com álcool, deixando cair gota a gota sobre a
preparação, e deixar atuar durante 30 segundos;
6. Lavar cuidadosamente o esfregaço bacteriano, como no passo 2;
7. Corar o esfregaço com solução de safranina durante 2 minutos;
8. Lavar cuidadosamente o esfregaço bacteriano, como no passo 2 e 6;
9. Secar a preparação junto a corrente de ar ascendente da chama da lamparina;
10. Observar a preparação ao microscópio, com a objetiva de menor ampliação.
Registe as suas observações;
11. Colocar uma gota de óleo de imersão sobre a preparação e observar com a
objetiva de 100x. Fazer esquema das observações e legendar;
12. Repetir o procedimento com o vinagre.

Discussão dos resultados:

Para poder observar as bactérias presentes no iogurte natural, foi necessário proceder
à coloração de Gram, sendo esta uma coloração que é largamente utilizada desde
1984 para a identificação e classificação morfológica de diversos tipos de bactérias.
Inicialmente teve-se de realizar um esfregaço bacteriano e fixar a amostra na lâmina e
então depois proceder à coloração de Gram. Para visualizar as bactérias isoladas,
utilizou-se o microscópio ótico. Com a objetiva de menor ampliação foi possível
encontrar um campo onde se localizava um número considerável de bactérias para a
análise.
Na objetiva de menor dimensão foi possível ter uma ideia do tipo de bactérias
presentes, contudo não permitia uma avaliação morfológica, com isto teve-se de
passar para a objetiva de 100x e nesta pode-se certificar que as bactérias que estavam
presentes no iogurte eram maioritariamente Gram negativas, como é possível
observar na figura 1 e na figura 2.

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Figura 1- Observação microscópia (objetiva 100x) de Figura 2-Observação microscópia (objetiva 100x) de
bactérias Gram -. bactérias Gram -.

Foi também possível observar bactérias Gram +, como se pode observar nas figuras 3 e
4, sendo que este grupo de bactérias apresenta uma cor violeta/azul.

Figura 3-Observação microscópia (objetiva Figura 4-Observação microscópia (objetiva

100x) de bactérias Gram +. 100x) de bactérias Gram +.

Apesar da grande abundância de bactérias no esfregaço, a analise morfológica destas é

de difícil execução, isto porque aquando da realização do esfregaço bacteriano foi
utilizado um grande volume de iogurte, e muito provavelmente o processo de
espalhamento do produto bacteriano na lâmina inicialmente não foi feito de forma
muito eficaz. Apesar desta situação, pode-se referir que quer as bactérias Gram- quer
as bactérias Gram+ apresentam-se maioritariamente em grupos com um número
variado de células.
A nível morfológico não foi possível fazer uma boa classificação dado à má execução
do esfregaço bacteriano como explicado acima.

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Contudo seria de espectável observar que existe uma relação entre a forma das
bactérias e o tipo de Gram que estas apresentam, visto que as Gram - apresentam
maioritariamente forma de bacilos enquanto as Gram + apresentam a forma de cocos.
Isto pode ser verificado na figura 5, sendo que esta observação não foi desta
experiência laboratorial, mas sim retirada do livro.

Figura 5- Imagem microscopia de bactérias Gram + em forma de

cocos, e de bactérias Gram - em forma de bacilos. (Imagem retirada
do livro).

Conclusão:

Com a realização desta atividade experimental, foi possível ter noção da grande
importância do método de coloração de Gram para a identificação e classificação das
bactérias. Para alem disto, verificou-se que a grande diferença entre as bactérias Gram
negativas e das Gram positivas encontra-se na espessura da parede celular e na
composição lipídica, sendo que as Gram- possuem uma parede celular mais fina e uma
quantidade de lípidos maior que as Gram +. Sendo estas características fundamentais
para poder justificar a cor que adquirem durante o processo de coloração. Uma vez
que nas Gram- o álcool dissolve os lípidos da membrana, havendo a formação de poros
que iram facilitar a saída do corante e conduzir à perda da coloração violeta.
Posteriormente estas bactérias adquirem a cor do corante de contraste. Por outro
lado, O álcool nas Gram + dissolve os lípidos da parede em baixa concentração,
formando pequenos poros que posteriormente se fecham devido ao efeito
desidratante do álcool. Estas permanecem com a coloração violeta.
Nesta atividade laboratorial, infelizmente não foi possível classificar morfologicamente
as bactérias devido aquando da realização do esfregaço bacteriano foi utilizado um
grande volume de iogurte, e muito provavelmente o processo de espalhamento do
produto bacteriano na lâmina inicialmente não foi feito de forma muito eficaz.
Contudo permitiu ter uma noção sólida das diferenças entre estes dois grandes grupos
de bactérias e a grande importância da coloração de Gram.