Isolamento de Microrganismos

de nichos bucais e
Coloração de Gram

Profa. Ms. Rosemary Pereira de Araújo

Prof. Ms. Eduardo A. Del Buono
 Isolamento de
Microrganismos
Amostras de saliva, placa dental supra gengival e sub
gengival e esfregaços das diversas áreas das mucosas
são analisados por meio de diversas técnicas de
cultivo microbiano e de técnicas moleculares.

As amostras bucais são cultivadas em diferentes

meios de cultura bacteriana, sob diferentes
condições de atmosfera e temperatura
(normalmente cultivadas a 36-37oC).

Fonte: Aspectos microbiológicos da placa dental - Área de Microbiologia e Imunologia FOP-UNICAMP

 Após o crescimento, as colônias
bacterianas com diferentes características
são isoladas e analisadas
microscopicamente e bioquimicamente.

As características morfológicas e
bioquímicas são então utilizadas para
classificação dos microrganismos em
gêneros, espécies e subespécies

Fonte: Aspectos microbiológicos da placa dental - Área de Microbiologia e Imunologia FOP-UNICAMP

 A proporção em que as espécies são
identificadas também é determinada, o que
permite estimar, por exemplo, que a maior
proporção de microrganismos bucais são
espécies de estreptococos.

Estima-se que cerca de 50% das

espécies bacterianas bucais foi
cultivada e identificada!!

Fonte: Aspectos microbiológicos da placa dental - Área de Microbiologia e Imunologia FOP-UNICAMP

 As bactérias podem ser classificadas pela cor que
adquirem após aplicação de um processo químico
denominado coloração de Gram.

As bactérias Gram-positivas adquirem coloração

azul quando essa coloração é aplicada a elas. As
Gram-negativas adquirem coloração vermelha.

As bactérias Gram-positivas e Gram-negativas têm

a coloração diferente porque suas paredes
celulares são diferentes. Causam tipos diferentes
de infecções e tipos diferentes de antibióticos são
eficazes contra elas.
 COLORAÇÃO DE GRAM
 Trata-se de um passo muito importante na
caracterização e classificação inicial das bactérias.
 Esse método de coloração permite que as bactérias
sejam visualizadas no microscópio óptico, uma vez
que sem a coloração é impossível observá-las ou
identificar sua estrutura.
 Técnica de coloração
de Gram
• Foi descoberta pelo físico dinamarquês Hans Christian
Gram em 1884. Obteve, com a coloração realizada, uma
melhor visualização das bactérias em amostras de
material infectado.

• Verificou, no entanto, que nem todas as bactérias

coravam com este método o que o levou a sugerir a
possibilidade de ser usado um contrastante.
 Técnica de coloração
de Gram
• Gram morreu em 1935 sem ter reconhecida a importância
ao seu método de coloração.

• Atualmente, esta técnica é fundamental para a taxonomia

e identificação das bactérias, sendo utilizada como
técnica de rotina em laboratórios de bacteriologia.
 A técnica de coloração de Gram
consiste em expor as células
bacterianas à seguinte sequência:

Corante primário – violeta de cristal: cora o citoplasma de

púrpura, independentemente do tipo de célula.

Mordente (intensifica a cor por aumentar a afinidade do corante com o

microrganismo) – soluto de lugol: aumenta a afinidade entre o violeta
de cristal e a célula e forma com o corante um complexo insolúvel
dentro da célula.

Agente descolorante – álcool, acetona ou ambos: solvente

lipídico.

Contrastante – safranina ou fucsina básica: cora o citoplasma de

vermelho.
As bactérias Gram-
negativas não retêm o
complexo violeta-iodo
quando descoradas com
álcool-acetona
 O que se verifica, quando se observam as diferentes
bactérias sujeitas a esta coloração ao microscópio, é que
estas têm um comportamento diferente face à
coloração de Gram, o que permite classificá-las em:

Bactérias GRAM-POSITIVAS Bactérias GRAM-NEGATIVAS

(apresentam cor púrpura) (apresentam cor vermelha)
 GRAM POSITIVA
As bactérias Gram-positivas apresentam uma parede espessa,
homogênea, geralmente não estratificada e
predominantemente constituída por peptideoglicano.

Deste modo, o precipitado insolúvel que se forma por ação do

mordente, fica retido no interior da célula pela camada espessa
de peptideoglicano, logo, estas células não são descoradas
permanecendo com a coloração conferida pelo corante primário
(púrpura).
 Bactérias Gram-positivas

Parede Celular

-Parede composta de até

90% peptideoglicano
- Pode chegar a 50% do peso
da bactéria
- Contém Ácidos teicóicos e
Ácidos Lipoteicóicos
 BACTÉRIAS GRAM-POSITIVAS

Parede Celular
 GRAM NEGATIVA
As bactérias Gram-negativas apresentam uma parede estratificada
constituída por uma membrana externa e por uma camada mais interna
que contém peptideoglicano e que é mais fina que a das Gram-positivo.

Deste modo, o precipitado insolúvel, que se forma por ação do

mordente, é removido (camada de peptideoglicano é mais fina que a das
Gram-positivo e a membrana externa é parcial ou totalmente
solubilizada pelo agente descolorante), pelo que as células ficam
descoloradas, corando de vermelho pelo contrastante.
 GRAM NEGATIVO

Durante o passo de diferenciação pelo álcool, parte dos

lipídios são dissolvidas pelo álcool, formando-se poros na
parede por onde o corante primário (violeta de cristal)
sai das células. Estas células ficam transparentes após o
passo de diferenciação pelo álcool, sendo
posteriormente coradas com o corante secundário
(safranina).
 BACTÉRIAS GRAM-NEGATIVAS

Parede Celular
Composta de:
-Uma ou poucas camadas de
peptideoglicano
- Uma membrana externa que
contem LPS (lipopolissacarídeo)
Gram Positivas Gram Negativas
Iogurte
Cultura mista das bactérias Lactobacillus bulgaricus e
Streptococcus thermophilus).

Gram positivas.
 A metodologia irá ajudar na identificação
de uma infecção bacteriana,
determinando qual é o tipo de bactéria.

A diferenciação das bactérias Gram-negativas e Gram-

positivas permite determinar um tratamento eficaz ao
paciente, aplicando a terapia adequada em cada caso.

Mesmo que nem todas as bactérias possam

ser diferenciadas por meio da coloração de
Gram, a metodologia tem grande aplicação no
diagnóstico clínico e pesquisa biológica.
Bactérias Gram-negativas de interesse
em saúde e suas patologias
Muitas bactérias gram-negativas causam patologias nos
seres humanos e costumam ser resistentes a
determinados antibióticos.

A seguir, algumas espécies de bactérias gram-negativas

patogênicas e doenças causadas pelas mesmas:
•Treponema pallidum – sífilis;
•Vibrio cholerae – cólera (grande importância histórica);
•Chlamydia trachomatis – clamidíase;
•Neisseria meningitidis – meningite bacteriana;
•Neisseria gonorrhoeae – gonorreia;
•Yersinia pestis – peste bubônica, (grande importância
histórica);
•Bordetella pertussis – coqueluche;
•Salmonella – febre tifoide;
•Escherichia coli – infecções intestinais e urinárias.
Gram+ e Gram-
na Cavidade Oral

Fonte: Aspectos microbiológicos da placa dental - Área de Microbiologia e Imunologia FOP-UNICAMP

Fonte: Aspectos microbiológicos da placa dental - Área de Microbiologia e Imunologia FOP-UNICAMP
Fonte: Aspectos microbiológicos da placa dental - Área de Microbiologia e Imunologia FOP-UNICAMP
Fonte: Aspectos microbiológicos da placa dental - Área de Microbiologia e Imunologia FOP-UNICAMP
São espiroquetas, o que se entende
por bactérias Gram-negativas,
móveis, espiraladas.

Na cavidade bucal, algumas espécies de

Treponema são isolados de placas dentais
subgengivais associadas à doença periodontal.

Treponema denticola
Fonte: Aspectos microbiológicos da placa dental - Área de Microbiologia e Imunologia FOP-UNICAMP
Obrigado
pela Atenção!