UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA E COMPUTAÇÃO

ENGENHARIA QUÍMICA
CET996 - Engenharia Bioquímica (T03) - 2023.1
Profª. Drª. Elizama Aguiar De Oliveira

COLORAÇÃO DE GRAM

Denise Santos da Encarnação (201910956)

Gabriel Henrique Silva Cardoso (201910958)

Ilhéus
14 de junho de 2023
Sumário
1 Introdução 3

2 Objetivos 7

3 Metodologia 7
3.1 Materiais, Equipamentos e Utensílios . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
3.2 Procedimento Experimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

4 Resultados e Discussão 13

5 Conclusão 15

1
 Resumo

No dia 29 de maio de 2023, foi realizado um experimento para a disciplina de Engenharia

Bioquímica com o objetivo de realizar a coloração de Gram. A técnica de coloração de Gram
foi aplicada para identificar e classificar bactérias como gram-positivas ou gram-negativas. O
experimento envolveu a aplicação da coloração em amostras de diferentes tipos. As etapas
do processo incluíram fixação das amostras, aplicação de corantes e observação microscópica.
Através dessa análise, as bactérias presentes em cada amostra puderam ser corretamente classifi-
cadas. O experimento contribuiu para o conhecimento e compreensão da coloração de Gram
na identificação bacteriana, ampliando a experiência prática e teórica dos alunos no campo da
Engenharia Bioquímica.

2
1 Introdução

As bactérias são microrganismos procariontes e unicelulares que exibem uma ampla

variedade de formas, com dimensões da ordem de micrômetros (µm). Elas são encontradas
em todos os tipos de ambientes. As células bacterianas podem ter formas básicas como cocos,
bacilos, espirilos, vibrios e filamentosas. O tamanho médio das células bacterianas varia de 0,2
a 2 µm de diâmetro e de 1 a 10 µm de comprimento, com variações dependendo da espécie
bacteriana e das condições de crescimento.

Figura 1: Solução de Diferentes formas de células bacterianas.

Fonte: http://educacao.globo.com/biologia/assunto/microbiologia/bacterias.html

Nessa perspectiva, uma forma de classificar as bactérias é por meio de técnicas de

coloração que possibilitam a identificação de características morfológicas e celulares presentes
em uma amostra, corantes que proporcionam cores distintas a diferentes tipos de células são
conhecidos como corantes diferenciais. Um método de coloração diferencial amplamente
utilizado na microbiologia é a coloração de Gram (Figura 2). Com base em sua reação à
coloração de Gram, as bactérias podem ser divididas em dois grupos principais: gram-positivas e
gram-negativas (MADIGAN, 2016).

3
 Figura 2: Etapas do procedimento de coloração de Gram.

Fonte: MADIGAN, 2016

Após a coloração de Gram, as bactérias gram-positivas adquirem uma coloração roxo-

violeta, enquanto as bactérias gram-negativas adquirem uma coloração cor-de-rosa. Essa di-
ferença de reação à coloração de Gram é devido às variações na estrutura da parede celular
entre as células gram-positivas e gram-negativas, um assunto que será abordado posteriormente
(MADIGAN, 2016).
Figura 3: (a, b) Diagramas esquemáticos de paredes celulares gram-positivas e gram-negativas. A foto da coloração
de Gram no centro mostra células de Staphylococcus aureus (roxa, gram-positiva) e Escherichia coli (cor-de-rosa,
gram-negativa).

Fonte: MADIGAN, 2016

4
 No processo de coloração de Gram, as células são inicialmente coradas com um corante
básico, como o cristal violeta, que confere uma coloração roxa às células. Em seguida, as
células são tratadas com etanol para descolorir as células gram-negativas, mas não as gram-
positivas. Após esse processo, é realizada uma coloração de contraste utilizando um corante de
cor diferente, geralmente a safranina. Essa etapa permite distinguir microscopicamente os dois
tipos de células com base em suas cores diferenciadas (MADIGAN, 2016).
A coloração de Gram é uma ferramenta importante na identificação e classificação
de bactérias, pois fornece informações sobre a estrutura da parede celular. As diferenças na
composição e organização da parede celular entre as bactérias gram-positivas e gram-negativas
estão relacionadas à sua resposta a diferentes antibióticos e a outras propriedades biológicas.
Portanto, a coloração de Gram desempenha um papel crucial na caracterização das bactérias e na
orientação de tratamentos adequados (MADIGAN, 2016).
Nesse sentido, a diferença na coloração de Gram é atribuída às características estruturais
da parede celular das bactérias. A parede celular das bactérias gram-positivas é composta
principalmente por uma única camada espessa de peptidoglicano, conferindo-lhes uma coloração
roxo-violeta após a coloração de Gram. Por outro lado, a parede celular das bactérias gram-
negativas é composta por duas camadas, uma camada fina de peptidoglicano e uma camada
externa lipídica chamada de membrana externa, como pode ser observado na Figura 4. Essa
estrutura mais complexa resulta na retenção do corante de contraste, como a safranina, conferindo
às células gram-negativas uma coloração cor-de-rosa (MADIGAN, 2016).

Figura 4: Micrografias eletrônicas de transmissão (MET) apresentando a parede celular de uma bactéria gram-
positiva e de uma bactéria gram-negativa.

Fonte: MADIGAN, 2016

Além da parede celular, as bactérias gram-negativas também possuem estruturas adici-

onais, como os lipopolissacarídeos presentes na membrana externa, que desempenham papéis
importantes na virulência e na resposta imunológica. Essas diferenças na estrutura da parede
celular e na composição do envelope celular entre as bactérias gram-positivas e gram-negativas
são fundamentais para a sua classificação e caracterização (MADIGAN, 2016).
A classificação de bactérias como gram-positivas ou gram-negativas têm implicações
clínicas significativas. Por exemplo, as bactérias gram-negativas tendem a ser mais resistentes
a certos antibióticos devido à presença da membrana externa, o que dificulta a penetração dos
medicamentos. Além disso, a identificação correta do grupo gram permite direcionar a escolha
de tratamentos adequados e a aplicação de medidas de controle e prevenção de infecções.

5
 É importante ressaltar que a coloração de Gram é apenas uma das várias técnicas de
coloração utilizadas na microbiologia, cada uma com sua própria finalidade e aplicação. No
entanto, a coloração de Gram é uma das mais amplamente utilizadas e valiosas para a classificação
preliminar de bactérias com base em suas características estruturais.

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2 Objetivos

Identificar e classificar bactérias em amostras desconhecidas utilizando o princípio da

coloração de gram.

3 Metodologia

3.1 Materiais, Equipamentos e Utensílios

• Lâminas;

• Conta gotas;

• Alça de platina;

• Bico de Bunsen;

• Água destilada;

• Solução de Lugol;

Figura 5: Solução de Lugol

Fonte: Autores, 2023

• Solução Álcool-acetona (8:2);

7
 Figura 6: Solução Álcool-acetona (8:2)

Fonte: Autores, 2023

• Solução de safranina;

Figura 7: Solução de safranina

Fonte: Autores, 2023

• Culturas de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas (Escherichia coli, Staphylococcus

Epidermidis, Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa);

• Microscópio.

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 Figura 8: MIcroscópio utilizado

Fonte: Autores, 2023

3.2 Procedimento Experimental

1. Foram identificadas lâminas para cada amostra (A, B, C e D).

Figura 9: Lâminas.

Fonte: Autores, 2023

2. Uma gota (ou colônia) de cada amostra das culturas bacterianas foi colocada em sua res-
pectiva lâmina de vidro e misturada gentilmente com o auxílio da alça (um microrganismo
para cada lâmina).

3. Aguardou-se a secagem do esfregaço. O esfregaço foi fixado pelo calor, flambando

rapidamente a lâmina no bico de Bunsen. Esperou-se esfriar a lâmina para evitar a
cristalização do corante.

9
 Figura 10: Secagem.

Fonte: Autores, 2023

Figura 11: Lâminas após secagem.

Fonte: Autores, 2023

4. Foi adicionado o corante Violeta Genciana sobre o esfregaço e deixado em repouso por 1
minuto.

10
 Figura 12: Aplicação do corante Violeta Genciana.

Fonte: Autores, 2023

5. O corante foi escorrido da lâmina. A solução de lugol foi adicionada em quantidade

suficiente para cobrir todo o esfregaço. Aguardou-se por um minuto.

Figura 13: Aplicação do Lugol.

Fonte: Autores, 2023

6. O lugol foi escorrido da lâmina e, em seguida, a lâmina foi lavada com água.

7. O esfregaço foi descorado gota a gota com álcool-acetona por 15 segundos. Não foi
gotejado diretamente sobre o esfregaço.

8. O esfregaço foi corado com fucsina diluída e esperou-se por 1 minuto.

9. A lâmina foi lavada com água corrente e seca suavemente com papel toalha. Não foi
esfregada a lâmina com o papel.

11
 Figura 14: Lavagem.

Fonte: Autores, 2023

10. O material foi visualizado utilizando o microscópio óptico.

11. Foram observadas, anotadas e fotografadas a coloração e morfologia das bactérias.

Figura 15: Amostras observadas no microscópio

Fonte: Autores, 2023

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4 Resultados e Discussão
Tabela 1: Tipos de bactérias

Amostra Descrição observada Tipo de bactéria

A Gram+ Staphylococcus aureus

B Gram- Escherichia coli
C Gram- Pseudomonas aeruginosa
D Gram+ Staphylococcus epidermidis
Fonte: Elaborada pelos autores, 2023.

Amostra A: Inicialmente identificamos a amostra A como Gram positiva, Staphylococcus

aureus e comprovamos através da literatura.
Dito isso, a Staphylococcus aureus é considerada a bactéria mais perigosa entre as
variedades estafilocócicas mais comuns. Essas bactérias, que possuem coloração Gram-positiva
e formato esférico (cocos), são frequentemente responsáveis por infecções na pele, mas também
podem causar pneumonia, infecções das válvulas cardíacas e infecções nos ossos. A transmissão
dessas bactérias ocorre principalmente por contato direto com uma pessoa infectada, pelo uso de
objetos contaminados ou pela inalação de pequenas gotículas infectadas dispersas ao espirrar ou
tossir (Larry, 2022).
S. aureus é uma bactéria Gram-positiva, em forma de cocos, que produz toxinas conhe-
cidas como enterotoxinas. Ela é capaz de crescer em uma ampla faixa de temperatura, resistir
a congelamento e sobreviver em alimentos armazenados a baixas temperaturas. Sua taxa de
crescimento é influenciada pelo pH do ambiente, sendo mais favorável em pH neutro. Além
disso, a bactéria apresenta alta tolerância osmótica, permitindo seu crescimento em ambientes
com concentrações de sal mais elevadas. S. aureus é uma bactéria facultativa anaeróbia, capaz de
crescer tanto na presença quanto na ausência de oxigênio. Embora a bactéria possa ser destruída
por irradiação, as toxinas produzidas por ela são resistentes a esses tratamentos (ASAE, 2023).
Amostra B: Inicialmente identificamos a amostra B como Gram negativa, Escherichia
coli e comprovamos através da literatura.
Escherichia coli é uma bactéria Gram-negativa, caracterizada por uma parede celular
fina que se cora de vermelho na coloração de Gram. Em termos de morfologia celular, ela é
classificada como bacilo, apresentando uma forma de bastonete. Embora seja um componente
normal da microbiota intestinal humana, algumas cepas patogênicas exógenas podem causar
infecções. Essas infecções podem levar a sintomas como diarreia, que ainda é uma causa
significativa de morbidade e mortalidade no Brasil, com milhões de casos e milhares de mortes
relatadas anualmente (Sanar Medicina, 2021).
Amostra C: Inicialmente identificamos a amostra C como Gram negativa, Pseudomonas

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aeruginosa e comprovamos através da literatura.
Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria de grande preocupação devido ao seu papel
como uma das principais causadoras de infecções hospitalares e infecções em pacientes com
fibrose cística. Essa bactéria é classificada como um bacilo gram-negativo que não fermenta
lactose (Sanar Medicina, 2021).
Existem fatores de risco bem estabelecidos para o desenvolvimento de infecções por Pseu-
domonas aeruginosa, incluindo imunossupressão, queimaduras, uso de ventilação mecânica e a
presença de fibrose cística. Essas condições fornecem um ambiente propício para a colonização
e proliferação dessa bactéria (Sanar Medicina, 2021).
A Pseudomonas aeruginosa tem forma de bastonete, que é aeróbia e gram-negativa.
Ela pode ser encontrada em todos os ambientes e tem a capacidade de crescer em uma ampla
variedade de meios de cultura. Uma das características distintivas dessa bactéria é o seu odor
característico de doce de uva. Além disso, a Pseudomonas aeruginosa é positiva para o teste de
oxidase e possui a capacidade de liberar um pigmento verde (Sanar Medicina, 2021).
Amostra D: Inicialmente identificamos a amostra D como Gram positiva, Staphylococcus
epidermidis e comprovamos através da literatura.
O Staphylococcus epidermidis é uma bactéria Gram-positiva e coagulase negativa que faz
parte da nossa microbiota normal. Essa bactéria tem a capacidade de colonizar a pele humana e
as mucosas, especialmente as áreas úmidas do corpo, como as axilas e as narinas. Uma das razões
pelas quais o Staphylococcus epidermidis pode causar infecções é a sua capacidade de formar
biofilmes. Esses biofilmes são estruturas complexas formadas por camadas de bactérias aderidas
a uma superfície, como a de um cateter. Os biofilmes proporcionam proteção às bactérias contra a
ação do sistema imunológico e dificultam a eficácia dos tratamentos antimicrobianos (Analytica,
2023).

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5 Conclusão

Em conclusão, este experimento foi de grande importância para aprimorar os conceitos

práticos relacionados às técnicas microbiológicas. Ao realizar a coloração de Gram em diferentes
tipos de amostra, foi possível desenvolver habilidades fundamentais, como a manipulação correta
de materiais de laboratório, a aplicação adequada dos corantes e a interpretação dos resultados
microscópicos.
Além disso, a realização bem-sucedida da identificação correta de todas as amostras
evidencia a capacidade em conciliar o conhecimento teórico adquirido com a prática laboratorial.
A compreensão dos princípios bioquímicos subjacentes à coloração de Gram, juntamente com
a aplicação correta dos procedimentos, resultou em um desempenho consistente e preciso na
identificação dos microorganismos presentes nas amostras.

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Referências Bibliográficas

MADIGAN, M.T.; MARTINKO, J.M.; BENDER, K. S.; BUCKLEY, D. H.; STAHL, D.A.
Microbiologia de Brock. 14ª ed. Porto Alegre: Artmed, 2016.
ASAE. Staphylococcus aureus. Disponível em: https://www.asae.gov.pt/seguranca-
alimentar/riscos-biologicos/staphylococcus-aureus.aspx#: :text=Caracter%C3%ADsticas%20gerais-
,S.,agente%20respons
%C3%A1vel%20pela%20intoxica%C3%A7%C3%A3o%20alimentar. Acesso em: 10 jun. 2023.
Sanar Medicina. Escherichia coli. 26 de jan. de 2021. Disponível em:
https://www.sanarmed.com/resumo-escherichia-coli-ligas. Acesso em: 8 jun. 2023.
Bush, L.M. Infecções estreptocócicas. MD, FACP, Charles E. Schmidt College of Medicine,
Florida Atlantic University, set. 2022. Disponível em: https://www.msdmanuals.com/pt-
br/casa/infec%C3%A7%C3%B5es/infec%C3%A7%C3%B5es-bacterianas-bact%C3%A9rias-
gram-positivas/infec%C3%A7%C3%B5es-estreptoc%C3%B3cicas. Acesso em: 12 jun.
2023.
Sanar Medicina. Resumo de Pseudomonas aeruginosa: epidemiologia, patogenia, resistência
e tratamento. 17 de mai. de 2021. Disponível em: https://www.sanarmed.com/resumo-de-
pseudomonas-aeruginosa-epidemiologia-patogenia-resistencia-e-tratamento. Acesso em: 9 jun.
2023.
Analytica. Microbiologia: Staphylococcus epidermidis, 2023. Disponível
em https://revistaanalytica.com.br/microbiologia-staphylococcus-epidermidis/#:
:text=O%20Staphylococcus%20epidermidis%20%C%A9%20u Acesso em: 11 jun. 2023.

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