1 METODOLOGIA

1.1 DESENHO EXPERIMENTAL

O estudo consiste em uma pesquisa experimental cujo intuito é avaliar a

microbiota residente e transitória dos manipuladores de ovos de uma sala de
processamento em uma granja no município de Santa Maria de Jetibá – ES. A
pesquisa será realizada em N manipuladores, que terão amostras coletadas
por meio de swab de algodão que serão destinados ao cultivo microbiológico,
que por sua vez, acontecerá no laboratório de microbiologia da Escola Superior
São Francisco de Assis, localizada no município de Santa Teresa – ES.

1.2 COLETA E PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS

Com auxilio de um swab de algodão e solução salina estéril, serão coletadas

amostras das mãos dos manipuladores de ovos. Para amplificação e melhor
rendimento da amostra, o swab atravessará de uma ponta a outra a superfície
da mão. Após a coleta, o swab de algodão será mergulhado em um tubo
contendo caldo tioglicolato, que consiste em um meio de enriquecimento e,
portanto, favorece a amplificação dos microrganismos coletados. O meio
contendo a amostra será incubado à 37º por 48 horas.

1.3 ANÁLISE MICROBIOLÓGICA

Para melhor compreensão da sequência de eventos que serão realizados após

a coleta e processamento das amostras, foi confeccionado um esquema:

Figura 1 - Sequência de eventos pós-processamento

Como destacado pelo esquema, as amostras coletadas deverão convergir para
a identificação dos microrganismos encontrados, bem como a verificação da
possível resistência bacteriana.

1.3.1 Meios de Cultura

No presente estudo serão utilizados os meios Caldo Tioglicolato, Ágar

Nutriente, Ágar MacConckey, Ágar Sangue, Ágar Salmonella-Shigella, Ágar
Manitol Salgado e Ágar Mueller-Hinton, os quais serão preparados seguindo o
protocolo indicado pelo fabricante.

1.3.2 Bacterioscopia

Após a coleta e processamento das amostras, será realizada técnica de

Bacterioscopia, que consiste na observação microscópica dos microrganismos
cultivados durante o processamento. Para melhor avaliação, será realizado o
protocolo de coloração de gram, que consiste em um conjunto de corantes e
soluções químicas capazes de classificar os microrganismos em dois grandes
grupos: gram positivo e gram negativo. Após a coloração, as amostras serão
avaliadas ao microscópio e na sequência, à depender da classificação de
gram, sistemas de identificação serão seguidos a risca.

1.3.3 Cultivo Bacteriológico

Após a coloração de gram, os microrganismos que se apresentam no caldo

tioglicolato serão semeados em diferentes meios de cultivo cujas
características de seletividade e diferenciação são demasiadamente
importantes. Os meios utilizados nesta etapa serão os seguintes:
Tabela 1 – Meios de cultura e suas funções
Meio de Cultura Função
Ágar MacConkey Seletivo para bactérias gram-negativas
Ágar Sangue Diferencial para bactérias gram-positivas
Ágar Manitol Salgado Diferencial para bactérias gram-positivas
Ágar Salmonella-Shigella Diferencial para bactérias gram-negativas
Meio IAL/Rugai Diferencial para bactérias gram-negativas
Meio TSI Diferencial para bactérias gram-negativas

Em todos os meios de cultivo, a temperatura de incubação será próxima à

37ºC, variando apenas no tempo, que à depender do meio terá variação entre
12h à 48h.

1.3.4 Caracterização Bioquímica dos Microrganismos

Os microrganismos selecionados pelos meios de cultura citados na tabela 1

serão biotipados utilizando provas bioquímicas específicas, estando as
principais descritas na tabela abaixo:

Tabela 2 – Provas bioquímicas e suas funções

Prova Bioquímica
Prova da Catalase
Prova da Oxidase
Prova da Coagulase
Prova da Novobiocina
Prova da Bacitracina
Prova da Optoquina
Função
Diferencial para bactérias gram-positivas
Diferencial para bactérias gram-negativas
Diferencial para bactérias de ambos os
grupos
Diferencial para bactérias gram-positivas
Diferencial para bactérias gram-positivas
Diferencial para bactérias gram-positivas

1.3.5 Teste de Susceptibilidade aos Antimicrobianos

Após a identificação diferencial dos microrganismos cultivados, será realizada a

prova de susceptibilidade aos antimicrobianos (PSA), que consiste no cultivo
microbiológico das cepas de interesse e discos de antibióticos em Ágar
Mueller-Hinton à 37ºC por 48h. Ao final do tempo de cultivo, será observada a
incidência de halos de inibição de crescimento, o que norteará o seguinte
questionamento: os microrganismos encontrados são resistentes?

1.3 METODOLOGIA DE ANÁLISE DE DADOS

Os dados obtidos serão analisados e plotados em tabelas e gráficos utilizando

o software GraphPad Prism 7.0 (®San Diego, Califórnia). Serão utilizados os
testes Shapiro-wilks para avaliação da normalidade das amostras e o teste t de
student para comparação entre grupos positivos e negativos.

1.4 ASPECTOS ÉTICOS

Por se tratar de uma pesquisa cujo envolvimento de seres humanos é

demasiadamente expressivo, a pesquisa deverá ser submetida ao comitê de
ética por meio da plataforma Brasi