CENTRO UNIVERSITÁRIO FACULDADES METROPOLITANAS UNIDAS - FMU

CISBEM

Angel De Brito Goriba RA:1692733

Diogo Ferreira Da Silva RA:1433142
Giovanna Ferreira Botter RA:1852520
Guilherme Alves Paiva RA:1723900
Karen Eduarda Gombio RA:1872689
Nicoly Santos Araujo RA:1423604
Rafael Felipe Santos RA:1803341
Ruth Gonçalves De Lima RA:1768137
Taís Souza Santos RA:1708662

ANÁLISES DE COLIFORMES POR TUBOS MÚLTIPLOS (NMP), SEMEADURA

EM MEIOS SÓLIDOS E COLORAÇÃO DE GRAM EM ALIMENTOS E LEITURA

São Paulo, 2021

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Angel De Brito Goriba RA:1692733

Diogo Ferreira Da Silva RA:1433142
Giovanna Ferreira Botter RA:1852520
Guilherme Alves Paiva RA:1723900
Karen Eduarda Gombio RA:1872689
Nicoly Santos Araujo RA:1423604
Rafael Felipe Santos RA:1803341
Ruth Gonçalves De Lima RA:1768137
Taís Souza Santos RA:1708662

ANÁLISES DE COLIFORMES POR TUBOS MÚLTIPLOS (NMP), SEMEADURA

EM MEIOS SÓLIDOS E COLORAÇÃO DE GRAM EM ALIMENTOS E LEITURA

Relatório técnico apresentado como requisito

parcial para obtenção de aprovação na disciplina
Análise de Alimentos, na FMU.

Prof. Msc. Viviane Cristina Longuini de Menezes

São Paulo, 2021

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO.......................................................................................... 3
2 DESENVOLVIMENTO.............................................................................. 4
2.1 OBJETIVO GERAL................................................................................... 4
2.2 METODOLOGIAS..................................................................................... 4
2.2.1 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS.................................................. 5
2.3 RESULTADOS.......................................................................................... 12
3 CONCLUSÕES E RECOMENDAÇÕES.................................................. 12
ANEXOS................................................................................................... 13
REFERÊNCIAS........................................................................................ 14
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1 INTRODUÇÃO

O crescente interesse em garantir a integridade dos alimentos que

consumimos é motivado pela necessidade de prevenir surtos de doenças
transmitidas por alimentos e promover a saúde pública. Os coliformes, grupo
bacteriano que inclui Escherichia coli (E. coli), são indicadores valiosos, pois sua
presença sugere possíveis falhas nos processos de produção, manipulação ou
armazenamento dos alimentos.

Neste experimento, exploramos as técnicas de análise de coliformes por

tubos múltiplos (NMP) e semeadura em meios sólidos como métodos sensíveis e
específicos para avaliar a presença desses indicadores em amostras alimentares.
Compreender o contexto e as motivações por trás dessa análise é crucial para
aprimorar os protocolos de segurança alimentar e contribuir para a oferta de
produtos alimentícios que atendam aos mais altos padrões de qualidade e
segurança.
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2 DESENVOLVIMENTO

2.1.1 OBJETIVO GERAL

ANÁLISES DE COLIFORMES POR TUBOS MÚLTIPLOS (NMP), SEMEADURA

EM MEIOS SÓLIDOS E COLORAÇÃO DE GRAM EM ALIMENTOS
Ao final desta atividade experimental espera-se que o aluno seja capaz de:
- Realizar análises de identificação coliformes por tubos múltiplos (NMP);
- Realizar a semeadura em meios sólidos específicos para alimentos e analisar
os principais microrganismos causadores de toxinfecções alimentares;
- Realizar coloração de Gram, analisar, identificar diferenças morfológicas e
arranjos;
- Realizar a técnica de diferenciação do microrganismo através da prova da
catalase.

2.2 METODOLOGIAS
ANÁLISES DE COLIFORMES POR TUBOS MÚLTIPLOS (NMP),
SEMEADURA EM MEIOS SÓLIDOS
COLORAÇÃO DE GRAM EM ALIMENTOS

2.2.1 ANÁLISES DE COLIFORMES POR TUBOS MÚLTIPLOS (NMP)

2.2.1.1 MATERIAL E REAGENTE
Bico de bunsen,
Alça de platina,
Pissete com Alcóol 70%,
tubos de Durham estéreis,
béquer de 100 mL,
proveta de 50 mL,
tubos de caldo EC ou caldo Mac Conkey ou caldo BHI estéreis com tampa.
tubos de caldo BHI com 7,5% NACL com tampa e estéril.
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2.2.1.2 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

A técnica de tubos múltiplos é a mais tradicional para a análise de coliformes (totais
ou termotolerantes) e E.coli. Esta metodologia permite a quantificação por “número
mais provável” (NMP) de microrganismos e é dividida em duas fases sucessivas,
uma presuntiva e outra confirmativa. E esta última somente é realizada se houver
crescimento positivo na etapa presuntiva.
O procedimento da fase presuntiva consiste em fazer a homogeneização e
transferência de alíquotas e/ou diluições da amostra para tubos de ensaios
contendo, no fundo, um tubo invertido para coleta de gás (tubo de Durhan), e o meio
de cultura apropriado (caldo lauril triptose). Todos os tubos são incubados a 35°C
durante 24 a 48 horas e posterior identificação dos que tiverem crescimento
(positivo) de coliformes totais, resultado identificado pela ocorrência de reação ácida
(coloração amarelada) ou produção de gás (retida no tudo de Durhan).
Na fase confirmativa, efetua-se o repique (transferência de alíquotas com alça de
platina) dos tubos presuntivos positivos para tubos preparados da mesma forma que
no anterior, porém contendo caldo. Todos os tubos são incubados a 35°C durante 24
a 48 horas e posterior identificação dos que tiverem crescimento (positivo) de
coliformes totais, identificado pela ocorrência de produção de gás nos tubos de
Durhan.
Na fase confirmativa, efetua-se o repique (transferência de alíquotas com alça de
platina) dos tubos presuntivos positivos para tubos preparados da mesma forma que
no anterior, porém contendo caldo. Todos os tubos são incubados a 35°C durante 24
a 48 horas e posterior identificação dos que tiverem crescimento (positivo) de
coliformes totais, identificado pela ocorrência de produção de gás nos tubos de
Durhan.
(A fase complementar serve para identificação dos coliformes termotolerantes,
na qual faz-se o repique dos tubos presuntivos para outros tubos, desta vez
contendo meio EC (recomenda-se que seja feito simultaneamente ao teste
confirmativo), que deverão ser incubados a 44,5ºC durante 24 horas. Todo este
procedimento totaliza no mínimo 72 horas para obtenção de resultado positivo para
coliformes termotolerantes.)
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2.2.1.3 ANÁLISE DOS TUBOS (ESSA ETAPA SERÁ ANALISADA

POSTERIORMENTE NA AULA DA PRÓXIMA SEMANA)

De acordo com o número de tubos positivos em cada uma das diluições e das fases
utilizadas, determina-se o número mais provável (NMP), tendo como base tabelas
estatísticas.
Acesse as tabelas de NMP e os procedimentos completos para análise de
coliformes, segundo o FDA, no link:
http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm109656.htm
#tab1
Usando a Tabela, é possível estimar o número de organismos a partir de qualquer
combinação de resultados positivos e negativos com 95% de confiança dos dados.

2.2.2 SEMEADURA EM MEIOS SÓLIDOS

Semeadura e isolamento
Material enriquecido em caldo TSB de swab ou “in natura”:
Placas: esgotar o material em um ponto da placa e com a alça comum de níquel-
cromo flambada e fria, realizar a semeadura com estrias para isolamento a partir do
ponto de aplicação da amostra (semeadura direta) (Fig 1 a 4);
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Fig 1 Fig 2 Fig 3 Fig 4 Fig 5

As placas a serem utilizadas serão Agar MacConkey e Agar Manitol.

Levar para a estufa a 36,5°C por 24h, para obter a multiplicação dos Mos. Do meio.

2.2.3 Avaliar o crescimento microbiano nos diferentes meios de cultura e realizar a

identificação dos microrganismos.
(ESSA ETAPA SERÁ ANALISADA POSTERIORMENTE NA AULA DA PRÓXIMA
SEMANA)

Interpretação
Crescimento no Agar MacConkey – Gram Negativos
Fermentadores de Lactose – Colônia Rosa
Não Fermentadores de Lactose – Colônia Incolor ou Branca
Crescimento no Agar Manitol – Gram Positivas
Colônia pequeno e rodeadas de uma zona vermelha – estafilococos não-
patogênicos
Colônia maiores e rodeadas de uma zona amarela – Staphylococcus aureus
fermentadores do manitol

2.2.4 Prova da catalase

Quando houver suspeita de cocos Gram-positivos, realizar uma bacterioscopia e
depois a prova da catalase.
a) Em um tubo de ensaio limpo, colocar cerca de 5 mL de peróxido de hidrogênio 20
volumes
b) Com auxílio de uma alça, transferir uma colônia para o tubo e emulsioná-la no
peróxido.
c) Um desprendimento intenso de bolhas indica resultado POSITIVO.
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2.2.5 Coloração de Gram

INTRODUÇÃO
A coloração de Gram, desenvolvida pelo bacteriologista dinamarquês Hans Christian
Gram, é uma técnica essencial na caracterização de bactérias. Esse método permite
a diferenciação entre dois grupos principais de bactérias, Gram-positivas e Gram-
negativas, com base em suas características de parede celular.

O procedimento inicia-se com a fixação do esfregaço bacteriano pelo calor. Em

seguida, ocorre a aplicação sequencial dos reagentes: cristal violeta, lugol, etanol-
acetona e fucsina básica. A interação específica entre esses reagentes e as
estruturas celulares proporciona a distinção entre os dois grupos bacterianos.

As bactérias Gram-positivas, devido à espessa camada de peptidoglicano em suas

paredes celulares, retêm o corante cristal violeta após a lavagem com etanol-
acetona. Em contraste, as bactérias Gram-negativas, com paredes celulares mais
finas, não conseguem manter a coloração e são coradas pela fucsina básica.

A coloração de Gram é fundamental para a identificação rápida e preliminar de

bactérias, sendo uma ferramenta valiosa na microbiologia. A interpretação dos
resultados fornece insights sobre a morfologia, tamanho e características
fundamentais das amostras bacterianas analisadas, contribuindo para diagnósticos e
estudos microbiológicos.
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2.2.4.1 OBJETIVO
Nesta aula o aluno irá executar o método de coloração de Gram, em esfregaços já
previamente preparados e fixados pelo calor. Posteriormente, o aluno realizará a
visualização dos esfregaços corados no microscópio óptico empregando a objetiva
de imersão, deverão ser capazes de caracterizar a morfologia individual, a formação
de agrupamentos e diferenciação da coloração da célula bacteriana.

2.2.4.2 MATERIAL E REAGENTE

Bico de Bulsen,
• Alça de Platina;
• Tubos de Ensaio;
• Algodão;
• Estante para tubo de ensaio;
• Conta-gotas;
• Placa de Patrick;
• Hagar Chocolate;
• Microscópio Ótico
• Lâmina
• Lamínula
• Cristal Violeta
• Lugol
• Fucsina

2.2.4.3 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

Com todos os materiais sobre a bancada inicia-se pelo processo de esterilização da
alça de platina sobre o bico de bulsen, para esterilizá-la deve-se segurá-la da
mesma forma como se segura uma caneta, e rodá-la em cima do bico de bulsen
para que o fogo percorra toda sua extensão, depois deve-se incliná-la
aproximadamente 45º e esperar que ela fique incandescente; após a esterilização a
alça de platina deve ficar apoiada no bico de bulsen para que ela não saia da área
de proteção do mesmo. Tudo que for pego com a mão direita ou esquerda deve-se
permanecer neste mesmo lado, visto que a troca de objetos de uma mão para a
outra pode ocasionar acidentes devido ao risco que o bico de bulsen apresenta por
se tratar de um emissor de chama.
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Manuseando na área de segurança, pega-se o tubo de ensaio, retira-se o algodão

que está tampando-o e com um conta gotas coleta-se a salina que está no tubo;
esta salina deve ser pingada (uma gota) na lâmina que vai ao microscópio; no final
deste procedimento deve-se passar o tubo de ensaio no bico de bulsen e tampá-lo
novamente com algodão. Segurando de maneira leve a alça de platina, deve se abrir
a placa de Patrick e esfregar a alça nela superficialmente para que possa ser
retirada uma finíssima camada de microrganismos
que ali cresceram; tampa-se novamente a placa e realiza-se um esfregaço desta
camada na lâmina que contêm a salina.
Com o bico de bulsen aceso, e com um prendedor segurando a lâmina, realiza-se a
secagem da placa de maneira lenta, sem que ela corra risco de estourar.
Após a secagem foi realizado o processo de coloração; para corar devem-se realizar
os seguintes passos:
a. Pingar o cristal violeta e esperar um minuto
b. Sobre ele pingar lugol e esperar mais um minuto,
c. Colocar solução de álcool cetona e lavar com água,
d. Cobrir com Fucsina e esperar 30 segundos,
e. Lavar e deixar secar.

2.2.4.4 ANÁLISE E LEITURA (ESSA ETAPA SERÁ ANALISADA

POSTERIORMENTE NA AULA DA PRÓXIMA SEMANA)

Observar ao microscópio em menor aumento e, a seguir, colocar 1 gota de óleo

mineral na lâmina e focalizar com objetiva de imersão.
Desenhar as bactérias observadas considerando o tipo de coloração (Gram + ou -),
a forma e o arranjo das células.
Após o uso, a objetiva de imersão deve ser limpa com papel absorvente.
As bactérias que tiverem a característica irão formar cristais violeta em seu interior e
se diferenciarão das demais pela coloração mais acentuada.
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Morfologia Arranjo Gram

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Quando as estruturas celulares, como você explicaria a possibilidade de

comportamento das bactérias G + e G - na coloração de Gram?

2.3 RESULTADOS

Figura 1-

Figura 2-
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Figura 3- cocos

Figura 4-
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3 CONCLUSÕES E RECOMENDAÇÕES
No contexto da análise de coliformes por tubos múltiplos, a abordagem tradicional
revelou a eficácia da metodologia NMP na quantificação de microrganismos. As
fases presuntiva e confirmativa foram executadas com precisão, destacando a
importância da incubação e identificação de resultados positivos.

A técnica de semeadura em meios sólidos foi crucial para avaliar a presença de

microrganismos em alimentos. O procedimento detalhado, desde a esterilização da
alça de platina até a manipulação segura, foi enfatizado, garantindo resultados
confiáveis na interpretação de colônias formadas.

A coloração de Gram, aplicada na análise de alimentos, permitiu a distinção entre

bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. A execução precisa do procedimento,
incluindo a esterilização da alça de platina e a aplicação sequencial dos reagentes,
contribuiu para uma leitura mais apurada das características bacterianas.

Em suma, a integração dessas técnicas proporcionou uma visão abrangente das

análises microbiológicas em alimentos, aprimorando nosso entendimento prático
desses métodos essenciais na garantia da segurança alimentar.
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ANEXO
TÉCNICAS DE SEMEADURA
Semeadura em Placas de Petri:
O material a ser semeado deverá conter poucos microrganismos porque o inóculo
para o isolamento deve ser leve. Lembrar que cada colônia formada na superfície de
um meio sólido é originada de um ou alguns microrganismos. Quanto maior o
número, menor possibilidade de isolamento e maior probabilidade de crescimento
confluente. Quando o inóculo for obtido a partir de meio sólido (inóculo pesado), este
poderá ser diluído em salina estéril ou ser utilizada a técnica de esgotamento
adequada.
Estrias Múltiplas para Isolamento: Consiste em espalhar o material com o auxílio de
uma alça bacteriológica, fazendo estrias sucessivas até o esgotamento do material,
de modo a obter-se um perfeito isolamento das bactérias existentes na amostra.
Quando o material é muito denso, a alça deverá ser flambada. A semeadura poderá
ser realizada em um sentido ou em vários, de acordo com a pessoa que realizará a
técnica, lembrando-se sempre que o objetivo principal desta técnica de semeadura é
a obtenção do isolamento bacteriano.

Semeadura em Meio Líquidos:

Difusão: Técnica que consiste em acrescentar microrganismos através da alça ou
agulha de platina em meios líquidos. Tem como principal finalidade a observação de
propriedades bioquímicas através de testes microbiológicos, bem como poderá ser
utilizada para o favorecimento do crescimento bacteriano, quando é realizada em
meios que possibilitem o enriquecimento.
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Técnica para semeadura em meios líquidos:

Segurar a alça com a mão direita, flambar primeiro na chama azul, depois na
amarela. Esperar esfriar (a alça é flambada na posição vertical e deverá ficar atrás
da chama para proteção do operador);
Retirar a rolha de algodão do tubo que contém o microrganismo a ser semeado ou
repicado (que deverá estar na mão esquerda) utilizando-se o dedo mínimo da mão
direita. A ROLHA OU TAMPA DEVERÁ PERMANECER SENDO SEGURA COM O
DEDO MÍNIMO, ATÉ
O FINAL DA OPERAÇÃO;
Flambar a boca do tubo, e retirar o inóculo com a alça fria;
Flambar novamente a boca do tubo e fechar;
Pegar o tubo onde se irá realizar a semeadura, retirar a rolha e flambar;
Semear o material, flambar a boca do tubo e fechar;
Esterilizar a alça, identificar o tubo semeado e levar para incubação em estufa
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REFERÊNCIAS

ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS – ABNT. NBR 10719:

apresentação de relatórios técnico-científicos. Rio de Janeiro, 1989. 9 p.

bsjoi.ufsc.br/files/2010/.../Modelo_de_relatorio_tecnico-cientifico.do