UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

Instituto de Biociências – Campus de Rio Claro

Departamento de Bioquímica e Microbiologia

ENUMERAÇÃO DE POPULAÇÕES MICROBIANAS

Disciplina: Microbiologia Geral e Aplicada Prática 06

Prof. Dr. André Rodrigues

 Objetivos

a) Estimar o número de bactérias em uma amostra por unidade de medida (ex: g ou mL).
b) Familiarizar‐se com as técnicas de diluição em série e espalhamento em superfície.

 Considerações

É de grande interesse para o microbiologista saber o número de bactérias e fungos presentes por
grama de um determinado produto, alimento ou amostra de origem ambiental. Em outras palavras, deseja‐
se conhecer a carga microbiana associada a esses substratos. Uma vez determinado o numero de micro‐
organismos em uma amostra, tal valor pode ser comparado com os valores máximos permitidos definidos
em legislação especifica (p. ex: normas estabelecidas para controle da qualidade da água potável).
Uma das maneiras de avaliar a abundância de micro‐organismos é simplesmente semear a amostra
em um meio de cultivo sólido e enumerar as colônias que aí se desenvolvem. A tais colônias dá‐se o nome
de unidade formadora de colônia (UFC), conceito muito utilizado em microbiologia. Amostras ambientais
geralmente abrigam uma grande quantidade de células microbianas e, portanto, as amostras
necessariamente necessitam serem diluídas antes de serem analisadas.
Nesta aula, veremos duas técnicas muito utilizadas na enumeração de micro‐organismos aplicadas
a amostras ambientais e alimentos. Técnicas simples como a diluição em série seguida do espalhamento
em superfície, podem auxiliar o microbiologista a estimar o número de células viáveis em uma amostra de
origem ambiental.

 Procedimento

Contagem de células viáveis em amostras de solo

1. Preparação da amostra de solo:

a) Peneirar a amostra de solo em uma bandeja limpa de modo a remover pedras, galhos, folhas ou
qualquer outro material que permita a formação de agregados de solo.
b) Pesar 1g de amostra de solo em papel alumínio estéril.
c) Pesar 1g de amostra de solo em uma base placa de Petri (lembrar de “tarar” a base da placa). Deixar a
base da placa de Petri em estuda a 60° C durante 12 horas. Essa amostra será utilizada para avaliar o peso
seco do solo.

2. Diluição em série

a) Marque os tubos de diluição contendo solução salina 0,85%, seguindo as diluições 10‐1 ate 10‐6.

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b) Faça o mesmo para as placas de Petri contendo meio PCA (plate count agar) e AS suplementado com
cloranfenicol. Serão utilizadas 2 placas de cada meio por diluição. Atente para as instruções do professor de
quais diluições serão efetivamente inoculadas.
c) Suspender 1g de solo no tubo marcado 10‐1 e que contem 9 mL de solução salina. Agitar tubo no vortex
durante 1 minuto.
d) Com uma ponteira estéril, pipetar 1000 μL (ou 1 mL ) do tubo 10‐1 para o tubo marcado a 10‐2.
e) Retirar uma alíquota de 100 μL (ou 0,1 mL) do tubo 10‐1 e transferir no centro de cada uma das placas.
Em seguida, desprezar as ponteiras.
f) Atenção: mergulhe a alça de Drygalski no álcool e flambe‐a sempre mantendo a alça virada para baixo
(para evitar queimar a mão)!
g) Esfriar a alça na superfície interna da tampa da placa de Petri ou na superfície do ágar, distante do local
onde foi disposto o inóculo.
h) Faça movimentos circulares leves, sempre girando a base da placa de modo a espalhar a amostra de
forma homogênea.
i) Flambar novamente a alça de Drigalski.
j) Repita a operação (d – i) de forma a terminar a sequência de tubos da diluição seriada.

Contagem de células viáveis em amostras de alimentos

Preparação das amostras:

a) Pesar 10 g de amostra de solo em papel alumínio estéril.

b) Homogeneizar 10 g de amostra em frasco Schott contendo 90 mL de solução salina 0,85% estéril. Se
necessário, utilizar bastão de vidro para auxiliar na quebra dos agregados de alimento. Flambar o bastão
antes de utilizá‐lo.
c) Após homogeneizar a amostra, proceder com as diluições seriadas conforme descrito.

Figura 1. Enumeração de micro‐organismos

através da técnica de diluição seriada e
espalhamento em superfície. Note que na figura,
1 mL da amostra foi inoculada nas placas, ou invés
de 0,1mL mencionados no texto.

Fonte: Madigan et al. (2004) Microbiologia de

Brock; 10ª edição, volume eletrônico (CD).
Pearson Prentice Hall, Inc.

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 Incubação

As placas de PCA (meio para determinação de bactérias heterotróficas) serão incubadas a 37º C durante 24
h; as placas de AS (fungos) serão incubadas a 25º C durante sete dias.

 Resultados

Anote o resultado das contagens na tabela abaixo:

Tipo de Diluições
UFC/g
substrato
Bactérias heterotróficas Bolores e leveduras
Réplica 1 Réplica 2 Média Réplica 1 Réplica 2 Média
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6

 Questões

1.) Considerando a técnica de contagem em placa, qual é a principal limitação quando se

utiliza de tal técnica para enumerar micro‐organismos de amostras ambientais?
2.) Quais “tipos nutricionais” microbianos podem ser isolados com os meios de cultura
utilizados?

 Referências

ALCÂNTARA, F.; CUNHA, M. A.; ALMEIDA, M. A. Microbiologia: práticas laboratoriais. 2ª ed. Aveiro:
Universidade de Aveiro, 2001. 297 p.
LACAZ‐RUIZ, R. Manual Prático de Microbiologia Básica. Edusp: São Paulo, 2000. 129p.
MADIGAN, M.T.; MARTINKO, J.M.; PARKER, J. Microbiologia de Brock. 10a. ed. Prentice‐Hall Inc., 2004. 608
p.
NEDER, R. N. Microbiologia: Manual de Laboratório. Editora Nobel: São Paulo, 2000. 144p.
PEPPER, I. L.; GERBA, C. P. Environmental microbiology: a laboratory manual. 2nd ed. Elsevier Press:
Amsterdam, 2004. 209 p.
RIBEIRO, M. C.; SOARES, M. M. S. R. Microbiologia Prática: Roteiro e Manual. Editora Atheneu: São Paulo,
2000. 112p.
SEELEY JR., H. W.; VANDERMARK, P. J.; LEE, J. J. Microbes in action: a laboratory manual of microbiology.
4th ed. W. H. Freeman and Company: New York, 1991. 450 p.