UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA

INSTITUTO DE GEOCIÊNCIAS
Programa de Pós-Graduação em Geoquímica: Petróleo e Meio Ambiente
POSPETRO

AULA PRÁTICA N° 1

Nome do professor Disciplina Turno Data / horário Semestre

Danusia Ferreira Lima GEOB92 Matutino 2018.1
Isana Barreto de Souza Introdução a
Microbiologia
Ambiental

Atividade
Técnica de Membrana Filtrante

I. Introdução:
A contagem de microrganismos na água pode fornecer uma indicação geral sobre a qualidade microbiológica da
água e quando realizada regularmente pode trazer informações sobre alterações ocorridas no meio.
A técnica de membrana filtrante é um dos métodos que pode ser utilizado para a quantificação de microrganismos,
como fungos e bactérias, além disso, é uma técnica muito reprodutível e pode ser utilizada para grandes volumes de
água.

II. Objetivos:
Este método possibilita a contagem de UFCs microbiológica em água salina contaminada por petróleo.

III. Material:
 Proveta
 Frasco Kitassato
 Frasco para protecão
 Porta-filtro de vidro
 Ponteiras
 Pipetador automático de 5 mL
 Placas de Petri com meio de cultivo estéril
 Membrana filtrante
 Pinça de aço inoxidável
 Papel filme
 Água destilada
 Cloreto de sódio
 Béquer para descarte
 Erlenmeyer de 125 mL e de 1 L
 Lamparina com álcool
IV. Equipamentos:
 Balança
 Autoclave
 Bomba de vácuo
 Incubadora
 Refrigerador
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 Câmara de fluxo laminar vertical POSPETRO
 Contador de colônias
 Placa aquecedora
V. Procedimentos:
1° Passo: Verter meio para cultivo dos microrganismos

 Preparar 1 L (divido em 2 erlemeyers) de meio de cultura (ágar nutriente para bactérias e sabouraud para
fungos) em erlemeyer de vidro (para confeccionar 40 placas);

 Embalar placas de petri limpas em jornal e saco plástico;

 Altoclavar erlenmeyers contendo o meio e as placas a 120°C por 20 minutos;

 Dentro da câmara de fluxo laminar vertical, verter o meio nas placas de petri e aguardar o meio se tornar
sólido, depois ligar U.V. por 15 minutos, fechar as placas e embalar;

 Realizar teste de esterilidade mantendo as placas na incubadora por 24h e observar se houve crescimento
de microrganismos.

2° Passo: Autoclavar material para análise e colocar no U.V.

 Preparar soluções salinas em erlenmeyrs de 125 mL, contendo água destilada (90 mL), de cloreto de sódio
(0,81g) e twin (270 μL);

 Preparar 1 L de solução salina (1 L água + 9 g solução salina) para ambientar a vidraria antes de cada
amostra vertida;

 Embalar ponteiras plásticas (azul e transparente);

 Embalar pinça;

 Depois de autoclavado, colocar material dentro do fluxo laminar, ligar U.V. por 15 minutos e esperar a
vidraria esfriar para iniciar o 3°passo.

3° Passo: Procedimento dentro da câmera de fluxo laminar (Figura 1)

 Identificar os erlemeyer com piloto (TOTAL,-1,-2,-3,-4,-5) e (1,2,3,4,5);

 As amostras coletadas devem ser homogeneizadas manualmente e transferidas com uma pipeta estéril de
10 mL da amostra para o erlemeyer (TOTAL) e homogeneizada;

 Retirar 10 mL da amostra TOTAL e transferir para outro erlenmeyer contendo a solução salina (1°
diluição decimal – 10-1) e homogeneizar. Repetir a operação com a diluição feita anteriormente (10-1) e
desta, com uma nova pipeta estéril de 10 mL para outro erlenmeyer (2° diluição decimal – 10-2) e proceder
dessa maneira na sequência das diluições desejadas (10-3, 10-4, 10-5);

 Retirar uma alíquota de 1 mL de cada diluição com uma pipeta e adicionar aos erlemeyer (1,2,3,4,5)
contendo 90 mL de solução salina e homogeneizar;

 Proceder às filtrações de cada erlenmeyer com as diluições no sistema de bomba a vácuo;

 Verter o volume da amostra no porta filtro com a membrana filtrante utilizando uma pinça, ligar a bomba
de vácuo até toda a amostra ser filtrada e depois desligá-la para finalizar a operação;

 Retirar a parte superior da porta-filtro com a pinça flambada e retirar a membrana;

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 Colocar cuidadosamente a membrana, com a superfície quadriculada voltada para cima, na superfície do
meio de cultura contido na placa petri, devidamente identificada com o número da amostra, tampar e
lacrar as bordas com papel filme;

 Enxaguar o porta-filtro 2x com solução salina para utilizar outras amostras (usar o becker de descarte de
água);

 Após as filtrações, colocar as placas contendo meio de cultura e a membrana em posição invertida na
incubadora por 5 dias para fungos e 1 dia para bactérias.

 Descontaminar todo material, secar e guardar.

4° Passo: Contagem das colônias

 Realizar a contagem dos microrganismos em cada placas de petri com o auxílio do contador de colônias e
isolá-los quando necessário.

Figura 1- Fluxograma para técnica da Membrana filtrante.

Fonte: Barreto, 2015.

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VI. Questões para discussão:
1-Para que serve as diluições?
2- Qual a importância da esterilidade da vidraria?

VII. Bibliografia:
CETESB- Norma Técnica. Coliformes Totais – Determinação pela técnica de Membrana Filtrante – Método de
Ensaio. 1984.
CETESB- Norma Técnica L5. 201. Bactérias Heterotróficas– Contagem em placas: método de ensaio. p. 14,
2006.
MELO, Itamar Soares; AZEVEDO, João Lúcio. Como isolar microrganismos degradadores de moléculas
xenobióticas. 1997.

VIII. Anexos: