UNIVERSIDADEFEDERAL DE RIO GRANDE- FURG

Escola de Química e Alimentos

Engenharia Agroindustrial Agroquímica
Engenharia Agroindustrial Industrias Alimentícias

CONTAGEM TOTAL DE MICRORGANISMOS AERÓBIOS MESÓFILOS E

AERÓBIOS PSICROTRÓFICOS EM AMOSTRA DE SALADA DE FRUTA

Relatório referente à aula prática da

disciplina de Microbiologia realizada
dia 10/04/2018.

Matheus Dutra
Mirian da Rosa

Santo Antônio da Patrulha

2018
1. INTRODUÇÃO

Os alimentos de origem animal ou vegetal, frescos ou processados, podem

conter presença de microrganismos. Assim, ter o conhecimento das maneiras de
proliferação microbiana é fundamental para um controle alimentar. Estimando pelo seu
perfil microbiológico o tempo útil na prateleira para consumo e a compreensão de
maneiras para evitar o crescimento de determinado microrganismo em certos alimentos
(SAEKI, 2010).
Alimentos são facilmente contaminados com microrganismos na natureza,
durante manipulação e processamento. Após ter sido contaminado, o alimento serve
como meio para o crescimento de microrganismos. Se esses microrganismos tiverem
condições de crescer, podem mudar as características físicas e químicas do alimento e
podem causar sua deterioração. Os microrganismos no alimento podem também ser
responsáveis por intoxicações e infecções transmitidas por alimentos (PELCZAR Jr. et
al., 1997).
De acordo com Silva e colaboradores (2001), o método de contagem de
microrganismos em placas é um método geral, que pode ser utilizado para contagem de
grandes grupos microbianos, como aeróbios mesófilos, aeróbios psicrotróficos,
termófilos, bolores e leveduras, variando-se o tipo de meio, a temperatura e o tempo de
incubação.
Por este método, Jay (1998) considera que amostras de alimentos são
homogeneizadas, diluídas em série, em diluente apropriado, plaqueadas com ou sobre
um meio de ágar apropriado e incubadas, após o que todas as colônias visíveis são
contadas, ou seja, o procedimento se baseia na premissa de que cada célula microbiana
presente em uma amostra irá formar uma colônia separada e visível, quando fixada com
meio que lhe permita crescer.
Franco e Landgraf (1996) relatam que essa metodologia é, certamente a mais
utilizada nos laboratórios de análise de alimentos, pois diferentes grupos de
microrganismos podem ser enumerados de acordo com o meio de cultura e/ou as
condições de incubação (tempo, temperatura e atmosfera) empregadas.
Para o controle da proliferação dos mesófilos o produto tem que estar em
ambiente refrigerado. Por volta de 5-8°C permite o crescimento de microorganismos
psicrotróficos. Assim, o objetivo do experimento foi quantificar os resultados da
contagem total de microrganismos aeróbios mesófilos e aeróbios psicrotróficos em uma
amostra de Salada de Fruta que estava dentro do prazo de validade (SAEKI, 2010).
2. METODOLOGIA

Inicialmente foram realizadas as higienizações necessária e os devidos

procedimentos assépticos com álcool 70%, como, desinfetar a bancada usada para
manipulação da amostra e as mãos. Caracterizando-se um ambiente seguro para
realização de experimentos com microrganismos. Foram realizadas as manipulações
para os métodos de contagem, plaqueamento em profundidade para os mesófilos e
plaqueamento em superfície para os psicrotróficos, todas ao redor do bico de Bunsen.

PREPARO DA AMOSTRA: SALADA DE FRUTA

Primeiramente, a amostra foi cuidadosamente aberta e então foi separado e

pesado 25,70 g de salada de fruta, sendo esta inserida em um saco plástico que em
seguida passou por processo de homogeneização através da mistura, asséptica, de
225 mL de água peptonada. Posteriormente, o recipiente plástico contendo a amostra e a
água peptonada foi transferida ao Stomacher onde permaneceu sobre constante agitação
por 2 min até completar o processo de homogeneização.
Esse método resulta na diluição de 10-1, sendo a partir desta geradas sucessivas
diluições. Para obter a diluição 10-2, foram transferidos assepticamente volumes de 1,0
mL da amostra para 9,0 mL de diluente, o tubo então foi agitado constantemente, antes
da transferência do volume. Para a preparação da diluição de 10-3, transferiu
assepticamente 1,0 mL da diluição de 10-2 para 9,0 mL de diluente.

INOCULAÇÃO PARA CULTIVO DE MESÓFILOS AERÓBIOS TOTAIS

PELO MÉTODO DE PLAQUEAMENTO EM PROFUNDIDADE:

Subsequentemente, foi realizado a inoculação para análise de microrganismos

mesófilos. Inoculou-se 1,0 mL de cada diluição em placas de Petri separadas, estéreis e
vazias, abrindo as placas apenas o suficiente para inserir a pipeta e depositar o inóculo
(fora do centro da placa). Posteriormente, verteu-se nas placas inoculadas,
aproximadamente 20 mL de ágar padrão para contagem (PCA), previamente fundido e
resfriado a 45 °C. Misturou-se o inóculo com o meio de cultura movimentando
suavemente as placas, em uma superfície plana, usando movimentos na forma de oito
em sentidos horário e anti-horário. Em seguida as placas foram distribuídas próximas ao
bico de Bunsen. Após, sua completa solidificação, inverteram-se as placas e estas foram
incubadas na temperatura de 35 °C por 48 horas, para após realizar o processo de
contagem de colônias formadas.

INOCULAÇÃO PARA CULTIVO DE PSICOTRÓFICOS AERÓBIOS

 TOTAIS PELO MÉTODO DE PLAQUEAMENTO EM SUPERFÍCIE:

Primeiramente, foram preparadas as placas contendo 20 mL de ágar PCA.

Inoculou-se 0,1 mL de cada diluição na superfície das placas preparadas com o meio,
usando alça flambanda de Drigalski (com etanol 70%) entre uma placa e outra (a alça é
resfriada na parte interna da placa antes de colocá-la em contato com o inóculo), o
inóculo é cuidadosamente espalhado por toda a superfície do meio. Para sua incubação
aguardou-se até que as placas estivessem secas, em seguida estas foram invertidas e
incubadas (geladeira) a 7°C durante 7 dias. A Figura 2 apresenta as placas inoculadas e
prontas para serem conduzidas à câmara de incubação (geladeira).
Após o término do experimento, descartaram-se os resíduos em um local
adequado para os mesmos e as vidrarias utilizadas foram limpas com água corrente e
armazenadas em um local arejado.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

A tabela 01 apresenta o resultado do processo de contagem total de

microrganismos aeróbios psicrotróficos e aeróbios mesófilos, de uma amostra de salada
de fruta adquirida na data de 10 de abril 2018 e analisada no mesmo dia. Para a
realização da análise, cada valor de diluição avaliado foi realizado em duplicata, sendo
apresentada a contagem individual de cada placa.

Tabela 1: Resultados do processo de determinação de microrganismos totais aeróbios

mesófilos e psicrotróficos em amostra de salada de fruta.
Mesófilos Psicrotróficos
Placa 1 Placa 2 Contagem Placa 1 Placa 2 Contagem
Diluições
[colônias] [colônias] UFC/g [colônias] [colônias] UFC/g
0,1 Inc Inc inc inc
5
0,01 Inc Inc 2,62x10 212 249 3,45x105
0,001 271 252 14 78
* Resultados efetivamente utilizados para a contagem total de microrganismos.

Os resultados apresentados na tabela 01, para a contagem de microrganismos

totais aeróbios mesófilos, mostram que para diluições menores que 10-3, os dados foram
incontáveis, uma vez que a quantidade de colônias visíveis nas placas ficou fora do
intervalo considerável viável para quantificação (entre 25 e 300 colônias por placa). As
diluições 10-1 e 10-2 apresentaram espalhamento, assim, para minimizar a probabilidade
de erro de contagem, essas diluições foram desconsideradas do processo de
quantificação. Dessa forma, a única diluição considerada viável para quantificação é a
de 10-3, indicando uma concentração de 2,62x105 Unidades Formadoras de Colônias de
microrganismos aeróbios mesófilos, por grama de amostra.
Com relação à quantificação de microrganismos psicrotróficos aerobios totais, a
tabela 01 mostra que, diferente do que ocorreu na quantificação de microrganismos
aeróbios mesófilos totais, as diluições 10-2 e 10-3 apresentaram resultados viáveis para
quantificação, já que essas diluições apresentaram quantidades de colônias visíveis
compreendidos entre 25 e 300 colônias. Assim, a análise quantitativa indicou a presença
de 3,45x105 Unidades Formadoras de Colônias de microrganismos aeróbias
psicrotróficos, por grama de amostra (respectivamente).
No Brasil, a legislação vigente que estabelece os padrões microbiológicos
sanitários para frutas, produtos de frutas e similares, destinados ao consumo humano é a
RDC n° 12, de 02 de Janeiro de 2001, da Agência Nacional de Vigilância Sanitária do
Ministério da Saúde (ANVISA), anexo I (Brasil, 2001). Entretanto,como esta resolução
não define o limite de tolerância máxima para contagem de microrganismos mesofilos
ou psicrotróficos, a comparação qualitativa, do resultado de contagem obtido para a
mostra, foi feita utilizando fontes alternativas para limites de tolerância de quantidade
de microrganismos.

Na literatura existe uma variação em torno dos valores estabelecidos para

alimentos e para os vegetais prontos para consumo. Em geral, contagens aeróbicas entre
106 e 107 UFC.g-1 são comuns em vegetais prontos para consumo (JAY, 2005). Lima
(2003) afirma em seu estudo que diz que a contagem de mesófilos acima de 10 7 a 108
UFC.g-1 indica término da vida útil dos produtos.
Com base no limite de tolerância apresentados por Jay (2005) e Lima (2003), a
amostra de salada de fruta analisada neste trabalho apresentou contagem de Unidades
Formadoras de Colônias inferiores ao estabelecido, de forma que, do ponto de vista
microbiológico, esta amostra pode ser considerada viável para o consumo humano.
Com relação a analise de microrganismos totais aeróbios psicrotróficos, a
legislação não define limites de tolerância máximos para contagens destes no tipo de
alimento analisado, assim, a quantidade de Unidades Formadoras de Colonias
apresentada pela amostra foi comparada com resultados de pesquisas em amostras de
frutas e hortaliças minimamente processadas.
Segundo Silva (2006) em sua pesquisa com minimamente processados observou
que os psicrotróficos variam entre 7,9x106 UFC.g-1 e 2,8x108 UFC.g-1. Os valores
apresentados referem-se aos índices mais baixos e mais elevados, respectivamente.
Uma vez que a amostra de salada de frutas apresentou contagem de 3,45x105
UFC.g-1 pode-se confirmar a presença de microrganismos psicrotróficos totais, e
sabendo o limite de tolerância, a amostra em questão foi considerada apta ao consumo.
CONCLUSÃO

O método de contagem de microrganismos utilizado neste experimento,

apresentou resultados viáveis para quantificação de onde conclui-se que, de acordo com
os padrões estabelecidos pela literatura de referência, a amostra de salada de fruta
analisada contém microrganismos aeróbios mesófilos (2,62x105 UFC.g-1) e aeróbios
psicrotróficos (3,45x105 UFC.g-1) em quantidade inferior ao permitido para segurança
alimentar podendo portanto ser consumido.

4. REFÊRENCIAS

BRASIL. Ministério da Saúde. Resolução RDC nº 12, de 02 de janeiro de 2001. Aprova

o Regulamento Técnico sobre Padrões Microbiológicos para Alimentos. Diário Oficial
[da] Republica Federativa do Brasil. Brasília, DF, 10 jan. 2001.
FRANCO, B. D. G. M.; LANDGRAF, M. Microbiologia de alimentos. São Paulo:
Atheneu, p.182, 1996.
JAY, J. M. Modern food microbiology. 5.ed. Gaithersburg: Aspen Publishers, p.661,
1998.
JAY, J. M. Microbiologia de Alimentos. 6ª Edição. Porto Alegre: Atmed, 2005.
LIMA, K. S. C. et al., Cenouras minimamente processadas em embalagens com
atmosferas modificadas e tratadas com radiação gama: Avaliação microbiológica,
físico-química e química. Ciênc. Tecnol. Aliment, v. 23, nº. 2, p. 240-250, 2003.
PELCZAR Jr, M. J. et al., Microbiologia: conceitos e aplicações. São Paulo: McGraw-
Hill. ed.2.v.2. p.372-397: Microbiologia de Alimentos. 1997.

SAEKI, E. K.; MATSUMOTO, L. S. Contagem de mesófilos e psicrotróficos em

amostras de leite pasteurizado e UHT. Rev. Inst. Latic. Cândido Tostes, Nov/Dez, nº.
377, p. 29-35. 2010.

SILVA, N. et al., Manual de métodos de análise microbiológica de alimentos. São

paulo: livraria varela, p. 317. 2001.
SILVA, R. P. S. Avaliação Bacteriológica e Parasitológica em Hortaliças Minimamente
Processadas Comercializadas em Porto Alegre – RS. Universidade Federal do Rio
Grande do Sul Faculdade de Agronomia Programa de Pós-Graduação em Microbiologia
Agrícola e do Ambiente, 2006.