1.

INTRODUÇÃO

O teste de suscetibilidade a antimicrobianos representa um dos testes

de maior importância clínica realizados pelo laboratório de microbiologia.
Devido ao grande número de antimicrobianos e à complexidade dos
mecanismos de resistência desenvolvidos pelas bactérias, fica muito difícil hoje
a detecção de problemas nos testes de suscetibilidade pela simples avaliação
dos resultados obtidos. Sendo assim, é extremamente importante que haja
uma avaliação constante da qualidade destes testes. (SEJAS et al, 2003).
Atualmente, existem vários métodos para avaliar a atividade
antibacteriana e antifúngica dos extratos vegetais. Os mais conhecidos incluem
método de difusão em ágar, método de macrodiluição e microdiluição. Para
determinar a CMI ou a Concentração Mínima Bactericida (CMB) de extratos
ativos de plantas, tem-se utilizado um método sensível de microdiluição
desenvolvido por Eloff em 1998. (OSTROSKY et al, 2008).
O teste de difusão em ágar, também chamado de difusão em placas, é
um método físico, no qual um microrganismo é desafiado contra uma
substância biologicamente ativa em meio de cultura sólido e relaciona o
tamanho da zona de inibição de crescimento do microrganismo desafiado com
a concentração da substância ensaiada (PINTO et al., 2003).
O método de diluição em caldo considera a relação entre a proporção de
crescimento do microrganismo desafiado no meio líquido e a concentração da
substância ensaiada. A avaliação é comparada frente a um padrão biológico de
referência. Entende-se por proporção a densidade da turbidez provocada pelo
crescimento microbiano (Pinto et al., 2003).
A macrodiluição envolve testes em tubos de ensaio, com volume de
meio de cultura variando de 1 e 10 mL. Por ser laborioso, consumir muito
tempo, requerer muito espaço no laboratório e gerar grande quantidade de
resíduos é usado pequeno número de réplicas (BALOWS et al, 1991) (ZGODA
et al, 2001).
A microdiluição utiliza microplacas com 96 poços, com volume de meio
de cultura entre 0,1 e 0,2 mL. Eloff (1998) utilizou a técnica de diluição em
microplacas para verificar a atividade antimicrobiana em extratos vegetais e
observou inconvenientes na técnica, tais como células de alguns
microrganismos que se aderiam à base do poço, enquanto as de outros
permaneciam em suspensão. Ainda, compostos presentes em alguns extratos
precipitavam, e a coloração verde da clorofila em concentração muito alta
interferia na análise. Todavia, concluiu que o método de microplacas é barato,
tem reprodutibilidade, é 30 vezes mais sensível que outros métodos usados na
literatura. (OSTROSKY et al, 2008).
Óleos e extratos de plantas há muito tempo têm servido de base para
diversas aplicações na medicinapopular. A Melaleuca artenifolia é comumente
conhecida como (Tea Tree) florescendo em áreas de pântano. Seu óleo é extraído
da planta por hidrodestilação (destilação por arraste a vapor). (CORREA et
a.,2021).
Os Óleos Essenciais (OE) são compostos voláteis concentrados,
formados a partir de substâncias extraídas de plantas aromáticas e medicinais,
suas ações terapêuticas podem ser anti-inflamatórias e antibacterianas. Eles
são extraídos de plantas através de diferentes técnicas: arraste a vapor, na
grande maioria das vezes, prensagem do pericarpo de frutos cítricos, extração
por solventes, enfloração, fluido supercrítico e outras. (CRUZ et al, 2021).

2. OBJETIVOS

Avaliar a efetividade microbiana das substancias frente aos

microorganismos E.coli e S.aureus.

3. MATERIAL E MÉTODOS

DIFUSÃO EM AGAR
 Preparo do inóculo: Semear e incubar as bactérias (E.coli e S.aureus)
24h a 37°C em caldo BHI ou caldo Mueller Hinton.
 Desenvlvimento do ensaio: Acertar a concentração das bactérias
equivalente à escala 0.5 Mc Farland em tubos contendo caldo BHI. Diluir 1:10
as suspensões das bactérias (10 6 UFC/ml). Manter em banho de gelo até o
momento do uso.
 Preparar as amostras (tinturas, óleos ou extratos) nas diluições
definidas.
 Tintura e Óleos: Puro, 1:1 e 1:2. Os óleos devem ser previamente
diluídos em Twenn 80 10%. Esta será considerada a amostra: Puro. A partir
desta diluir 1:1 e 1:2 em caldo BHI.
 Extratos vegetais: concentrações de 1000, 250, 50 e 12,5 ug/ml
preparado em caldo BHI ou MH.
 Embeber os discos de papel nas amostras a serem testadas (volume
20uL)
 Espalhar as bactérias padronizadas sobre as placas contendo agar
Mueller Hinton com auxilio de um swab. Aguardar 10 minutos.
 Distribuir os discos sobre a superficie das placas já contendo o inóculo
bacteriano (máximo de 8 discos por placa).
 Fazer controles: de meio (só meio de cultura); controle da amostra (meio
de cultura+amostra); ampicilina (50 ug/ml) e dos solventes (Tween 80 10%).
 Deixar as placas em temperatura ambiente por 2 horas e depois incubar
por 24h a 37°C.
 Leitura do teste: Medir o diâmetro do halo de inibição de crescimento
bacteriano.

MIC EM TUBOS
 Preparo do inóculo: Semear e incubar as bactérias (E.coli e S.aureus)
24h a 37°C em caldo BHI ou caldo Mueller Hinton.
 Desenvolvimento do ensaio: Acertar a concentração das bactérias
equivalente à escala 0,5 Mc Farland em tubos contendo calco BHI (10 8
UFC/ml). Manter em banho de gelo até o momento do uso.
 Preparar as amostras (óleos, extratos vegetais e substância isolada) nas
diluições definidas.
Óleos: os óleos devem ser previamente diluidos em DMSO 10%. Esta será
considerada a amostra: Puro
Extratos vegetais: preparar uma solução à concentração de 40000 ug/ml
preparado em caldo BHI ou MH com DMSO 10%.
Substância isolada: Pura.
 Preparar uma bactéria de tubos (+- 30 tubos)
 Acrescentar em todos 1 mL de calco BHI (800ul de caldo + 200ul de
bactéria) (0,5x106 UFC/ml)
No 1°tubo acrescentar 1ml da suspensão de extrato ou óleo ou
subtância pura. (na lousa).
 Fazer os controles: do meio de cultura (só meio); de crescimento
bacteriano (meio+bactérias); controle da amostra (meio de cultura + amostra);
controle dos solventes (meio + Tween 80 10% + bactéria) e controle positivo
(meio+ampicilina*+bactéria) (*lousa)
 Incubar 24h a 37°C.
 Leitura do teste: observar turvação ou ausência de turvação.
 MBC: estriar com alça microbiológica o contéudo de cada tubo para
placas com Mueller Hinton. Incubar 24h a 37°C.
 Leitura MBC: observar crescimento nas placas de MH.

MIC EM MICROPLACAS
 Preparo do inóculo: Semear e incubar as bactérias (E.coli e S.aureus)
24h a 37°C.
 Desenvolvimento do ensaio: Acertar a concentração das bactérias
equivalente à escala 0,5 Mc Farland em tubos contendo calco BHI (10 8
UFC/ml). Manter em banho de gelo até o momento do uso.
 Preparar as amostras (óleos, extratos vegetais e substância isolada).
Óleos: os óleos devem ser previamente diluidos em DMSO 10 + TWEEN. Esta
será considerada a amostra: Puro
Extratos vegetais: preparar uma solução à concentração de 40000 ug/ml
preparado em caldo BHI ou MH com DMSO 10% OU TWEEN 80.
Substância isolada: Pura (50ul de geraniol + 50 ul de caldo)
 Preparo do antimicrobiano
Será utilizada a ampicilina que está a concentração de 500 ug/ml. No 1°
poço acrescentar 80ul da amp de 500ug/ml. Homogeneizar e proceder a
diluição seriada. Na microplaca será testada ás concentrações de 100,
50, 25, 12,5 e assim por diante até 0,78ug/ml (8 poços).
Realização do Teste
Aos orificios da microplaca (96 orificios) adiciona-se 80uL de CMH.
 No primeiro orificio adiciona-se 100ul da solução de extrato vegetal à
concentração de 40000 ug/ml (usar 10uL de extrato + 90uL de caldo),
homogeinizar e fazer dilução seriada (8 orificios). As concentrações
finais dos extratos serão portando: 1000; 500; 250; 125; 62,5; 31,2; 15,6;
7,8ug/mL.
O óleos serão utilizados puro (diluídos em Twee 80 a 10% ou DMSO
10%), no 1° orificio 50% e sucessivamente 25%, 12,5%, 6,25%, 3,12%,
1,56%, 0,78% e 0,39%.
A substância pura (preparada a 50%0 no 1°poço ficará a 25%
sucessivamente 25%, 12,5%, 6,25%, 3,12%, 1,56%, 0,78% e 0,39%.
Adicionar 20ul no inoulo em cada orificio exceto no orificio do controle do
extrato.
 Fazer os controles:
Do extrato: 80uL de CMH + 100uL de extrato a 2000ug/L
Da bactéria: 80uL de CMH + 20uL de inóculo
Do antibiótico: 80uL de CMH + 100uL de antimicrobiano + 20uL de inóculo
Do meio de cultura: em orificio colocar 100uL de CMH.
Do solvente: Tween 80 a 10% (para óleos) incubar 24h a 37°C.
 Leitura do teste:
Ápos incubação a micrplaca será submetida à análise visual.
Revelação com resazurina*: adicionar 30uL de resazurina a 100ug/mL em cada
orificio da microplaca. A leitura é realizada em até 2 horas de incubação a
temperatura ambiente.
 MBC:
Estriar com alça microbiológica o conteúdo de cada tubo para placas
com Mueller Hinton. Antes de colocar a resazurina*.
Incubar 24h a 37°C
 Leitura MBC: observar crescimento nas placas de MH.

4. RESULTADOS E DISCUSÕES

Difusão Agar
MIC em tubos
MIC em microplacas

5. REFERÊNCIA

CORREA.L.T, NICOLETTI.M.A, DE AMORIM.C.S, DA COSTA.A.R,

LEONI.L.A.B, MUNOZ.J.W.P, FUKUSHIMA, A.R. Atividade antimicrobiana do
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2020. DOI 10.32712/2446-4775.2020.818
CRUZ.T.S, PAIXAO.J.A. Aplicação de Óleo Essencial de Melaleuca alternifolia
(TEA TREE) no tratamento da acne vulgar. Universidade Salvador (UNIFACS),
Salvador-BA. 2021. Revista Acervo+.

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OSTROSKY.E, MIZUMOTO.M.K, LIMA.M.E.L, KANEKO.T.M,

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PINTO.T.J.A, KANEKO.T.M.OHARA.M.T. Controle Biológico de Qualidade de

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Atheneu Editora, 325p. 2003.

ZGODA.J.R, PORTER.J.R. A convenient microdilution method for screening

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BALOWS A, HAUSLER JR.W.J, HERRMANN.K.L, ISENBERG.H.D. Manual of

Clinical Microbiology. 1991 https://doi.org/10.1590/S0036-46651991000600014