PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM ENGENHARIA DE

ALIMENTOS
Microbiologia Industrial

COMPOSIO QUMICA, EFEITO DE CITOTOXICIDADE E

ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO LEO ESSENCIAL DE
ALFARROBA (Ceratonia siliqua) CONTRA A Listeria INOCULADOS
NA CARNE BOVINA PICADA

Objetivos

Determinar a atividade antimicrobiana do leo essencial de

vagens de alfarroba, relacionando com a sua composio
qumica;

Avaliar as atividades citotxicas utilizando o ensaio MTT;

Testar o efeito antibacteriano do leo essencial de alfarroba

contra a bactria Listeria monocytogenes em carne bovina
moda durante o armazenamento refrigerado.

Material e Mtodos
2.1 Material vegetal

Vagens frescas de alfarroba foram coletadas

em Mahdia, Tunsia.

Trituradas para obteno

de p fino

Material e Mtodos
2.2 Extrao do leo essencial
1 kg de vagens de alfarroba em p
Destilao vapor (Clevenger - 3h)
Extrao com diclorometano (3x50mL)
Secagem com sulfato de sdio anidro
Evaporao em rotaevaporador
(rendimento 2,5g)
Armazenagem a 4C

Material e Mtodos
Anlise cromatogrfica

Solubilizao em n-hexano;

Anlise realizada em cromatgrafo gasoso GCMS HP 6980

ndice de Kovats

Calculado utilizando uma srie de C10-C22nalcanos como referncia

Material e Mtodos
2.4 Atividade antimicrobiana
Os microrganismos foram obtidos de cepas ATCC e cepas
locais do Centro Sfax;
GRAM-NEGATIVAS:
GRAM-POSITIVAS:
Salmonella enterica (sorotipo)
Bacillus subtilis ATCC 6633
Bacillus cereus ATCC 14579
S. aureus ATCC 25923 e ATCC 6536
Enterococcus faecalis ATCC 29212
Micrococcus luteus ATCC 1880
L. monocytogenes Sfax 2132

Salmonella enteritidis
E. coli ATCC 25922 e ATCC 8739
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027
Klebsiella pneumoniae ATCC 10031

Material e Mtodos
2.4.1 Preparo dos microrganismos
Os microrganismos foram obtidos de cepas ATCC e cepas
locais do Centro Sfax;
1 ala de cada bactria
em 3mL do gar
GRAM-NEGATIVAS:
GRAM-POSITIVAS:Muller-Hinton (MH).
Salmonella enterica (sorotipo)

Incubao
Salmonella enteritidis
Bacillus cereus ATCC 14579 37 C por 12h
E. coli ATCC 25922 e ATCC 8739
a 30 Pseudomonas
C por 12haeruginosa ATCC 9027
S. aureus ATCC 25923Bacillus
e ATCC 6536
Bacillus subtilis ATCC 6633

Enterococcus faecalis ATCC 29212

Micrococcus luteus ATCC 1880
L. monocytogenes Sfax 2132

Klebsiella pneumoniae ATCC 10031

Material e Mtodos
2.4.1 Preparo dos microrganismos
Os microrganismos foram obtidos de cepas ATCC e cepas
FUNGOS:
locais
do Centro Sfax;
Aspergillus niger CTM 10099

GRAM-NEGATIVAS:

Aspergillus flavus (isolado de alimentos)

GRAM-POSITIVAS:

Aspergillus nidulans (isolado de alimentos)

Salmonella enterica (sorotipo)
fumigatus
BacillusAspergillus
subtilis ATCC
6633 (isolado de alimentos)
Salmonella enteritidis
graminearum
BacillusFusarium
cereus ATCC
14579 ISPAVE 271
E. coli ATCC 25922 e ATCC 8739
Fusarium
oxysporum
S. aureus
ATCC 25923
e ATCCCTM10402
6536
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027
Fusarium
culmorum
Enterococcus
faecalis
ATCCISPAVE
29212 21w
Klebsiella pneumoniae ATCC 10031
Alternaria
alternata
CTM 10230
Micrococcus
luteus
ATCC 1880
L. monocytogenes Sfax 2132

Material e Mtodos
2.4.1 Preparo dos microrganismos
FUNGOS:

Suspenses de esporos coletados com

Aspergillus niger CTM 10099

Aspergillus
(isolado deem
alimentos)
ala eflavus
suspensos
10 ml

de PDA.

Aspergillus nidulans (isolado de alimentos)

Logo
aps, agitados em vortex por 15-20 min.
Aspergillus fumigatus (isolado de alimentos)
Fusarium graminearum
ISPAVE 271
Incubao
a 28C.
Fusarium oxysporum CTM10402
Fusarium culmorum ISPAVE 21w
Alternaria alternata CTM 10230

Material e Mtodos
2.4.2 Mtodo de difuso em gar
A atividade microbiana foi realizada pelo mtodo de Gven, et al., (2006).
1. 15ml do meio de cultivo foram espalhados na
placa de Petri.

2. Preparou-se uma suspenso de clulas e 10l foi

espalhado em cada placa.

3. Poos de 6 mm foram perfurados no gar com

uma pipeta de Pasteur estril.

Material e Mtodos
2.4.2 Mtodo de difuso em gar
4. O leo essencial (OE) foi dissolvido em dimetilsulfxido/gua (1/9) para uma
concentrao final de 10 mg/ml e em seguida filtrou-se em filtro Millipore de 0,22 m.

5. Colocou-se 50 l do OE nos poos e as placas foram incubadas a 37 C durante

24h para bactrias e 72h para fungos a 28 C.

6. Controle positivo: Gentamicina (10 g/poo) para bactrias, Anfotericina B (20

g/poo) para fungos.

7. Controle negativo: 10% de DMSO, que utilizado para dissolver o CsEO.

Material e Mtodos
2.4.3 Determinao de MIC e MFC
As concentraes inibitrias mnimas (MICs) foram determinadas CsEO de acordo com Gulluce et al., (2007)
O teste foi realizado em estril microplacas de 96 poos com um volume final em eachmicroplate poo de 100 ul. Para os testes de
susceptibilidade, 100 ul de caldo de Mueller-Hinton ou caldo de dextrose de batata foi distribuda a partir da segunda para os poos de teste
XII. Uma soluo de estoque de o leo essencial foi preparada por dissoluo de 100 uL de leo em dimetil sulfxido e ento ajustado para
uma concentrao final de 50 mg / ml de caldo byMueller-Hinton. O firstwell da microplaca foi preparado por dispensa de 160 ul do meio de
crescimento e 40 ul de o leo essencial para atingir uma concentrao final de 10 mg / ml e em seguida 100 ul de diluies escalares foram
transferidos a partir da segunda nona bem. Da em diante e a partir de cada cavidade, 10 ul da suspenso foi removida e substituda por as
suspenses bacterianas a concentraes finais de inoculo de 106 CFU / ml de bactrias e 105 esporos / ml para fungos. As concentraes de
extractos finais adoptadas para avaliar a atividade antimicrobiana eram 0,039 a 10 mg / ml. O dcimo poo foi considerado como controlo
positivo crescimento containingMueller-Hintonmedia para estirpes bacterianas enquanto caldo de dextrose de batata (PDB) foi utilizado para
fungos, uma vez que no h solutionwas leo essencial adicionado. Anotherwell contendo 10% de dimetilsulf xido (v / v), sem CsEO, foi
utilizado como negativo ao controle. As placas foram ento cobertas com as tampas de placas estreis e incubados a 37 Cfor 24 h para as
estirpes bacterianas para fungos and72 h a 28 C. TheMIC foi definida como a menor concentrao do leo essencial total a que o
microorganismo no demonstra o crescimento visvel aps a incubao. Como um indicador do crescimento de microorganismos, 25 ul de
cido 3- (4,5-Dimetil-2-tiazolil) -2,5-difenil-2H-tetrazlio (MTT) (0,5 mg / ml) dissolvido em gua estril foram adicionados aos poos e incubouse a 37 C durante 30 min (Eloff, 1998) growthwas .Wheremicrobial inibida, a soluo no poo permaneceu lmpida aps incubao com MTT.
Theminimum concentraes fungicidas (MFCs) foram determinados por subcultura em srie de 10 ul em Agar de Dextrose de Batata (PDA) e
as placas foram incubadas durante 72 h a 28 C. Os menores concentrationwith no visveis growthwas definido como theMFC,
indicating99.5% assassinato do inculo inicial. DMSO foi usado como um controlo negativo. As determinaes de valores de CIM e MFC
foram feitas em triplicado.

Material e Mtodos
2.4.4 Efeito do leo essencial na contagem de
bactrias viveis de Listeria monocytogenes
Avaliado atravs da contagem de bactrias viveis em soluo salina aps a adio do
leo essencial de acordo com a mtodo de Kawakami et al., (2006).

Inoculao de tubos com 108 UFC/mL de L. monocytogenes

3 concentraes de OE - 2,5, 5 e 7,5 mg/mL
Volume final de 5mL com soluo salina

Incubao 37C

Material e Mtodos
2.4.4 Efeito do leo essencial na contagem de bactrias viveis
de Listeria monocytogenes
Determinao das clulas viveis residuais:

Mtodo Tcnica do teor de germes

1. 100 l de cada amostra foram removidos nos tempos 0, 10, 20, 30,
50 e 60 min
2. Diluio em 0,9 ml de soluo salina, uma diluio de 10 vezes
3. Semeadura em gar de Mueller-Hinton (Oxoid Ltd, Reino Unido).
4. Contagem de colnias aps 24h de incubao a 37C.
5. Controle Sem adio do leo essencial

Material e Mtodos
2.4.5 Efeito in situ do leo essencial
A eficcia in situ do CsEO foi avaliada contra L.monocytogenes em carne picada modelo de carne de acordo com o procedimento descrito por
Careaga et al., (2003) com ligeiras modificaes. Resumidamente, uma cultura fresca de trabalho de L. monocytogenes que contm cerca de 106
CFU / ml foi preparada por suspenso de 3-5 colnias isoladas em 10 mL de
Caldo de Mueller-Hinton e foi cultivada durante a noite a 37 C durante 24 h, para se atingir a fase estacionria. Recm ps-rigor msculos carne
magra foram obtidos a partir de um matadouro em Sfax-Tunsia e transportado para o laboratrio em caixas de isopor isolados em gelo dentro de 1 h
do processo de corte. Um animal saudvel e recm-abatidos tem seu msculo estril (Gill, 1979). A fim de reduzir o nmero de microrganismos
aderentes superfcie de carne de msculo, cada pea foi imersa em gua a ferver durante 5 min. A superfcie do msculo cozido foi eliminado com
facas estreis sob condies asspticas. Os pedaos de carne preparados como descrito acima foram picados num moinho de estril, e pores de
25 0,1 g, foram colocados em sacos. Metade das amostras de carne foram inoculados com 2 x 102 CFU de Listeria monocytogenes/g de carne e
misturados de forma homognea durante 3 minutos temperatura ambiente para garantir a distribuio adequada do agente patognico. Antes da
inoculao da segunda metade da carne, o CsEO foi dissolvido em DMSO a 10%, filtrou-se atravs de 0,22 um do tamanho de poros de filtros de
policarbonato preto (Millipore) e foi ento adicionado s concentraes finais de 0,1, 0,2 e 0,4 mg de CsEO / g de carne e misturada para distribuir
uniformemente os microorganismos. Todos os sacos que contm as amostras de carne foram armazenados a 7 C e examinadas a 0, 2, 4, 6, 8 e 10
dias de armazenamento para enumerao de L. monocytogenes. Aps intervalos de tempo predeterminados, a L. monocytogenes isolamento foi
feito atravs da remoo das peas assepticamente e misturando-se com 250 ml de caldo de Muller-Hinton. As amostras foram homogeneizadas
durante 1 min, e incubou-se a 37 C durante 6 h. A partir deste pr-enriquecimento (para a reanimao de possveis clulas vivas feridos), os
restantes L. monocytogenes foi determinado pela tcnica da placa de contagem de colnias. Depois de 10 vezes em srie da tcnica da diluio
com soluo salina fisiolgica, 100 ul de cada amostra foram espalhados sobre as superfcies do meio de agar Muller Hinton seguido de incubao a
37 C durante 24 h. gua salina estril foi adicionado no controlo no tratado em vez de CsEO, inoculado com as bactrias de teste e armazenado
sob as mesmas condies que as outras amostras. Trs repeties individuais de cada experincia foram realizadas, em todos os casos.

Material e Mtodos
2.5 Citotoxidade
2.5.1. As linhas de clulas e condies de cultura
HeLa - linha de cancro cervical
MCF-7 - linha celular de cancro da mama e clulas endoteliais da veia umbilical
humana (HUVEC).
As clulas foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Gibco) suplementado com 10% de soro
fetal de vitelo (FCS) e 2 mM de L-glutamina em frascos de cultura de tecidos (Nunc).
Incubao duas vezes por semana e mantidos a 37 C numa atmosfera de 95% de ar e
5% de CO2.

Material e Mtodos
2.5 Citotoxidade
2.5.2. Teste MTT
As taxas de proliferao de clulas HeLa e clulas MCF-7 aps treatmentwith OE foram determinados pelo mtodo colorimtrico de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil (MTT)
(Mosmann, 1983). O compound MTT amarelo reduzida por desidrogenases mitocondriais para o azul de formazano composto insolvel em gua, dependendo da
viabilidade das clulas. Resumidamente, clulas HeLa e clulas MCF-7 foram cultivadas em linha de meio RPMI 1640 suplementado com 10% FCS e 2 mM de Lgluthamine.
As clulas HeLa e MCF-7 foram diludas em meio de crescimento de cultura fresco a uma densidade de clulas de 25 104 clulas / ml. Depois disso, um total de 5 104
clulas foram plaqueadas por cavidade em 96 microplacas com diferentes concentraes de CsEO variam de 8 a 1000 ug / ml dissolvido em DMSO. A concentrao final de
DMSO no meio de cultura foi inferior a 10%. Esta concentrao no tem qualquer efeito citotxico e no causou qualquer interferncia com o mtodo de deteco
colorimtrico (dados no mostrados). Para avaliar a sobrevivncia de clulas aps 72 h, 20 ul de soluo de MTT (5 mg / ml) foi adicionado a cada poo e incubados durante
4 h a 37 C numa incubadora de CO2-. Em seguida, 180 ul de meio foi removido de todos os poos, sem perturbar os aglomerados de clulas e foi substitudo por 180 ul
metanol / DMSO (1: 1; v / v), para dissolver quaisquer cristais formados formazon.
Dois controles foram negativo usedwhich so celulas sem qualquer tratamento (meio de cultura + clulas) e clulas com DMSO (clulas culturemedium + + DMSO). Os
densitywas pticos avaliados em 570 nm usando um leitor de microplacas (ELX 800). Todos os testes e anlises foram realizadas em triplicado e mdia. A percentagem de
viabilidade foi determinada tal como foi formulado abaixo:

A IC50 (a concentrao de droga que reduz em 50% a absorvncia em clulas tratadas, em relao s clulas no tratadas) valor foi calculado a partir das curvas geradas
representando graficamente a percentagem da citotoxicidade contra as concentraes testadas.

Material e Mtodos
2.6 Anlise estatstica
Os resultados experimentais relativos a este estudo expressos em
mdia desvio padro das triplicatas.

A significncia da diferena foi calculada pelo teste t de Student e os

valores foram p<0.05 considerados significativos.

Resultados e Discusso
3.1 Composio qumica do OE
25 componentes foram identificados

Resultados e Discusso
3.2 Atividade antibacteriana
- Vrios graus
antibacteriana.

de

atividade

- As zonas de inibio ficaram entre

09 a 25mm.
- Valores de MIC:
Gram-positivas: 0,6-2,5 mg/ml
Gram-negativas: 1,2-2,5 mg/ml
ALTAMENTE ATIVO CONTRA
- B. cereus ATCC 14579
- B. subtilis ATCC 6633
- S. epidermis ATCC 12228
- K. pneumoniae ATCC 10031
- E. coli ATCC 25922 e 8739
- Salmonella enteritidis
- L.monocytogenes

Resultados e Discusso
3.3 Atividade antifngica
Os resultados mostraram um forte efeito inibidor.
Concentraes mnimas de OE:
- F. graminearum: 156 g/ml
- F. culmorum: 78 g/ml
- A. flavus: 625 g/ml
- A. nidulans: 78 g/ml
As maiores inibies se
mostraram em fungos
deterioradores de alimentos.

Resultados e Discusso
Motivos para a alta atividade antimicrobiana do OE de alfarroba:
1. Grande quantidade de hidrocarbonetos (51,06%), monoterpeno (C10H16 0,9%) e
monoterpeno oxigenado (1,19%) capacidade antimicrobiana.

2. Alguns constituintes do OE de menor percentual (cnfora e limoneno) tambm tem

potencial alto de atividade antimicrobiana (Dorman e Deans, 2000).

O leo essencial das vagens de alfarroba (C.siliqua) PODE ser

considerado como um conservante natural contra microrganismos
patognicos e deterioradores, possibilitando a sua utilizao na
indstria de alimentos.

Resultados e Discusso
3.4 Efeito do OE em Listeria monocytogenes

Concentraes
2,5 e 5 mg/mL bacteriosttica
7,5 mg/mL bactericida

Resultados e Discusso
3.4 Efeito do OE em Listeria monocytogenes
Estudo in vivo:
- Diminuio gradual na contagem
de colnias.
- Adio de 0,1 mg xido de etileno
para cada grama de carne reduziu
para 2 UFC/mL em 6 dias.
- Nas concentraes 0,2 e 0,4 mg/g,
no h mais clulas viveis em 2 e 4
dias, respectivamente.

A partir do estudo, o leo

essencial de alfarroba pode ser
utilizado como conservante em
produtos crneos.

Resultados e Discusso
3.5 Efeito citotxico estudo em clulas HeLa e MCF-7
A inibio foi considerada significativamente
mais fortes (p<0,05) em:
- HeLa com IC50: 210 g/ml 54,9%
- MCF-7: 800 g/ml 35,04%
- HUVEC: 250 g/ml 13,82%

O OE de alfarroba apresenta MENOR

toxicidade para clulas humanas nocancerosas e potencial de seletividade
para linhas celulares de cancro.

Concluso
- Primeiro estudo detalhado sobre as caractersticas antibacterianas, antifngicas e
citotoxicidade do leo essencial de alfarroba.
- A aplicao in vivo do OE verificou-se ser eficaz no controle de L. monocytogenes em
carne moda.
- Os dados apresentados no estudo demonstraram que o OE de alfarroba eficaz na
supresso do crescimento de duas linhas celulares de cancro humano HeLa e MCF-7.
- Sugere-se que o CsEO exibiu um efeito bioprotetor, e, por conseguinte, ele poderia ser
utilizado na biotecnologia como ingrediente conservante natural dos alimentos e/ou
indstrias farmacuticas.