AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA

IN VITRO DO ALHO (ALLIUM SATIVUM) IN NATURA

Helena Luisa de Arruda Milani1
Adriana Xavier Viana Teixeira2
Elizabeth Cardoso de Sousa3
Valdemir Aparecido de Abreu4
Maria Fernanda Melo Lopes Ninahuaman5

Resumo: O alho é pesquisado devido à sua rica composição, eficaz no

tratamento de diversas patologias com ações antineoplásica, antimicro-
biana, antifúngica e anti-helmíntica. O objetivo deste estudo foi avaliar
a atividade antimicrobiana in vitro, do extrato fresco dos bulbos de alho
(Allium sativum L.), frente a cepas de bactérias Staphylococcus aureus,
Escherichia coli e do fungo Candida albicans. Foi usado o método da

1
 Graduada em Ciências Biológicas pelo Centro Universitário Adventista de São Paulo (Unasp-SP).
E-mail: helena.a.amilani@hotmail.com.
2
 Graduada em Ciências Biológicas pelo Centro Universitário Adventista de São Paulo (Unasp-SP).
E-mail: adrixviana@gmail.com.
3
  Graduada em Ciências Biológicas pelo Centro Universitário Adventista de São Paulo (Unasp-SP).
E-mail: elizabethcardosos22@gmail.com.
4
  Doutor e mestre em Farmacologia pela Universidade Estadual de Campinas. Graduado em Ciências Biológicas
pela Universidade Guarulhos. E-mail: valdemir.abreu@unasp.edu.br.
5
  Mestre em Farmacologia pela Universidade Federal de São Paulo. Graduado em Farmácia pela Universidade
Federal do Rio de Janeiro. Pesquisador do laboratório de investigação em saúde e professora do Centro Universi-
tário Adventista de São Paulo (Unasp-SP). E-mail: maria.ninahuaman@unasp.edu.br.
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difusão em ágar pela técnica do disco e técnica do poço com 20 µL e

100 µL de extrato fresco de Allium sativum, respectivamente. O extrato
fresco foi obtido através de maceração e espremido com a ajuda de gaze.
Foram usadas cepas padronizadas de Staphylococcus aureus ATCC#
6538, Escherichia coli ATCC# 8739 e Candida albicans ATCC# 10231.
Como controle negativo, utilizou-se disco em branco e, como positivo,
discos comerciais contendo penicilina G 10 UI, amicacina 30 µg e mi-
conazol 50 µg. Nos testes pelo método de difusão em Agar, a medida do
diâmetro do halo de inibição variou entre 20 a 70 mm e o extrato fresco
de alho mostrou considerável ação antimicrobiana (p<0,001), especial-
mente frente à cândida e ao estafilococo, nas maiores concentrações.
Conclui-se que o extrato fresco de Allium sativum, in vitro, apresenta
atividade antimicrobiana em ambas as técnicas frente aos microrganis-
mos testados.
48

Palavras-chave: Allium sativum; Atividade antimicrobiana; Extrato fresco.

Abstract: Garlic has been the subject of much research because of their rich
composition making it effective in the treatment of several pathologies by
anticancer, antimicrobial, antifungal and anthelmintic actions. The aim of
this study was to evaluate the antimicrobial activity, in vitro, of fresh garlic
bulbs extract (Allium sativum L.) against bacterial strains Staphylococcus
aureus, Escherichia coli and fungi Candida albicans. It was used the me-
thod agar diffusion by technique hard and well technique with 20 µL and
100 µL of fresh extract of Allium sativum, respectively. The fresh extract was
obtained by maceration and squeezing with a gauze. We used standardized
strains of Staphylococcus aureus ATCC # 6538, Escherichia coli ATCC #
8739 and Candida albicans ATCC #10231. It was used blank disc as negative

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control and commercial discs containing antimicrobials: penicillin G 10 UI,

amikacin 30 µg and miconazole 50 µg as positive control. In tests by the
agar diffusion method, measuring the diameter of inhibition zone ranged
from 20 to 70 mm and fresh garlic extract showed significant antimicrobial
activity (p<0,001), especially against the Staphylococcus and Candida at
the highest concentrations. We conclude that the extract of fresh Allium
sativum, in vitro, showed antimicrobial activity in both techniques against
the tested microorganisms.

Keywords: Allium sativum; Antimicrobial activity; Fresh extract.

A fitoterapia é tão antiga quanto a história do ser humano. Sua cita-

ção mais antiga é encontrada no documento Rhizotomika, em que Diocles,
um dos discípulos de Aristóteles, descreve com detalhes os efeitos fisioló-
49
gicos das plantas medicinais (ELDIN; DUNFORD, 2001). Em países em
desenvolvimento, a extração das drogas ainda é feita, muitas vezes, de
forma caseira, sem controle das doses ou da observação de contraindica-
ções ou até mesmo de efeitos colaterais (MATSUDA; NEGRAES, 2002).
No Brasil, o uso de plantas medicinais passa de geração à geração,
baseando-se na prática indígena, influenciada pelas culturas africana e
portuguesa (MACEDO, 2004; ALMEIDA, 2011). Desde a implantação do
Sistema Único de Saúde (SUS), na década de 1980, o governo estimula o
uso dos recursos naturais para a promoção da saúde através de tecnolo-
gias eficazes, visando a integração do ser humano com o meio ambiente e
a sociedade (BRASIL, 2001).
O alho é alvo de muitas pesquisas devido à sua rica composição,
tornando-o eficaz no tratamento de diversas patologias como, por
exemplo: doenças endócrinas, cardiovasculares; ele ainda age como

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antineoplásico, antimicrobiano, antifúngico e anti-helmíntico. Sua alta

concentração de zinco, selênio e outras substâncias favorecem o au-
mento da produção de células do sistema humoral, melhorando assim o
sistema imune (QUINTAES, 2001; KATZUNG et al., 2003).
Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade antimicro-
biana, in vitro, pelo método de difusão em Agar — Técnica do poço e
técnica do disco, do extrato fresco de Allium sativum L. frente às bactérias
Staphylococcus aureus ATCC # 6538, Escherichia coli ATCC # 8739 e ao
fungo Candida albicans ATCC # 10231.

Método

Para obtenção do extrato fresco, utilizou-se 15 bulbos de Allium sati-

vum, adquiridos no supermercado. O bulbo do alho foi prensado com au-
50
xílio de um espremedor, e a massa obtida foi colocada em um almofariz e
macerada com o auxílio de um pistilo. Gaze estéril foi utilizada para espre-
mer a massa dentro de um béquer, para obtenção do extrato bruto.
Além disso, utilizou-se cepas de bactérias Gram – positivas Sta-
phylococcus aureus ATCC #6538, Gram-negativas Escherichia coli
ATCC#8739 e também fungos Candida albicans ATCC#10231, padrão
ATCC (American Type Culture Collection), fornecidas pelo laboratório
Controlbio Assessoria Técnica e Microbiológica S/S Ltda., por serem as
mais comuns no organismo humano.
Foram preparados 500 mL de Agar Mueller Hinton e 300 mL de
Meio Agar Sabouraud Dextrosado, conforme especificação do fabri-
cante (Becton Dickinson e CO. Sparks). Adicionou-se 25 mL do meio
em placas de Petri descartáveis 90x15 mm e 100mL em placas de
150x15mm ambas adquiridas no Laboratório J. Prolab. O procedimento

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foi realizado em câmara de fluxo laminar (Trox Technik). Os inóculos

bacterianos foram fornecidos pelo laboratório Controlbio Assessoria
Técnica Microbiológica S/S Ltda., com a turvação correspondente a 0,5
na escala McFarland (equivalente a 1,5x10 8 UFC/mL), para bactérias e
de 1,0 na escala de McFarland (equivalente a 3,0x10 8 UFC/mL), para
leveduras. Essa concentração foi alcançada por meio do densitômetro
Densimat-Biomerieux.
Para o método de difusão em Ágar - Técnica do Disco e do Poço
(GROVE; RANDALL, 1955), as placas contendo Agar Mueller Hinton e
Sabouraud Dextrosado, preparadas antecipadamente, foram deixadas
em repouso para atingir a temperatura ambiente. Flambou-se a boca
de um tubo de ensaio de 10mm de diâmetro e preparou-se o poço no
Agar, um por placa.
O inóculo microbiano foi, então, distribuído uniformemente sobre a
51
superfície do Agar, utilizando um swab estéril. As placas permaneceram
em repouso, na temperatura ambiente, até que a solução fosse absorvida
pelo Agar (aproximadamente 5 minutos). Nos respectivos poços foram dis-
pensados 100µL do extrato fresco de alho utilizando micropipeta.
Para o método de difusão Ágar - Técnica do Disco e do Poço (BAUER
et al., 1966; NCCLS, 1997), utilizou-se discos de papel secos, esterilizado
por radiação gama, sem impregnação, medindo 6 mm de diâmetro, forne-
cido pelo Laboratório CECON (São Paulo). Distribuiu-se 5 discos, em uma
placa de Petri esterilizada, previamente identificada. Pipetou-se sobre os
discos 20µL do extrato fresco de alho com o auxílio de uma micropipeta.
Os discos ficaram em repouso em temperatura ambiente até o extrato ser
absorvido completamente.
Placas contendo Agar Mueller Hinton e Saboraud Dextrosado,
preparadas antecipadamente, foram deixadas em repouso até atingir a

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temperatura ambiente e o inóculo foi distribuído uniformemente sobre a

superfície do Agar, com swabs estéreis. Utilizando-se uma pinça esteri-
lizada, distribuiu-se os discos impregnados com o extrato fresco de alho,
um disco seco (controle negativo) e um disco contendo o antimicrobiano.
Os antimicrobianos utilizados foram: penicilina G (10 UI) para bacté-
rias Gram-positivas, amicacina (30µg) para Gram-negativas e miconazol
(50µg) para leveduras (CECON, São Paulo).
Os procedimentos foram realizados dentro da capela de fluxo la-
minar. As placas foram deixadas durante 30 minutos à temperatura
ambiente para absorção do extrato fresco e, em seguida, incubadas em
estufa a 37°C durante 48 horas. Ao final do período de incubação, foi
observada a formação do halo de inibição do crescimento bacteriano
e fúngico, medido em milímetros, utilizando-se régua milimetrada. A
análise dos dados foi feita pela medida do diâmetro das zonas de inibi-
52
ção (halo), formadas pela amostra e pelo padrão. Os testes foram rea-
lizados em quintuplicata e os resultados expressos em mm pela média
aritmética do diâmetro do halo de inibição, formado ao redor dos dis-
cos e poços nas repetições. Os resultados foram expressos como média
(M) ± erro padrão (SEM) de média, e a significância avaliada pela análi-
se de variância ANOVA (GraphPad Prism 5) seguida pelo teste de Tukey,
considerando p < 0,05 como diferença significativa.

Resultados

Os resultados obtidos da ação do extrato fresco de alho in natura

(Allium sativum L.), após a realização dos testes de Difusão em Ágar - Téc-
nica do Disco e do Poço, apresentaram halos de inibição (mm), formados
ao redor dos discos impregnados com 20 µL e dos poços, nos quais foram

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depositados 100 µL do extrato fresco de Allium sativum L. A medida do

diâmetro do halo de inibição variou entre 20 a 70 mm. Com relação a
Staphylococcus aureus ATCC #6538, os halos de inibição obtidos para
Penicilina G 10UI e Extrato fresco de alho (20mL) e (100mL) foram res-
pectivamente 48,0 ± 0,01; 20,0 ± 0,0 e 63,3 ± 2,7 ***. Para Escherichia coli
ATCC #8739, os halos de inibição obtidos para Amicacina 30μg e Extrato
fresco de alho (20mL) e (100mL) foram respectivamente 28,0 ± 0,02; 28,0
± 0,0 e 34,4 ± 0,2***. Para Candida albicans ATCC #10231, os halos de
inibição obtidos para Miconazol 50μg e Extrato fresco de alho (20mL)
e (100mL) foram respectivamente 60,0 ± 0,03; 60,0 ± 0,0 e 70,0 ± 0,0***,
conforme mostrado na Tabela 1 e Figura 1.

53
Tabela 1 - Diâmetros dos halos de inibição de crescimento bacteriano de 20 µl e 100 µl de
extrato fresco de Allium sativum L., pelo Método de Difusão em Agar — Técnica do Disco
e do Poço respectivamente.

Média* ± SEM do halo de inibição (mm)

Controle (n=5) Extrato fresco de Allium sativum (n=5)

Microrganismos 20 µl (disco) 100 µl (poço)
Staphylococcus aureus / ATCC
48,0 ± 0,01 20,0 ± 0,0 63,3 ± 2,7 ***
#6538

Escherichia coli /ATCC #8739 28,0 ± 0,02 28,0 ± 0,0 34,4 ± 0,2***

Candida albicans /ATCC #10231 60,0 ± 0,03 60,0 ± 0,0 70,0 ± 0,0***

Controle de antimicrobianos: 1) Penicilina G 10UI; 2) Amicacina 30μg, 3) Miconazol 50μg. ANOVA

(teste Tukey) (***) estatisticamente significativo frente ao do controle positivo p<0,001.

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S. aureus E. coli C. albicans

Figura 1 - Diâmetro dos halos de inibição de crescimento de Staphylococcus aureus ATCC #6538,
Escherichia coli ATCC #8739 e Cândida albicans ATCC #10231, frente aos antibióticos específicos
Penicilina G 10UI (PEN), Amicacina 30μg (AMI), Miconazol 50μg (MCZ) e Extrato fresco de Alium
sativum L., 20 µL e 100 µL pelo Método de Difusão em Agar — Técnica do Disco (Alho D) e do Poço
54 (Alho P) Alho Prespectivamente. estatisticamente significativo frente ao do controle positivo p<0,001.

Discussão

Amaral (2006) considera o Brasil como um dos países de maior di-

versidade vegetal, com 55 mil espécies catalogadas e inúmeras plantas com
potencial terapêutico. Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS) o
comércio de medicamentos fitoterápicos no Brasil é calculado em torno de
5% do mercado total de remédios (CORREA; ALVES, 2008).
O alho (Allium sativum L.) é utilizado como tratamento de diver-
sas doenças desde a antiguidade e estudos recentes confirmam sua ação
antimicrobiana (VENTUROSO et al., 2011; FONSECA et al., 2014).
Ele também possui alta concentração de fitoquímicos, relacionados à

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resposta da planta às agressões de ambientes inóspitos. A maior con-

centração de fitoquímicos está nos bulbos, mais conhecidos como
“dentes de alho” (MARCHIORI, 2006).
Quintaes (2008) reporta que o extrato de alho fresco diluído 128
vezes apresenta resultados significativos, demonstrando o potencial de
inibição em cerca de 14 espécies de bactérias, entre elas Escherichia coli
e Staphylococcus aureus, responsáveis por danos à saúde humana. Em
um estudo de revisão sobre propriedades funcionais do alho, Marchiori
(2006) afirma que ele apresenta ação antimicrobiana, tanto contra bac-
térias Gram positivas e Gram negativas quanto contra vírus e fungos
como Candida albicans.
O extrato fresco de Allium sativum L., (20µL), impregnado nos dis-
cos, não apresentou atividade antibacteriana significativa frente à cepa
de Staphylococcus aureus ATCC #6538, quando comparado à ação da
55
penicilina testada. No entanto, o mesmo volume testado em Escheri-
chia coli ATCC #8739 demonstrou o mesmo grau de eficiência antimi-
crobiana da Amicacina testada e a mesma ação antifúngica do Mico-
nazol frente à cepa de Cândida albicans ATCC #10231, sugerindo uma
ação promissora.
Extratos aquosos e hidroalcoólicos de Allium sativum L., bem
como discos de alho fresco, possuem efeito inibitório sobre o cresci-
mento de bactérias e fungos (OTA et al., 2010; VENTUROSO et al.,
2011; FONSECA et al., 2014).
O aumento da concentração do extrato fresco de Allium sativum L.
para 100µL, no método de difusão em Ágar - Técnica do Poço, demonstrou
que o alho apresentou atividade antimicrobiana estatisticamente significa-
tiva contra Staphylococcus aureus ATCC #6538 e Escherichia coli ATCC
#8739, quando comparado ao controle positivo, Penicilina e Amicacina

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(p<0,001), respectivamente. Da mesma forma, o alho apresentou uma ação

antifúngica expressiva contra Cândida albicans ATCC #10231, quando
comparada à ação do Miconazol, demonstrando assim, a eficiência do alho
como antimicrobiano.

Considerações finais

Nossos resultados, com a utilização do extrato fresco de Allium sa-

tivum L., frente às culturas de Staphylococcus aureus ATCC #6538, Es-
cherichia coli ATCC #8739, corroboram as informações publicadas sobre
a eficiência do alho como agente antimicrobiano. Da mesma forma, de-
monstram também uma ação antifúngica frente à Candida albicans ATCC
#10231. Em ambos os casos, os resultados foram notadamente significativos
(p<0,001), com a maior concentração do extrato fresco de alho (100 µL), em
56
relação aos antimicrobianos comerciais utilizados no presente estudo. As-
sim, novos experimentos devem ser ainda efetuados, com a finalidade de se
empregar o extrato fresco de Allium sativum L., como opção para o uso de
antibióticos naturais.

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