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Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho”

Faculdade de Ciências Farmacêutica
Produção e Separação de Biofármacos

RELATÓRIO DE PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNA VERDE FLUORESCENTE

(eGFP) EM Escherichia coli BL21 (DE3)

Prof.ª Dr.ª Valéria de Carvalho Santos Ebinuma

Prof. Dr. Heitor Buzetti Simões Bento
Técnico: Flávio Pereira Picheli
Estágio Docência: Me. Caio de Azevedo Lima

Ana Clara Bocardo Poloni R.A: 181111721

Guilherme Tonani Dias R.A: 181111144
Maria Claudia Correia Fuzaro R.A: 191110949

Araraquara
2023
 SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 1
2. OBJETIVOS 1
2.1. Objetivos Específicos 2
3. MATERIAIS E MÉTODOS 2
3.1. Materiais 2
3.2. Metodologia 3
3.2.1. Preparo das células 3
3.2.2. Rompimento celular 4
3.2.3. Purificação de eGFP 4
3.2.4. Descarte 5
3.3. Metodologia analítica 5
3.3.1. Quantificação de proteínas totais 5
3.3.2. Quantificação da eGFP 6
3.3.3. Análise por Eletroforese 7
4. RESULTADOS 7
4.1. Rompimento celular 7
4.2. Proteínas Totais 8
4.3. Quantificação da proteína Verde Fluorescente (eGFP) 9
4.4. Eletroforese SDS PAGE 11
4.5. Comparação entre grupos 12
5. CONCLUSÃO 14
6. BIBLIOGRAFIA 15
 1. INTRODUÇÃO

As etapas de um de produção em um bioprocesso podem ser divididas em dois

grandes grupos: upstream e downstream. As etapas de upstream são iniciais, desde o cultivo
do microrganismo, transfecção, produção da biomolécula de interesse em escala de bancada
passando por todo o scale up. Já as etapas de downstream constituem aquelas responsáveis
pela extração e purificação do bioproduto de interesse (SCHWAMINGER, ZIMMERMANN
e BERENSMEIER, 2022).
Sabe-se que, tanto em escala de bancada quanto em escala industrial, as etapas de
downstream correspondem a uma porcentagem grande do valor total de um projeto devido às
técnicas envolvidas serem de alto custo e, geralmente, para se obter o nível de pureza
desejado, muitas destas técnicas são essenciais, como por exemplo a cromatografia
(SCHWAMINGER, ZIMMERMANN e BERENSMEIER, 2022).
A proteína fluorescente eGFP é produzida em E.coli intracelularmente, desta forma, o
processo de extração se inicia com a etapa de rompimento celular, seguindo de clarificação e
o processo de purificação em si. Atualmente, encontra-se na literatura muitos trabalhos em
que se utilizam de cromatografias de afinidade (GOMES, FERREIRA e MERGULHÃO,
2022) e de troca iônica (SOARES et al, 2021), principalmente, para a purificação da
molécula-alvo.
Devido às condições do laboratório, onde foram realizadas as aulas práticas, a
extração da proteína eGFP foi realizada por solvente orgânico de acordo com a metodologia
de Samarkina et al (2009) e YAKHNIN et al (1998). O processo de extração foi dividido em
duas etapas principais: a extração da proteína em etanol (fase orgânica) e a recuperação da
mesma na fase aquosa. Uma das principais vantagens desta metodologia, além de não utilizar
cromatografia que é uma técnica custosa, está no seu fácil escalonamento para escala
industrial.

2. OBJETIVOS

Executar o projeto de extração e purificação de eGFP das células de Escherichia coli

BL21 (DE3), cultivadas e induzidas anteriormente durante o projeto de produção, através da
formação de sistemas bifásicos utilizando sais e solventes orgânicos. Realizar também
análises eletroforéticas e quantitativas da eGFP para avaliação da eficiência do método.

1
 2.1. Objetivos Específicos

● Realizar o rompimento celular da bactéria Escherichia coli BL21 (DE3) por

sonicação;
● Purificar a proteína eGFP a partir da extração orgânica;
● Aplicar métodos analíticos a amostras retiradas em diferentes etapas do processo e
analisar o grau de pureza da proteína de interesse.

3. MATERIAIS E MÉTODOS

Na Figura 1, abaixo, se encontra o fluxograma da metodologia proposta para a

purificação da eGFP e, o mesmo, foi devidamente seguido durante a realização das aulas
práticas.

Figura 1 - Fluxograma da metodologia proposta

Fonte: Elaborado pelos autores, 2023.

3.1. Materiais

● Micropipetas P1000 e P200

● Ponteiras P1000 e P200
● Provetas de 10 mL, 25 mL e 250 mL
● Pisseta
● Frasco tipo Erlenmeyer 250 mL
● Tubos de fundo cônico 50 mL
● Agitador Vórtex

2
 ● Centrífuga HITACHI High-Speed Refrigerated Centrifuge CR22N
● Centrífuga HETTICH Universal 320/320R
● Sonicador de Ponteira Ultrassônico Eco-Sonics
● Tampão de extração (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA sódico)
● Espátulas
● Balança analítica
● Solvente etanol 96% (v/v)
● Solvente n-butanol
● Solução aquosa de cloreto de sódio (NaCl) 5M
● Solução aquosa saturada de sulfato de amônio ((NH4)2SO4)
● Reagente de Bradford
● Espectrofotômetro GENESYSTM 10S UV-Vis (ThermoFisher Scientific)
● Cubetas para espectrofotômetro
● Microtubos de 1,5 mL
● Balança analítica
● Leitora de microplacas PERKINELMER EnSpire Multimode Plate Reader
● Placa de 96 poços

3.2. Metodologia

3.2.1. Preparo das células

Armazenados a -20 ºC, 3 tubos de fundo cônico continham células de E. coli

suspensas em 20 mL de solução tampão. Para o preparo das células, os 3 tubos foram
descongelados em temperatura ambiente. Após descongelamento completo, as células foram
submetidas à centrifugação a 10000 g por 5 minutos em 4 ºC em centrífuga HITACHI
High-Speed Refrigerated Centrifuge CR22N. O sobrenadante não foi descartado, como
idealizado no projeto. O pellet foi recuperado para ser utilizado no processo de rompimento
celular.
Amostras de 1 mL foram retiradas de cada tubo contendo sobrenadante e armazenadas
para posterior análise.

3
 3.2.2. Rompimento celular

As células centrifugadas, como descrito na Secção 3.2.1., foram ressuspendidas em 20

mL de tampão de extração (Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM), previamente
preparado. Para realizar o rompimento celular, foi realizado o processo de sonicação a 20
kHz em um Sonicador de Ponteira Ultrassônico Eco-Sonics. As células de E. coli foram
submetidas a 7 ciclos de 10 segundos cada. Para garantir o resfriamento da amostra, entre os
ciclos de sonicação houveram intervalos de 30 segundos em banho de gelo (GOMES,
FERREIRA, MERGULHÃO, 2022).

3.2.3. Purificação de eGFP

Para purificar a eGFP, foi feito um processo de extração orgânica utilizando como
solvente o etanol. Apesar da etapa de rompimento celular, foi decidido seguir o processo de
purificação apenas com o sobrenadante do extrato celular devido à maior presença da eGFP
nesta fração. O sobrenadante foi recuperado e foram retirados, utilizando uma pisseta, 10 mL
de cada tubo de fundo cônico e transferidos para três novos tubos de fundo cônico de 50 mL.
Em seguida, foram adicionados a cada tubo, aproximadamente, 3 mL de solução NaCl
5M e 23,3 mL de solução saturada de (NH4)2SO4 (pH 7,8), atingindo a saturação de 64% e
as concentrações finais próximas de 0,41 M e 2,63 M, respectivamente.
Após a adição dos sais, foi adicionado 12 mL de etanol 96% (v/v) e centrifugado a
3000 g por 7 minutos a temperatura ambiente, a fim de evitar a cristalização do sulfato de
amônio (DONG et al, 2019).
Após a centrifugação, a parte superior da mistura heterogênea, a qual deveria conter a
proteína de interesse, foi recuperada. Foram recuperados cerca de 10 mL dessa fase, a fim de
evitar a contaminação com a fase inferior. A essa fração recuperada, foi adicionado n-butanol
na proporção ¼ em relação ao etanol, ou seja, 2,5 mL e foi feita uma segunda centrifugação a
3000 g por 7 minutos.
Ao fim desse processo, a proteína de interesse deveria ser encontrada na fase aquosa
(inferior) da mistura heterogênea. Para confirmação, foi feita uma breve análise com luz UV.
Para a recuperação da proteína de interesse, a fase superior foi removida cuidadosamente
(SAMARKINA et al, 2009).
A eGFP, recuperada em fase aquosa, foi armazenada em freezer a -20ºC até o
momento de realização da eletroforese. Para a realização de análises, foram coletadas 3
amostras de 1 mL cada tubo.

4
 3.2.4. Descarte

O descarte de resíduos de organismos geneticamente modificados, no caso a E.coli

BL21 (DE3) pLysS pet28a, foram feitos seguindo as normas de acordo com sua classe de
risco. Esse microrganismo é considerado um OGM de classe de risco 1, ou seja, apresenta
baixo risco individual e baixo risco coletivo. As regras em relação ao descarte para NB-1 de
acordo com as normas RDC 306/04 (ANVISA) e 358/05 (CONAMA), como o Art. 6° e Art.
27° da Lei nº 11.105/05 - Lei de Biossegurança, afirmam que todo resíduo líquido ou sólido
contaminado deve ser descontaminado por autoclavagem ou outro método comprovado de
descontaminação antes de ser descartado, além de todo material e equipamento que tenha
entrado em contato. Todo material proveniente de OGM e seus derivados devem ser
descartados de forma a impossibilitar seu uso como alimento por animais ou pelo homem
(GONZALEZ, 2020).
Já para o descarte de reagentes e soluções químicas, algumas outras normas foram
seguidas. Soluções aquosas de sais inorgânicos de metais alcalinos e alcalinos terrosos, como
NaCl, KCl, CaCl₂ e tampões, puderam ser descartados diretamente na rede de esgoto.
Soluções de ácidos ou bases inorgânicas foram devidamente diluídas e neutralizadas para
posterior descarte na rede de esgoto, respeitando os limites da NBR 9800/1987 (PAULA,
2018).
Solventes orgânicos como etanol e butanol, não puderam ser descartados em rede de
esgoto, sendo assim descartados em recipientes específicos e bem sinalizados. O mesmo
procedimento foi seguido para metais pesados e líquidos inflamáveis (PAULA, 2018).

3.3. Metodologia analítica

3.3.1. Quantificação de proteínas totais

A fim de realizar a quantificação de proteínas, foi escolhido o método de Bradford,

que consiste na formação de compostos azulados ao haver a ligação de Coomassie azul
brilhante G-250 à proteínas, absorvendo feixes de luz na faixa de 595 nm (BRADFORD,
1976). O Coomassie se encontra no reagente de Bradford, que pode ser preparado conforme o
Anexo 1, ou utilizado reagente comercial.
Para a reação, seguiu-se a metodologia da curva padrão fornecida pelo laboratório.
Em microtubos, amostras de 20 μL foram adicionadas juntamente com 1 mL do reagente de
Bradford. A mistura foi incubada à temperatura ambiente por 10 min ao abrigo de luz para

5
posterior leitura de absorbância. As amostras foram então vertidas em cubetas e analisadas a
595 nm em espectrofotômetro GENESYSTM 10S UV-Vis (ThermoFisher Scientific). O
tampão da solução das amostras com reagente foi empregado como branco nas leituras
(KIELKOPF, C. L. et al, 2020; ROBIĆ, G.; LACORTE, C.; MIRANDA, E. A, 2009).
A curva padrão fornecida se encontra na Equação 1, a seguir.

𝑦 = 0, 4016 𝑥 + 0, 0131 (Equação 1)

3.3.2. Quantificação da eGFP

O método analítico utilizado para quantificar a eGFP foi uma análise direta de
fluorescência, feita com o uso de uma leitora de microplacas PERKINELMER EnSpire
Multimode Plate Reader. Nesse método, amostras foram coletadas ao início da purificação,
ou seja, logo após o rompimento celular, e ao final do processo de purificação. Elas foram
centrifugadas em centrífuga HETTICH Universal 320/320R a 13000 g por 5 minutos em
temperatura ambiente e o pellet foi ressuspendido em tampão Tris-HCl 50 mM, previamente
preparado (LOPES, 2019). Foi utilizado o vórtex para homogeneizar a amostra, que foi
pipetada com uso de micropipeta P200 em placa de 96 poços, no volume de 100 µL por poço
(JESUINO, 2020; PERKINELMER, 2011).
Para a análise de fluorescência, o conteúdo foi excitado no comprimento de onda de
395 nm e emitido a outro de 510 nm, utilizando a leitora de microplacas (CARSON et al,
2012). O branco utilizado foi o tampão Tris-HCl 50 mM. A determinação da concentração de
eGFP foi realizada utilizando uma curva de calibração adequada fornecida pelo técnico do
laboratório, dada pela Equação 2 (JESUINO, 2020).

𝑈𝐹 = 16936 . [𝑒𝐺𝐹𝑃] + 2307 (Equação 2)

Através da quantificação de eGFP, é possível fazer a comparação com os valores

obtidos no método de Bradford. A pureza pode ser avaliada através da Equação 3 a seguir,

𝐶𝑥
𝑃 (%) = 𝐶𝑇
. 100 (Equação 3)

6
 Onde P representa o grau de pureza, Cx corresponde à concentração da proteína
desejada (eGFP) e CT a concentração de proteínas totais.

A recuperação pode ser avaliada através da Equação 4, a seguir.

𝐶𝑥𝑛. 𝑉𝑛
η(%) = 𝐶𝑥𝑜. 𝑉𝑜
. 100 (Equação 4)

Nela, Cxn representa a concentração da proteína de interesse no estágio n do processo

de purificação e Vn o volume da amostra em que a mesma se encontra, Cxo representa a
concentração da proteína de interesse no estágio inicial e Vo o volume em que se encontrava.

3.3.3. Análise por Eletroforese

A eletroforese foi feita utilizando a amostra de extrato celular após rompimento

celular, descrito na Secção 3.2.2, e a amostra coletada após o processo de purificação,
descrito na Secção 3.2.3. que apresentaram maior concentração de proteínas. Para iniciar o
preparo das amostras, que estavam previamente congeladas, foi feito o descongelamento em
banho a 37 °C. Com as amostras descongeladas, foram adicionados, em dois novos tubos de
centrífuga, 100 uL de cada amostra e 200 uL de tampão Laemmli (SDS, Tris-HCl,
β-mercaptoetanol, glicerol) previamente preparado. Os tubos de centrífuga foram colocados
em banho a 100 ºC por 10 minutos. Decorrido esse tempo, 10 uL de cada amostra foi
coletado e misturado ao corante azul de bromofenol. Por fim, foi feita a pipetagem das
amostras nos poços de eletroforese e foi iniciada a corrida.
A corrida aconteceu durante 3 horas a uma tensão de 80 V e corrente constante de 20
mA em um Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell da BIO-RAD. Como padrão
de proteína foi utilizado o BluEye da Sigma, que é um padrão large range, ou seja, abrange
proteínas de diferentes massas,. Foram pipetados 5 uL no poço de eletroforese, como
recomendado pelo fabricante.

4. RESULTADOS

4.1. Rompimento celular

Ao início do processo de purificação, notou-se a presença da coloração verde

fluorescente por todo o conteúdo dos tubos, como apresenta a Figura 2.

7
 Figura 2 - Pellet (a) e sobrenadante (b) após descongelamento e centrifugação.

Fonte: Elaborado pelos autores, 2023.

Era esperado que a proteína fosse encontrada majoritariamente no interior das células
após o descongelamento, ou seja, apenas o pellet estaria com a coloração verde. A forte
coloração verde presente no sobrenadante indica o rompimento celular que ocorreu devido ao
descongelamento das amostras que ficaram armazenadas. O pellet mostrado na Figura 2a
possui leve coloração esverdeada e fluorescência, o que aponta que uma pequena fração da
proteína produzida ainda se encontrava no interior das células.
O rompimento foi ocasionado pelo próprio processo de congelamento, que gera a
formação de cristais de gelo na membrana celular, acarretando em seu rompimento (ISLAM,
ARYASOMAYAJULA, SELVAGANAPATHY, 2017). Outro fator que poderia ter
influenciado na lise celular é a composição do tampão de armazenamento. O tampão utilizado
no armazenamento foi o Tris-HCl 50 mM, que se feito de forma incorreta, pode atingir um
pH que desestabiliza a membrana celular e, consequentemente, colabora com o rompimento
dessa membrana (ANGELOVA et al, 2018).

4.2. Proteínas Totais

A análise pelo método de Bradford resultou nos seguintes valores de absorbância

apresentados na Tabela 1, além das seguintes concentrações de proteínas totais, calculadas
através da Equação 1 apresentada na seção 3.3.1. Para o cálculo da massa total, considerou-se
o volume de 20 ml para a amostra antes da purificação e 10 ml para a amostra após a
purificação.

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 Tabela 1 - Absorbância média, concentração proteica e massa total de proteínas obtida pelo método de
Bradford nas amostras pré e pós purificação.

Amostra Absorbância Concentração Massa total de

média protéica (mg/mL) proteínas (mg)

Pré purificação 0,056 ± 0,064 0,108 ± 0,159 2,153 ± 3,180

Após purificação 0,023 ± 0,013 0,026 ± 0,033 0,255 ± 0,332

Fonte: Elaborado pelos autores, 2023.

O método possibilita a identificação de proteínas totais, de forma que se era esperado

a presença de maiores concentrações de proteínas na amostra pré purificação. Isso se dá
devido ao fato da presença de proteínas contaminantes e indesejadas, uma vez que a amostra
foi retirada logo após o rompimento celular sem nenhum tipo de purificação.
Consequentemente, esperava-se que a concentração de proteínas após a purificação fosse
menor, de forma que na solução fosse encontrado de forma majoritária a molécula de
interesse, ou seja, a eGFP.
Os dados obtidos pela análise condizem quantitativamente com os resultados
esperados, sendo a concentração proteica pré purificação de 0,108 ± 0,159 mg/mL e pós
purificação de 0,026 ± 0,033 mg/mL. Os dados apontam uma queda de 75,9% da
concentração proteica total entre as amostras, número significativo. Entretanto, não se pode
concluir através do método de Bradford a eficiência do processo de purificação adotado,
devido à impossibilidade de confirmar a presença somente da eGFP na amostra. Dessa forma,
outros métodos analíticos também foram adotados.

4.3. Quantificação da proteína Verde Fluorescente (eGFP)

A análise da fluorescência resultou nos seguintes valores, apresentados na Tabela Y,

além das seguintes concentrações de proteína verde fluorescente (eGFP), calculadas através
da Equação 2. Para o cálculo da massa de proteína, considerou-se o volume de 20 ml para a
amostra antes da purificação e 10 ml para a amostra após a purificação.

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 Tabela 2 - Absorbância média e concentração de eGFP obtida pelo método de Fluorescência e massa
de eGFP nas amostras pré e pós purificação.

Amostra Fluorescência Concentração eGFP Massa total de

média (UF) (mg/L) eGFP (mg)

Pré purificação 117.666,667 6,812 ± 3,694 0,136 ± 0,074

Após purificação 9.172,333 0,405 ± 0,208 0,004 ± 0,002

Fonte: Elaborado pelos autores, 2023.

A partir desses resultados é possível notar que houve uma diminuição significativa na
quantidade de eGFP após a purificação, uma vez que houve perda de massa de
aproximadamente 97%, indicando que o método empregado não foi eficiente.
Uma vez que o precipitado obtido logo após o processo de descongelamento não foi
utilizado no processo, é possível que certa quantidade de proteína de interesse tenha se
perdido nesse momento, apesar de o precipitado não demonstrar cor esverdeada e
fluorescência significativa. Além disso, é provável que parte de eGFP tenha sido perdida
durante as fases de extração, uma vez que não foi possível recuperar toda a fase superior após
adição de etanol para evitar contaminação com a fase inferior. Ademais, de acordo com
Sindarovska et al (2008), o uso de sulfato de amônio, dependendo de sua concentração, pode
causar a precipitação de eGFP junto com outras proteínas. Ainda de acordo com Dong et al
(2019) um contato prolongado com a fase etanólica pode levar a desnaturação da proteína de
interesse. Por fim, possíveis erros técnicos durante a execução do processo de extração
podem ter causado também a elevada perda de eGFP.
Com os resultados obtidos foi possível calcular também o grau de pureza e a
recuperação da eGFP a partir das Equações 3 e 4, tendo como resultado os valores de 1,59%
e 5,95% respectivamente, os baixos valores obtidos confirmam a ineficiência do método de
extração empregado.

Tabela 3 - Resultados de pureza e rendimento final obtidos pelo grupo.

G6

Pureza Final (%) 1,59

Rendimento final (%) 5,95

Fonte: Elaborado pelos autores, 2023.

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 O artigo em que o dado trabalho foi baseado apresentou amostras com pureza acima
de 95%, porém o processo do artigo de Samarkina et al (2009) incluía uma etapa de
cromatografia após a extração por solventes. Cromatografias garantem altos níveis de pureza
e recuperação de moléculas, portanto os valores obtidos no artigo não são refletidos no dado
trabalho (PINA et al, 2014). Mesmo assim, os valores obtidos de pureza e rendimento
ficaram muito abaixo do esperado.

4.4. Eletroforese SDS PAGE

Ao final da eletroforese foi obtida a imagem apresentada na Figura 3, a qual mostra o

resultado da corrida para diferentes metodologias de purificação.

Figura 3 - Análise eletroforética de purificação de GFP.

Fonte: Elaborado pelos autores, 2023.

As colunas respectivas à metodologia empregada neste trabalho são as colunas de

número 3 (amostra pré-purificação) e 4 (amostra pós-purificação). Como pode ser observado,
a amostra 3 apresenta bandas menos expressivas de diferentes pesos moleculares e uma
banda mais significativa próxima a 30 kDa. Após a purificação se torna difícil identificar a
presença de bandas definidas, o que indica que houve algum erro durante a execução da
metodologia escolhida.

11
 É possível que esse resultado tenha sido obtido devido à alta concentração de sal de
amônio presente no extrato proteico. O sal de amônio, utilizado em uma das etapas de
purificação, não foi removido da amostra final, o que pode ter gerado um excesso de cargas
elétricas e, consequentemente, interferência na corrida eletroforética (KURIEN, SCOFIELD,
2012). Além disso, a adição de diferentes solventes pode ter provocado a desnaturação da
proteína e alteração da sua conformação nativa, pois foi possível conferir perda de
fluorescência como mostra a Figura 4 (GRIEBENOW, KLIBANOV, 1996).

Figura 4 - Extrato protéico no final do processo de purificação.

Fonte: Elaborado pelos autores, 2023.

Para atingir o resultado esperado, como descrito na literatura, a concentração dos sais
e solventes adicionados poderia ser reavaliada e uma etapa de microdiálise poderia ser
realizada para remover o excesso de sais presentes no extrato protéico, o que possivelmente
otimizaria o resultado da eletroforese (SAMARKINA et al, 2009).

4.5. Comparação entre grupos

Apesar de os demais grupos da Turma 2 não utilizarem o mesmo método de extração,

foi realizada uma comparação entre os resultados obtidos a fim de verificar se há a existência
de algum padrão entre os resultados. Os resultados estão expostos nas Tabelas 4, 5 e 6.

12
 Tabela 4 - Comparação da massa de proteínas totais entre grupos da turma 2.

Massa de proteínas totais (mg)

G5 G6 G7 G8

Pré purificação 0,601 2,153 20,28 18,033

Pós purificação 0,034 0,255 0,5942 0,5397

Fonte: Elaborado pelos autores, 2023.

Tabela 5 - Comparação da massa EGFP entre grupos da turma 2.

Massa de EGFP (mg)

G5 G6 G7 G8

Durante o cultivo 0,0484 1,64 4,46 3,37

Pré Purificação 0,0014 0,136 0,4823 0,795

Pós Purificação 0,0008 0,004 0,0576 0,0311

Fonte: Elaborado pelos autores, 2023.

Apesar dos problemas ocorridos durante o processo de purificação e de suas

análises, foi possível perceber que os valores obtidos pelos grupos seguiram o padrão
esperado de acordo com as condições de agitação propostas durante a etapa de produção
(0 rpm, 50 rpm, 150 rpm e 200 rpm para os grupos 5, 6, 7 e 8 respectivamente), com
apenas algumas variações.

O grupo 7 apresentou o melhor resultado durante a etapa de produção, porém ao

compararmos o resultado de pré purificação do grupo G7 (0,4823) com o grupo G8
(0,795) podemos perceber que o segundo obteve número maior de eGFP, tal fato pode ser
explicado por possíveis problemas no rompimento das células do grupo 7, como um
possível desnaturamento das proteínas no caso do uso de sonicação como método de
rompimento, uma vez que a alta temperatura pode acarretar esse problema.

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 Tabela 6 - Comparação dos resultados de pureza e rendimento final entre grupos da turma 2.

G5 G6 G7 G8

Pureza Final (%) 2,51 1,59 9,58 5,02

Fonte: Elaborado pelos autores, 2023.

Apesar de os grupos terem realizado diferentes métodos de purificação, baixa

porcentagem de todos os grupos mostra que os métodos empregados tiveram baixo nível de
eficiência.

5. CONCLUSÃO

Os objetivos propostos ao projeto foram atingidos, porém os resultados observados

não foram satisfatórios. A partir dos resultados obtidos foi possível perceber que o método de
purificação de sistema bifásico utilizando sais e solventes orgânicos não mostrou eficiência
esperada. A perda da proteína de interesse durante o processo de extração é um possível fator
que afetou os resultados finais. Além disso, os materiais utilizados na extração proposta,
como sulfato de sódio e etanol, quando manejados de maneira incorreta, podem ocasionar a
precipitação da proteína de interesse e a sua desnaturação respectivamente.
Em comparação com os outros grupos da Turma 2 o presente trabalho obteve o menor
resultado em relação a pureza obtida, porém, os outros resultados também não se mostraram
satisfatórios sendo o mais alto dos valores 9,58%, mostrando que os métodos empregados
pelos grupos não foram de alta eficiência. O valor de eGFP medido através da fluorescência
logo após o rompimento e anteriormente a purificação também se mostrou mais baixo que os
obtidos anteriormente na etapa de produção, o que pode indicar problemas no momento do
rompimento, principalmente pelos grupos que optaram pelo método de sonicação, uma vez
que a alta temperatura pode causar o desnaturamento da proteína, além disso é possível que
tenham ocorrido erros durante a leitura.

14
 6. BIBLIOGRAFIA

ANGELOVA, Miglena I. et al. pH sensing by lipids in membranes: The fundamentals of

pH-driven migration, polarization and deformations of lipid bilayer assemblies. Biochimica et
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GRIEBENOW, K.; KLIBANOV, A. M. On Protein Denaturation in Aqueous-Organic

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