Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho”

Faculdade de Ciências Farmacêutica

Produção e Separação de Biofármacos

RELATÓRIO DE EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA VERDE

FLUORESCENTE (EGFP) EM Escherichia coli BL21 (DE3)

Prof.ª Dr.ª Valéria de Carvalho Santos Ebinuma

Prof. Dr. Heitor Buzetti Simões Bento
Técnico: Flávio Pereira Picheli
Estágio Docência: Me. Caio de Azevedo Lima

Bruno Coelho da Fonseca

Isadora Arcanjo Gori
Izadora Barreto Alves dos Santos
Mariana Ribeiro de Castro

Araraquara
2023
 Resumo
A EGFP (proteína verde fluorescente aprimorada) é uma variante monomérica e que
não precisa de agentes adicionais para exibir a atividade de fluorescência (SOUSA, 2019) da
proteína de fluorescência verde (GFP) originalmente isolada da água viva Aequorea victoria.
A proteína é composta por 238 aminoácidos e possui peso molecular de aproximados 29 kDa.
Sua extração ocorreu pelo uso da técnica de ultrasonicação e a purificação foi realizada pela
utilização dos métodos de salting-out com sulfato de amônio [(NH₄)₂SO₄], precipitação por
solventes orgânicos como o etanol e o n-butanol, e finalizando com uma corrida de
eletroforese SDS-PAGE. A partir dos métodos empregados obteve-se, ao final, 5,024% de
pureza, concentração de 6,02 mg/L de EGFP na amostra final purificada e um rendimento de
3,29%. A quantificação de proteínas totais foi realizada pelo método de Bradford (utilizando
o reagente comercial fornecido pelo técnico do laboratório didático) e a quantificação de
EGFP pela análise de fluorescência por espectrofotometria.
SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO.................................................................................................................... 1
1.1. Características físico-químicas da EGFP...................................................................... 1
1.2. Rompimento celular...................................................................................................... 1
1.2.1. Purificação............................................................................................................2
1.2.2. Precipitação de Proteínas Contaminantes por Sais.............................................. 3
1.2.3. Purificação por solventes orgânicos..................................................................... 4
1.3. Eletroforese SDS-PAGE................................................................................................5
2. OBJETIVOS......................................................................................................................... 6
2.1. Objetivos específicos.....................................................................................................6
3. MATERIAIS E MÉTODOS................................................................................................ 7
3.1. Fluxograma do processo................................................................................................7
3.2. Materiais........................................................................................................................7
3.2.1. Rompimento celular............................................................................................. 7
3.2.2. Purificação............................................................................................................7
3.2.3. Eletroforese SDS-PAGE.......................................................................................8
3.3. Metodologia.................................................................................................................. 8
3.3.1. Rompimento celular............................................................................................. 8
3.3.2. Purificação............................................................................................................9
3.3.2.1. Precipitação de Proteínas Contaminantes por Sais..................................... 9
3.3.2.2. Purificação por solventes orgânicos.......................................................... 10
3.3.2.2.1. Purificação por etanol.......................................................................11
3.3.2.2.2. Purificação por n-butanol................................................................. 11
3.3.3. Eletroforese SDS-PAGE.....................................................................................13
3.3.7. Métodos Analíticos............................................................................................ 14
3.3.7.1. Quantificação de EGFP............................................................................. 14
3.3.7.2. Método de Bradford.................................................................................. 14
3.3.7.3. Análise de Pureza...................................................................................... 14
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................................................ 15
4.1. Rompimento celular.................................................................................................... 15
4.2. Precipitação de Proteínas Contaminantes por Sais..................................................... 16
4.3. Purificação por solventes orgânicos............................................................................ 17
4.4. Purificação geral e comparação com demais grupos...................................................18
4.5. Comparação entre grupos da P2..................................................................................19
4.6. Eletroforese SDS-PAGE..............................................................................................22
5. CONCLUSÃO.................................................................................................................... 23
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................. 24
 1. INTRODUÇÃO

1.1. Características físico-químicas da EGFP

Composta por 238 aminoácidos e com peso molecular de aproximadamente 27 kDa, a

proteína em si mostra-se termoestável após produzida (WARD, 2005). No entanto, o processo
de produção é termossensível – o rendimento proteico diminui significativamente em
temperaturas superiores a 30 ºC. A proteína nativa possui faixa de excitação em 395 nm e
pico de emissão em 508 nm. A fluorescência é emitida pela ciclização dos resíduos Ser 65 e
Gly 67 (serina e glicina, respectivamente), formando um intermediário denominado
imidazolin-5-ona (YANG; MOSS; PHILLIPS, 1996).
A EGFP (proteína verde fluorescente aprimorada) é uma variante monomérica e que
não precisa de agentes adicionais para exibir a atividade de fluorescência (SOUSA, 2019) da
proteína de fluorescência verde (GFP) originalmente isolada da água viva Aequorea victoria
e é caracterizada por sua forte emissão de fluorescência verde quando exposta à luz
ultravioleta ou azul (SHANER et al., 2007). A diferença mais notável entre a GFP e a EGFP
é a maior fluorescência da versão aprimorada, além de possuir maior estabilidade, pois a
versão nativa da proteína demonstra indícios de desnaturalização por volta da temperatura de
37 °C, condição esta não apresentada na EGFP (LOPES et al., 2019).
De acordo com Yang, Moss e Phillips (1996), a formação do fluoróforo se dá pela
presença do resíduo de Gly 67 na GFP recombinante. Estudos mostraram que a proteína
purificada apresenta resistência à desnaturação, sendo necessário expô-la a tratamentos a
90 ºC e pHs inferiores a 4 e superiores a 12. Assim sendo, pode ser recuperada e renaturada
(parcial ou integralmente) após neutralização e/ou diálise. No entanto, apesar de a proteína
possuir certa estabilidade mesmo após mudanças em diversas condições ambientais, o pH é
um dos fatores que interfere diretamente na fluorescência desta, a qual é diminuída quando
em ambientes muito ácidos (ROBERTS et al., 2016).

1.2. Rompimento celular

O rompimento celular é uma etapa importante em muitos processos biotecnológicos,

como a produção de compostos bioativos, enzimas e proteínas recombinantes, sendo de
extrema importância levar em consideração fatores como a eficiência, especificidade, custo e
impacto na qualidade da amostra, a fim de obter os resultados desejados com o mínimo de
impacto negativo possível.
 Entre os métodos mecânicos de rompimento celular, o moinho de esferas e ultrassom
são amplamente utilizados. Cada um desses métodos apresenta vantagens e desvantagens
distintas e, tendo o presente experimento foco no ultrassom, pode-se destacar que este é um
método não invasivo e utiliza ondas sonoras de alta frequência para promover o rompimento
celular. Este método tem sido amplamente utilizado em diferentes processos biotecnológicos,
no entanto, a eficácia do método pode ser influenciada por vários fatores, como a potência do
ultrassom, a duração do tratamento e a temperatura da suspensão. Por outro lado, apesar de a
ultrasonicação apresentar ótimos rendimentos em escala laboratorial, não é adequada para
aumento de escala, uma vez que, além do alto custo, apresenta riscos à saúde devido ao ruído
(CHISTI et al., 1986).
Apesar de haver diversos métodos de rompimento celular, o processo de
ultrasonicação se torna uma alternativa interessante, uma vez que os demais métodos podem
apresentar riscos de degradação da molécula de interesse, além de alto consumo de energia e
longos períodos de processamento (MARTINS et al., 2018). Conforme descrito pelos
mesmos autores, o rompimento celular da cepa de E. coli BL21 (DE3) [pLysS; pET28(a)] foi
realizado utilizando ultrasonicação, através da otimização de um protocolo já descrito
anteriormente na literatura por Jain et al. (2004).

1.2.1. Purificação

A purificação, inclusive de proteínas, se faz de suma importância para garantir o

máximo rendimento e o grau de pureza necessário para que, neste caso, estas sejam aplicadas
e comercializadas livres de contaminantes, principalmente em se tratando de biofármacos,
imunobiológicos, etc., a fim de atender às regulamentações (determinadas pela Agência
Nacional de Vigilância Sanitária – ANVISA –, Food and Drug Administration – FDA –,
European Medicines Agency – EMA) e garantir a eficácia e a segurança do produto obtido
(IPEA, 2018; PRIVATO; MARTINEZ; SCHMIDT, 2020). Assim sendo, sabe-se que existem
diferentes e possíveis métodos para realizar a purificação de proteínas, tais como
cromatografias (troca iônica, exclusão molecular, afinidade, etc.), precipitação por sais como
salting-in e salting-out, purificação por solventes orgânicos, filtração (microfiltração,
ultrafiltração, nanofiltração e osmose reversa) e afins.
1.2.2. Precipitação de Proteínas Contaminantes por Sais

De acordo com Moraes et al. (2013), a presença de elevada concentração salina no

meio proporciona a diminuição da solubilidade proteica, ocasionando a precipitação destas
proteínas ao gerar agregados proteicos. Tal efeito é denominado salting out e pode ser
realizado utilizando sais neutros como o sulfato de amônio.
O método de salting out é regido pelo princípio de interações hidrofóbicas a partir da
redução da camada de hidratação da proteína, podendo ser adotado como uma etapa de
concentração/purificação de baixa resolução que precede processos de alta resolução e possui
como vantagens o baixo custo e a possibilidade de recuperação da atividade proteica após a
solubilização. Ainda, os sais agem de tal maneira que há a estabilização da proteína contra I)
desnaturação; II) proteólise; e III) contaminação bacteriana. No entanto, possui como
principal desvantagem, neste caso, o caráter corrosivo do sulfato de amônio – que será
empregado para esta etapa (KILIKIAN; JR., 2020).
A eficiência dos sais neutros utilizados no método de salting out foi estudada por
Hofmeister em 1888. Os cátions e ânions que apresentaram maior poder de estabilidade e
desestabilidade proteica foram organizados de acordo com a Série de Hofmeister, ilustrada na
Figura 1 a seguir:

Figura 1: Série de Hofmeister.

Fonte: Patel et al. (2014).

Assim sendo, pode-se observar que ânions polivalentes como o sulfato e o fosfato,
bem como os cátions monovalentes amônio e potássio são boas escolhas para realizar a etapa
de salting out, pois têm baixa probabilidade de ocasionar a desnaturação proteica. De modo
geral, o sulfato de amônio é tido como um dos mais utilizados, pois sua solubilidade não
sofre grandes variações entre 0 e 30 ºC, além de garantir estabilidade à proteína e sua
densidade (1,235 g/cm3) ser inferior à densidade média de agregados proteicos (1,29 g/cm3),
fato este que favorece a precipitação (KILIKIAN; JR., 2020).

1.2.3. Purificação por solventes orgânicos

Esse tipo de metodologia é baseada na adição de um solvente orgânico – como etanol,

n-butanol ou clorofórmio – à solução de biomoléculas, causando uma redução na solubilidade
da biomolécula de interesse ou de contaminantes, resultando na formação de um precipitado.
As propriedades físico-químicas dos solventes orgânicos, como a polaridade e a capacidade
de formar ligações de hidrogênio, afetam a interação com a biomolécula, com o solvente em
que se encontra ou com os contaminantes e, portanto, influenciam a eficácia da precipitação.
Sendo assim, a escolha depende das propriedades da biomolécula a ser purificada e das
condições de precipitação, como temperatura e pH (BRITES et al., 2012). A precipitação por
solventes orgânicos é uma técnica amplamente utilizada na purificação de proteínas, ácidos
nucléicos e outras biomoléculas, com alta eficiência e baixo custo.
O etanol é uma molécula orgânica amplamente empregada na precipitação de
biomoléculas, tais como proteínas e ácidos nucleicos. A sua popularidade deve-se à sua
ampla disponibilidade, segurança e baixo custo. De acordo com Yoshikawa et al. (2012), o
etanol é capaz de provocar a precipitação de moléculas biológicas, uma vez que reduz a
solubilidade das proteínas e ácidos nucleicos. Entretanto, a eficácia da precipitação com
etanol pode ser influenciada pela presença de íons salinos e pelo pH da solução, o que pode
levar à co-precipitação de impurezas.
Em relação ao n-butanol, este é frequentemente utilizado na precipitação de proteínas
em pH ácido, pois é menos hidrófilo do que o etanol e, portanto, mais eficaz na remoção de
íons solúveis em água. Além disso, o n-butanol é menos tóxico do que o clorofórmio e pode
ser facilmente removido por evaporação ou por lavagem com água. No entanto, a
concentração de n-butanol necessária para precipitação de proteínas pode variar dependendo
da proteína em questão e do pH da solução. É importante ressaltar que a precipitação com
n-butanol pode ser sensível à temperatura e ao tempo, e pode ser necessário otimizar esses
parâmetros para obter o máximo rendimento de recuperação da proteína (LOVRIEN et al.,
1997).
A técnica de precipitação utilizando solventes orgânicos é uma estratégia efetiva e
simples para a purificação de biomoléculas. Contudo, a seleção do solvente orgânico deve ser
minuciosamente considerada em função da natureza química da biomolécula a ser purificada,
e a otimização das condições de precipitação deve ser executada para assegurar a eficiência e
o rendimento da biomolécula de interesse.

1.3. Eletroforese SDS-PAGE

A eletroforese é uma técnica laboratorial que permite separar moléculas de acordo

com o seu tamanho e carga elétrica. Essa técnica é usada para diversas finalidades, como
diagnóstico de doenças, identificação de microrganismos, teste de paternidade e análise de
proteínas. A eletroforese consiste na aplicação de um campo elétrico sobre um gel que
contém as amostras a serem separadas. As moléculas migram pelo gel em direções e
velocidades diferentes, dependendo da sua carga e massa. As moléculas menores e mais
carregadas migram mais rápido do que as maiores e menos carregadas. Para visualizar as
moléculas separadas, usa-se um corante fluorescente que emite luz sob uma fonte de UV ou
LED. O resultado da eletroforese é um padrão de bandas que representa os diferentes
fragmentos das moléculas analisadas (OLIVEIRA et al., 2015).
A SDS-PAGE é um método de eletroforese que permite separar proteínas com base no
seu tamanho. A SDS (sulfato de dodecil sódio) é um detergente anfipático que se liga às
proteínas e confere-lhes uma carga negativa uniforme, eliminando a influência da estrutura e
da carga intrínseca das proteínas. O meio é um gel de poliacrilamida descontínuo, que atua
como um filtro através do qual as proteínas se movem em resposta ao campo elétrico
(HAGIWARA, 2022). A técnica faz uso do β-mercaptoetanol, agente redutor que atua
rompendo as pontes dissulfeto que mantêm a estrutura terciária e quaternária das proteínas,
permitindo que elas sejam desnaturadas pelo calor e pelo SDS (“Immunodetection of bacteria
causing brucellosis”, 2020). As proteínas são separadas de acordo com as suas massas
moleculares, sendo as menores as que migram mais rapidamente em direção ao anodo. Para
visualização das bandas após a corrida, é necessário que haja um corante capaz de marcar as
proteínas, como é o caso do Coomasie Blue Brilliant G-250 (CBB G-250), um corante
triarilmetano que se liga às proteínas e permite a sua visualização no gel. O CBB G-250 tem
uma tonalidade azul esverdeada e é usado principalmente no ensaio de Bradford para a
quantificação de proteínas, este forma um complexo com as proteínas que absorve luz na
faixa do visível, com um máximo de absorção em 595 nm (GRINTZALIS; GEORGIOU;
SCHNEIDER, 2015). A figura 2, a seguir, exemplifica uma corrida de SDS-PAGE para
separação de EGFP.
 Figura 2: Corridas de SDS-PAGE para análise da separação de EGFP.

Fonte: Yakhnin et al. (1998).

2. OBJETIVOS

Realizar a extração da proteína verde fluorescente aprimorada (EGFP) produzida a

partir do cultivo de Escherichia coli BL21 (DE3) contendo os vetores plasmidiais pLyss e
PET28(a), tal como a purificação da mesma.

2.1. Objetivos específicos

● Realizar de forma bem sucedida a lise celular da bactéria Escherichia coli BL21
(DE3) a partir do método de ultrasonicação;

● Purificar de forma eficiente, por precipitação salina, a EGFP presente no extrato do

lisado celular;

● Quantificar os resultados de cada etapa através de métodos analíticos e avaliar o grau

de purificação obtido.
 3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Fluxograma do processo

Fonte: Autores (2023).

3.2. Materiais

3.2.1. Rompimento celular

● Disruptor ultrassônico digital;

● Banho termostatizado;
● Banho de gelo;
● Centrífuga Hitachi - High Speed Refrigerated Centrifuge CR22N (R18 A).

3.2.2. Purificação

● Sulfato de amônio [(NH4)2SO4] anidro;

● Gelo;
● Etanol (maior pureza disponível, se possível analítico);
● n-Butanol (maior pureza disponível, se possível analítico);
● Centrífuga Hitachi - High Speed Refrigerated Centrifuge CR22N (R18 A);
● Lavadora ultrassônica ©Ecosonics;
 ● Tubos para centrífuga;
● Balança semianalítica.

3.2.3. Eletroforese SDS-PAGE

● Dodecil-sulfato de sódio (SDS) 10%;

● Gel poliacrilamida;
● Tampão Tris-HCl;
● Persulfato de sódio;
● Tetrametiletilenodiamina (TEMED);
● Glicerol;
● β-mercaptoetanol;
● Azul de bromofenol;
● Coomassie Brilliant Blue G-250;
● Metanol;
● Água;
● Sistema de eletroforese.

3.3. Metodologia

3.3.1. Rompimento celular

Nas duas primeiras aulas práticas reservadas para o processo de extração e purificação
foi realizado um teste com apenas uma das três amostras obtidas anteriormente. O processo
proposto no projeto foi seguido, entretanto, na etapa de purificação por etanol, debris celular
foi erroneamente coletado, o que comprometeu a eficácia das próximas etapas, gerando um
resultado insatisfatório. Dessa maneira, na última aula, o processo foi refeito com as outras
duas amostras que ainda estavam armazenadas, e dessa vez, o debris celular formado na etapa
de purificação por etanol não foi coletado, permitindo que o restante do procedimento fosse
mantido com qualidade. Sendo assim, é importante ressaltar que todo o processo descrito
adiante foi realizado em duplicata.
Primeiramente, os pellets de células previamente ressuspendidos em 6 mL de tampão
de extração (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0) e congelados a -20 °C em tubos cônicos tipo Falcon
de 50 mL, obtidos na fase prévia do projeto, foram descongelados em banho termostatizado à
temperatura de 40 °C até atingir o descongelamento total (aproximadamente 5 minutos).
 Em seguida, o rompimento celular de E. coli BL21 (DE3) [pLysS; pET28a)] foi
realizado através do processo de ultrasonicação, utilizando um disruptor ultrassônico digital
(QR350 ©Ecosonics) numa amplitude de 40% (correspondente a 112 W) em banho de gelo,
com 10 ciclos totais, sendo cada um deles correspondente a pulsos de 1 min ON a 20 Hz / 2
min OFF, totalizando assim 30 minutos.
Em sequência, as amostras foram então centrifugadas a 10.000 rpm (≈ 13024,7 x g),
por 5 minutos a 4 ºC utilizando a centrífuga Hitachi - High Speed Refrigerated Centrifuge
CR22N (R18 A) e o sobrenadante esverdeado resultante do processo foi coletado a fim de
promover a separação do pellet contendo o debris celular.
Após esse processo, observou-se que o pellet de células obtido ainda possuía uma leve
cor esverdeada. Dessa forma, o pellet foi ressuspendido 6 mL em tampão Tris-HCl e
submetido a mais 2 ciclos de rompimento celular, análogos aos realizados anteriormente,
seguidos de centrifugação nas mesmas condições apresentadas, resultando em um pellet de
cor mais esbranquiçada ao final desse procedimento. O sobrenadante esverdeado advindo
dessa etapa adicional foi somado àquele obtido previamente.
Por fim, foi coletada uma alíquota de 500 μL do sobrenadante esverdeado total
resultante do final do processo para análise da pureza, de acordo com as equações
apresentadas na seção de Métodos Analíticos e os procedimentos propostos: Bradford para a
determinação das proteínas contaminantes e leitura da fluorescência para a concentração de
EGFP.

3.3.2. Purificação

3.3.2.1. Precipitação de Proteínas Contaminantes por Sais

Conforme descrito por Yakhnin et al. (1998), para a realização da etapa de

precipitação foram adicionados ao sobrenadante esverdeado coletado de cada amostra uma
quantidade pré-determinada de (NH4)2SO4 anidro em pó para se obter uma concentração final
de 1,6 M (solução com 40% de saturação - cerca de 4 M) e as amostras foram armazenadas à
-20°C para posterior continuação do processo de purificação.
A massa m de (NH4)2SO4 em pó utilizada para cada amostra foi determinada a partir
da fórmula:

𝑚 = 𝑀. 𝑚𝑀 . 𝑉 (Equação 1)
 Onde M corresponde à concentração molar, mM à massa molar de sulfato de amônio e
V ao volume de sobrenadante obtido após o rompimento celular.
Em seguida, na semana seguinte, as amostras foram descongeladas em banho
termostatizado e a remoção das proteínas precipitadas foi feita por centrifugação a 10.000
rpm (≈ 13024,7 x g), por 5 minutos a 4 ºC, utilizando a centrífuga Hitachi - High Speed
Refrigerated Centrifuge CR22N (R18 A).
Nesse momento, o sobrenadante esverdeado foi coletado e observou-se que o pellet de
proteínas formado apresentava uma forte cor verde, indicando que ocorreu a precipitação de
EGFP. Sendo assim, visando obter um melhor rendimento e evitar a precipitação indesejada
da proteína verde fluorescente, o processo foi repetido utilizando uma molaridade
correspondente à metade utilizada inicialmente, ou seja, 0,8 M.
Dessa forma, o pellet foi ressuspendido em tampão Tris-HCl e a massa m de
(NH4)2SO4 em pó utilizada foi calculada de acordo com a Equação 1. A suspensão resultante
foi novamente submetida à centrifugação a 10.000 rpm (≈ 13024,7 x g), por 5 minutos a 4 ºC,
utilizando a centrífuga Hitachi - High Speed Refrigerated Centrifuge CR22N (R18 A).
O sobrenadante esverdeado obtido nessa etapa foi somado àquele coletado
anteriormente. Já o pellet formado apresentou uma cor acinzentada, indicando que pouca
quantidade de EGFP foi precipitada, embora, provavelmente, ocorreram perdas durante o
processo, uma vez que o pellet não foi submetido a uma nova precipitação. Da mesma
maneira como foi feito anteriormente, uma alíquota de 500 μL foi retirada do volume total de
sobrenadante esverdeado para posterior análise da pureza e fluorescência.
Em seguida, foi novamente adicionada uma quantidade pré-determinada de (NH4)2SO4
em pó de acordo com a Equação 1 ao sobrenadante esverdeado resultante do processo
anterior, para promover uma concentração final de 2,8 M (solução com 70% de saturação).

3.3.2.2. Purificação por solventes orgânicos

É importante salientar que durante todas as etapas subsequentes de extração de EGFP,

as amostras foram protegidas da luz para evitar a perda da fluorescência. Além disso, da
mesma maneira como foi feito para as etapas anteriores, ao final de cada extração, foi
coletado uma alíquota de 500 μL da amostra resultante para posterior análise da pureza, de
acordo com as equações apresentadas na seção de Métodos Analíticos e os procedimentos
propostos (Bradford para a determinação das proteínas contaminantes e leitura da
fluorescência para a concentração de EGFP), a fim de se obter os desempenhos de cada
processo para comparações futuras.

3.3.2.2.1. Purificação por etanol

Partindo para a etapa de extração da proteína de interesse, a suspensão obtida na etapa

anterior, contendo tanto o sobrenadante quanto o precipitado em sulfato de amônio
(NH4)2SO4 anidro a 70%, foi submetida a duas etapas de extração.
A primeira etapa envolveu adicionar à suspensão um volume de ¼ de etanol (de
máxima pureza disponível), seguido de agitação vigorosa durante 1 minuto, sendo a
separação das fases aquosa e etanólica realizada através da centrifugação por 10 minutos a
5.000 rpm (≈ 8335,8 x g) à 4° C. A proteína verde fluorescente foi extraída na fase orgânica
(etanólica), a qual pôde ser identificada por meio da forte fluorescência verde da fase superior
(etanólica) sob iluminação UV.
Analogamente, foi adicionado à fase superior coletada anteriormente na primeira
1
etapa de extração um volume de 16
de etanol, novamente seguido de agitação vigorosa

durante 30 segundos e centrifugação por 10 minutos a 5.000 rpm (≈ 8335,8 x g) à 4° C para

promover a separação de fases. Dessa forma, após a centrifugação, a EGFP foi mais uma vez
extraída na fase orgânica (etanólica), sendo identificada pela fluorescência verde emitida. É
importante ressaltar que ambas as fases etanólicas (que continham a proteína de interesse)
foram coletadas cuidadosamente em cada etapa de extração com o auxílio de uma pipeta de
Pasteur para evitar perturbar a interface.

3.3.2.2.2. Purificação por n-butanol

Após a etapa de precipitação por etanol, uma solução contendo ¼ do volume de

n-butanol (de máxima pureza disponível) foi adicionada à fase etanólica contendo EGFP
coletada anteriormente. A solução resultante foi submetida à agitação vigorosa por 30
segundos e, posteriormente, centrifugada por 10 minutos a 5.000 rpm (≈ 8335,8 x g) à 4° C
para separação das fases.
Inicialmente, a EGFP foi identificada tanto de forma solubilizada na fase superior
(sobrenadante esverdeado) quanto de maneira mais concentrada na interface, ao passo de que
o n-butanol se depositou na fase inferior. Dessa maneira, foi adicionado mais ¼ de n-butanol
às amostras, seguido de agitação no vortex e centrifugação por 10 minutos a 5.000 rpm.
 Feito isso, o mesmo sistema de fases foi novamente formado, entretanto, o
sobrenadante obtido (fase superior) apresentou uma coloração quase transparente. Algumas
gotas de n-butanol foram adicionadas a fim de verificar a possibilidade de formação de fases,
fenômeno que não ocorreu.
Dessa forma, o sobrenadante foi removido com o auxílio de uma pipeta de Pasteur e a
tentativa de solubilização da interface verde fluorescente foi realizada adicionando 5 mL de
água destilada seguido de banho de ultrassom por 15 minutos utilizando uma lavadora
ultrassônica ©Ecosonics. Após esse tempo, as amostras foram homogeneizadas no vórtex e
observou-se que ainda não estavam completamente solubilizadas, sendo submetidas a mais
um ciclo de banho de ultrassom. Depois do banho, as amostras foram mais uma vez agitadas
no vórtex, e como ainda haviam partículas em suspensão, foram adicionados mais 5 mL de
água destilada, seguido novamente de agitação no vórtex, centrifugação por 10 minutos a
5.000 rpm e transferência do sobrenadante esverdeado para outro tubo Falcon.
Ao final desse processo, como descrito anteriormente, a pureza das amostras foi
analisada de acordo com as equações descritas adiante na seção de Métodos Analíticos.

Tabela 1: Resumo das etapas de purificação (processo em duplicata) - em ordem.

Volume da Tipo e quantidade de Condições de Condições de Porção coletada

Etapa porção coletada composto adicionado agitação/ centrifugação (contendo EGFP)
na etapa anterior (gramas ou mL) incubação

Primeira (NH4)2SO4 Incubação 5 minutos

Precipitação por Sobrenadante* (1,6 M) em gelo 10.000 rpm Sobrenadante
(NH4)2SO4 1 hora 4°C

Segunda (NH4)2SO4 Incubação Suspensão

Precipitação por Sobrenadante** (2,8 M) -20° C Sem (sobrenadante +
(NH4)2SO4 (congelador) centrifugação (NH4)2SO4)
2 semanas

Primeira ¼ Etanol Agitação 10 minutos Superior

Purificação por Suspensão Vórtex 5.000 rpm (etanólica)
etanol 30 segundos 4°C

Segunda Agitação 10 minutos Superior

Purificação por Fase superior 1
Etanol Vórtex 5.000 rpm (etanólica)
16
etanol 30 segundos 4°C

Purificação por Agitação 10 minutos Interface + fase

n-butanol Fase superior ¼ n-butanol (2x) Vórtex 5.000 rpm inferior
30 segundos 4°C (aquosa)

Fonte: Autores (2023).

*Sobrenadante coletado na etapa de rompimento celular.
**Volume total de sobrenadante obtido após a ressuspensão (0,8 M) do pellet formado na primeira precipitação por
(NH4)2SO4.

3.3.3. Eletroforese SDS-PAGE

A eletroforese em SDS-PAGE foi utilizada como metodologia meramente qualitativa

para avaliar o processo de purificação da proteína EGFP. A corrida foi realizada utilizando o
sistema Mini-PROTEAN Tetra cell da Biorad, em corrente constante de 20 mA e 80 V pelo
período durante o qual o marcador de corante azul de bromofenol se desloca
(aproximadamente três horas). O gel utilizado tinha as medidas de 10 x 7 cm e espessura de 1
mm, feito a partir de poliacrilamida, contendo os polímeros acrilamida e bis-acrilamida,
sendo a concentração de 5% para o gel de empilhamento (1/3) e 12% para o gel de corrida
(2/3). O padrão utilizado para acompanhar o tamanho das proteínas foi o BluEye da Sigma,
demarcando bandas de 11, 17, 20, 25, 35, 48, 63, 75, 100, 135, 180, e 245 kDa, este foi
injetado no primeiro poço do gel de empilhamento no volume de 5 μL.
As amostras analisadas foram retiradas imediatamente após o rompimento celular do
terceiro tubo tipo Falcon e após a etapa final de purificação do mesmo. Para ambas as
amostras, foram retirados 100 μL e misturadas com 200 μL tampão Laemmli (de
desnaturação) e submetidas a aquecimento seco de 100 °C por 10 minutos. O tampão é
composto por dodecil-sulfato de sódio (SDS), tampão Tris-HCl, β-mercaptoetanol, glicerol e
azul de bromofenol (opcional). Após o aquecimento, foram retirados 10 μL de cada amostra e
injetadas nos poços livres do gel de empilhamento.
Com o sistema montado e as amostras prontas para corrida, o gel foi mergulhado em
tampão de corrida contendo base tris, glicina e SDS, iniciando então a eletroforese. Após o
tempo estipulado, o sistema foi desmontado e o gel submetido à desidratação (ou fixação das
proteínas) por imersão em solução de etanol (40% v/v) e ácido acético (10% v/v) por 3 horas
e, em seguida, à coloração por imersão overnight em solução de 0,15 g de Coomassie
Brilliant Blue, 90 mL de metanol, 30 mL de ácido acético e 180 mL de água destilada.
Consecutivamente, o gel foi descorado na mesma solução, porém sem Coomassie Brilliant
Blue G-250, assim como descrito pela metodologia de Magalhães e Arruda (2007).
 3.3.7. Métodos Analíticos

3.3.7.1. Quantificação de EGFP

A quantificação da EGFP foi realizada através da leitura da fluorescência utilizando

uma leitora de placas EnSpire® Multimode Plate Reader em microplaca preta de fundo chato
e preto de 96 poços, selecionando o comprimento de onda de 488 nm para excitação e 507
nm para leitura da emissão. A concentração de EGFP (mg/L) foi determinada através da
curva fornecida pelos docentes.

3.3.7.2. Método de Bradford

A quantificação das proteínas totais foi realizada utilizando o reagente comercial

Bradford LGC e a curva analítica pré-disposta pelo laboratório, representada pela Equação 2,
de R2 igual a 0,9921.

𝑦 = 0, 3702𝑥 + 0, 0156 (Equação 2)

Para cada amostra a ser analisada, foram retirados alíquotas de 1,0 mL, a partir de
uma micropipeta volumétrica de 1000 μL, inseridos em cubetas e misturados a 20 μL do
reagente, retirados com uma micropipeta volumétrica de 200 μL. As misturas foram deixadas
descansando por 10 minutos para então serem submetidas a leituras em Espectrofotômetro
BEL UV-Vis, em comprimento de onda de 595 nm. O branco utilizado para as leituras foi a
solução tampão Tris-HCl 50 mM, pH 8.

3.3.7.3. Análise de Pureza

A eficiência das metodologias de purificação serão avaliadas submetendo os

resultados de concentrações de EGFP e proteínas totais ao cálculo apresentado na Equação 3,
disposta a seguir.
𝐶𝑥
𝑃 (%) = 𝐶𝑇
. 100 (Equação 3)

Em que P representa o grau de pureza em porcentagem, Cx equivale à concentração de

EGFP e CT a concentração de contaminantes. Para cada etapa da purificação, será avaliado
também o aumento de pureza por precipitação, utilizando a Equação 4 a seguir:
 𝑃𝑛
𝐴𝑃 = 𝑃𝑛−1
(Equação 4)

Sendo que Pn representa a pureza calculada no estágio atual e Pn-1 equivale ao grau de
pureza obtido no estágio anterior de precipitação.
Será realizado também o cálculo de porcentagem de recuperação da EGFP a partir das
amostras obtidas, utilizando a equação 5.
𝐶𝑥𝑛. 𝑉𝑛
η(%) = 𝐶𝑥𝑜. 𝑉𝑜
. 100 (Equação 5)

Tal que Cxn representa a concentração de EGFP no estágio atual de purificação e Vn o

volume da amostra em que a mesma se encontra, enquanto Cxo equivale a concentração de
EGFP inicial, antes da purificação, e Vo o volume em que se encontrava.

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1. Rompimento celular

Após completar o procedimento de ultrassonicação, as amostras não demonstraram

mudança aparente de fluorescência nem de consistência, sugerindo que não houve
desnaturação visível da proteína EGFP. Após a centrifugação, observou-se que o debris
celulares ainda apresentavam certa fluorescência, indicando que os 10 ciclos propostos não
foram suficiente para o rompimento completo e satisfatório da biomassa nas amostras, sendo
então necessário a ressuspensão do pellet e repetição do processo, o que resultou em debris
celulares esbranquiçados e sem resquícios de fluorescência.
Os sobrenadantes obtidos tinham uma forte cor verde com elevada fluorescência
quando expostos a luz negra e a quantificação de suas proteínas totais por método de
Bradford demonstraram alta densidade proteica, tendo uma concentração de 1639, 384 ± 9,73
mg/L em 11 mL de amostra, resultando em 18,033 mg de proteínas totais. Já a análise de
fluorescência apontou a concentração de 72,261 ± 0,86 mg/L de EGFP, considerando o
volume, tem-se o valor de 0,795 mg da proteína. A tabela 2 disposta a seguir demonstra
comparativamente os resultados obtidos na quantificação da amostra após o rompimento
celular.
Tabela 2: Comparação entre as concentrações e massas de proteínas totais e EGFP presentes nas
amostras após o rompimento celular.
 [Proteínas Massa de [EGFP] (mg/L) Massa EGFP Massa
totais] (mg/L) Proteínas totais (mg) contaminantes
(mg) (mg)

1639,384 ± 9,73 18,033 72,261 ± 0,86 0,795 17,238

Fonte: Autores (2023).

Nota-se que a massa obtida da EGFP não representa sequer 5% das proteínas totais
presentes na amostra, o que foi inesperado, uma vez que durante o processo de cultivo da
bactéria Escherichia coli e produção da proteína de interesse, obteve-se o valor de ± 3,37 mg
de EGFP. Sendo assim, houve uma perda estimada de 76,41% da massa total de proteína
produzida.
É conhecido que o processo de ultrasonicação, por ser um método de rompimento
celular mecânico, pode gerar calor o suficiente para desnaturar proteínas, no entanto, o
procedimento foi realizado em banho de gelo exatamente para contornar tal situação. Desta
forma, julga-se que o gelo utilizado não foi o suficiente para evitar a transferência de energia
térmica capaz de desnaturar as proteínas da amostras, uma vez que a técnica se mostrou
efetiva em romper as células, gerando pellets esbranquiçados e sem fluorescência
considerável, descartando a possibilidade de perda de EGFP por rompimento insatisfatório.
Infere-se que uma possível solução para o ocorrido seja aumentar os intervalos de tempo off
nos ciclos da ultrassonografia e melhor refrigeração das amostras durante a técnica,
diminuindo a geração e transferência de calor.

4.2. Precipitação de Proteínas Contaminantes por Sais

Não foi possível observar a redução das proteínas contaminantes através utilização do
sulfato de amônio, uma vez que ocorreram erros na metodologia utilizada para determinação
das proteínas totais, fenômeno que será explicado mais adiante. A tabela 3 abaixo indica os
resultados obtidos nessa etapa de purificação:

Tabela 3: Comparação entre as concentrações e massas de proteínas totais e EGFP presentes nas
amostras após a precipitação de proteínas contaminantes por sulfato de amônio.

[Proteínas totais] Massa de [EGFP] Massa Massa

Etapa (mg/L) Proteínas (mg/L) EGFP contaminantes
totais (mg) (mg) (mg)

Ultrasonicação 1639,384 ± 9,73 18,033 72,261 ± 0,86 0,794 17,238

 (NH4)2SO4 1115,999 ± 8,46 16,739 56,53 ± 0,54 0,674 16,065

Fonte: Autores (2023).

Apesar dos resultados numéricos não indicarem que houve purificação, visualmente
nas aulas práticas foi possível observar que o sulfato de amônio contribuiu para a purificação
da EGFP, reduzindo as proteínas contaminantes por meio de sua precipitação.

4.3. Purificação por solventes orgânicos

A primeira etapa da precipitação por etanol, utilizando 1/4 do volume total da amostra
como medida para o uso do solvente resultou em uma concentração média de 22,005 ± 1,14
mg/L da proteína EGFP na fase superior, onde era esperado a precipitação da mesma. A
mesma fase teve como resultado 322,055 ± 7,64 mg/L de proteínas totais. Considerando que
o volume médio da amostra era de 21,562 ± 0,442 mL têm-se que a massa recuperada de
EGFP foi de 0,475 mg, sendo que a massa de proteínas totais foi de 13,414 mg. Já na segunda
etapa da precipitação por etanol, desta vez utilizando 1/16 de volume, teve como resultado
8,487 ± 1,3 mg/L de EGFP e 1259,859 ± 105 mg/L de proteínas totais, considerando então o
volume médio de 3,56 ± 0,226 mL têm-se que a massa final desta etapa para EGFP e
proteínas totais foi, respectivamente, de 0,03 e 4,485 mg.
Para a precipitação utilizando o n-butanol como solvente, a concentração de EGFP
obtida após o procedimento foi de 6,025 ± 1,943 mg/L e para proteínas totais 119,935 ±
78,312 mg/L. Tendo em vista que o volume das amostras nesta etapa foi de 4,35 ± 0,212 mL,
então a massa recuperada da EGFP foi de 0,026 mg e para as proteínas totais 0,522 mg.
A tabela 4 abaixo apresenta os resultados obtidos durante as etapas de purificação
utilizando solventes orgânicos:

Tabela 4: Comparação entre as concentrações e massas de proteínas totais e EGFP presentes nas
amostras durante as etapas de purificação.
[Proteínas totais] Massa de [EGFP] Massa Massa
Etapa (mg/L) Proteínas (mg/L) EGFP contaminantes
totais (mg) (mg) (mg)

Etanol 1/4 322,055 ± 7,64 13,888 22,005 ± 1,14 0,475 13,414

Etanol 1/16 1259,859 ± 105 4,485 8,487 ± 1,32 0,03 4,454

n-butanol 119,935 ± 78,312 0,522 6,025 ± 1,943 0,026 0,495

Fonte: Autores (2023).

4.4. Purificação geral e comparação com demais grupos

Por fim, a tabela 5 a seguir, compara os resultados obtidos durante todas as etapas de
purificação da proteína de interesse:

Tabela 5: Comparação entre as concentrações e massas de proteínas totais e EGFP presentes nas
amostras durante as etapas de purificação.
[Proteínas totais] Massa de [EGFP] Massa Massa
Etapa (mg/L) Proteínas (mg/L) EGFP contaminantes
totais (mg) (mg) (mg)

Ultrasonicação 1639,384 ± 9,73 18,033 72,261 ± 0,86 0,794 17,238

(NH4)2SO4 1115,999 ± 8,46 16,739 43,485 ± 0,54 0,674 16,065

Etanol 1/4 322,055 ± 7,64 13,888 22,005 ± 1,14 0,475 13,414

Etanol 1/16 1259,859 ± 10,56 4,485 8,487 ± 1,3 0,03 4,454

n-butanol 119,935 ± 78,312 0,522 6,025 ± 1,943 0,026 0,495

Fonte: Autores (2023).

Além disso, foi calculado também a Pureza e o Rendimento de cada etapa do processo
de acordo com as equações previamente apresentadas. Os resultados obtidos compreendem a
Tabela 6 abaixo:

Tabela 6: Resultados obtidos de pureza, aumento de pureza e rendimento para cada etapa do processo
de purificação.
Etapa Pureza (%) Aumento Rendimento
de Pureza (%)

Ultrasonicação 4,407 - -

(NH4)2SO4 5,065 0,82 1,314

Etanol 1/4 3,416 0,944 59,692

Etanol 1/16 0,673 0,394 3,801

n-butanol 5,024 7,457 3,297

Fonte: Autores (2023).

Através das tabelas acima, é possível observar que ao final do processo de

purificação, a massa (mg) de proteínas contaminantes foi reduzida em aproximadamente
97,12%, apesar da pureza final resultar num valor de apenas cerca de 5% e um rendimento de
3,3%. Era esperado uma queda da concentração e consequentemente da massa de EGFP ao
longo das etapas das precipitações com solventes orgânicos devido a forma em que foi
realizado a recuperação dos sobrenadantes, isto pois a interfase se mostrava delicada e
facilmente poderia ser perturbada se manejada indevidamente, desta forma a recuperação se
deu de tal forma a sempre deixar resquícios da proteína de interesse nas amostras a serem
descartadas. A baixa pureza, no entanto, não era esperada.
Um dos fatores que pode ter contribuído para a baixa pureza e rendimento da amostra
final purificada é a leitura incorreta das proteínas totais durante a aplicação do método
Bradford, onde utilizou-se a solução tampão Tris-HCl (50 mM, pH 8) como branco amostral.
Julga-se que, possivelmente, moléculas indesejadas ou cuja presença não foi prevista
interferiram na leitura das amostras, superestimando os dados obtidos. Desta forma, deve-se
considerar que os valores de proteínas totais e, por consequência, de impurezas estejam acima
do valor real. Outra hipótese seria um defeito no próprio reagente utilizado, este
possivelmente perdeu sua efetividade durante o tempo de armazenamento, resultando em
leituras imprecisas.

4.5. Comparação entre grupos da P2

Com o intuito de identificar alguma semelhança com resultados obtidos, realizou-se

uma comparação com os demais grupos da Turma 2 (IPTG como indutor), resumida nas
tabelas 7, 8, 9 e 10 abaixo:
Tabela 7: Comparação dos resultados de massa de proteínas totais entre grupos da Turma 2.

Massa de proteínas totais (mg)

G5 G6 G7 G8

Após
rompimento 0,601 2,153 20,28 18,033
celular (lisado)

Após
purificação 0,034 0,255 0,5942 0,5397

Fonte: Autores (2023).

Tabela 8: Comparação dos resultados da massa EGFP entre grupos da Turma 2.

Massa de EGFP (mg)

G5 G6 G7 G8
 No cultivo 0,0484 1,64 4,46 3,37
(média)

Após
rompimento 0,0014 0,136 0,4823 0,795
celular (lisado)

Após
purificação 0,0008 0,004 0,0576 0,0311

EGFP liberada
após 2,89 8,29 10,81 23,59
rompimento
(%)

Perda
estimada de 97,10 91,70 89,16 76,41
EGFP (%)

Fonte: Autores (2023).

Tabela 9: Comparação dos resultados da massa de proteínas contaminantes entre grupos da Turma 2.

Massa de proteínas contaminantes (mg)

G5 G6 G7 G8

Após
rompimento 0,59961 2,017 19,7978 17,2383
celular (lisado)

Após
purificação 0,03315 0,251 0,53664 0,50864

Redução (%) 94,47 87,55 97,29 97,05

Fonte: Autores (2023).

Tabela 10: Comparação dos resultados de pureza final entre grupos da Turma 2.

G5 G6 G7 G8

Pureza Final (%) 2,51 1,59 9,58 5,02

Fonte: Autores (2023).

Através das tabelas supracitadas, é possível observar que os resultados possuem uma
certa correlação, uma vez que os grupos apresentam uma ordem quase que crescente de
quantidade de proteínas totais, correspondente com a agitação do meio de cada grupo (G5: 0
rpm, G6: 50 rpm, G7: 150 rpm, G8: 200 rpm), com destaque para o G7 que, como observado
anteriormente, foi o grupo que mais produziu EGFP, bem como proteínas totais.
Apesar do G7 ter, de fato, produzido mais EGFP no cultivo, a eficiência do
rompimento celular aparentemente foi menor que o do presente grupo (G8), liberando apenas
0,4823 mg quando comparada com o presente grupo, que liberou 0,795 mg, obtendo assim, a
maior porcentagem de EGFP liberada através do rompimento celular (26,59%). Foi possível
verificar que os demais grupos também apresentaram baixa eficiência do processo de
rompimento celular, mesmo usando diferentes técnicas (congelamento/descongelamento e
ultrasonicação). Ainda, o grupo 7 foi o que apresentou maior quantidade de EGFP no final do
processo de purificação, bem como o que mais reduziu contaminantes de suas amostras, ao
passo que o grupo 5 foi o que obteve os menores índices correspondentes.
Por outro lado, por mais que o G7 tenha apresentado melhores dados numéricos de
pureza, visualmente, o presente grupo se destacou, visto que a amostra final purificada estava
evidentemente mais verde e concentrada quando comparada com a amostra final do G7,
como mostra as figuras 3 e 4 a seguir:

Figura 3: Amostra final purificada G8. Figura 4: Amostra final purificada G7.

Fonte: Acervo dos alunos (2023).

Uma das hipóteses consideradas é que pelo fato do da EGFP presente na amostra do grupo
7 estar solubilizada em PEG-600, o meio pode ter se tornado mais opaco, e assim, ter
impedido a visibilidade total da fluorescência da proteína.
É provável também que possa ter ocorrido erros nos cálculos de quantificação e diluição
dos grupos, além da possível ineficácia do reagente de Bradford utilizado, uma vez que os
resultados de pureza de todos os grupos da P2 ficaram muito abaixo do esperado.
4.6. Eletroforese SDS-PAGE

É de conhecimento que o tamanho da EGFP é de 26,9 kDa, desta forma, realizou-se a

eletroforese em SDS-Page para avaliar qualitativamente a purificação, comparando a
quantidade de proteínas presentes no ínicio da da metodologia e na etapa final, tal como
avaliando as posições das bandas.
A figura 3 representa a revelação da corrida contendo as amostras a serem analisadas,
juntas do padrão utilizado.

Figura 5: Revelação do gel de corrida da eletroforese em SDS-PAGE para análise da amostra inicial e final do
processo de purificação.

Fonte: Autores (2023).

Como esperado para a amostra inicial, retirada logo após ao rompimento celular,
observa-se diversas bandas de diferentes tamanhos e intensidades. Já para a amostra final
quase não é possível perceber a presença de qualquer proteína ao longo do gel, com exceção
de uma fina e quase opaca banda entre os tamanhos de 35 e 25 kDa. Não se pode afirmar que
tal proteína seja EGFP, pois a marcação parece estar levemente deslocada para cima do que
representaria 26,9 kDa, no entanto, como houve uma quantificação anterior à eletroforese,
afirmando a presença da proteína na amostra é possível que tal banda se refira a mesma.
 Outro ponto importante a se levantar é que pela quantificação obtida a partir do
método de Bradford, deveria haver presença considerável de proteínas ao longo do gel, o que
não foi observado. Tal fato pode corroborar para a hipótese de que os valores de proteínas
totais obtidos durante a quantificação estão superestimados.

5. CONCLUSÃO

A partir dos resultados obtidos e de sua análise quantitativa e qualitativa, pode-se

concluir que os métodos propostos para extração e purificação da EGFP têm eficiência e
relevância, uma vez que houve redução na quantidade de proteínas contaminantes. Porém,
para que houvesse maior rendimento, os métodos de purificação deveriam ser otimizados
para maior efetividade e rentabilidade em cada etapa.
Além disso, a metodologia da quantificação baseada no reagente de Bradford, deveria ser
realizada com um branco para cada amostra, uma vez que as soluções ao longo do processo
são diferentes, fazendo com que pudesse haver interferência na interação com as proteínas e,
consequentemente, na quantificação de proteínas totais.
Contudo, o desenvolvimento prático geral da disciplina de Produção e Separação de
Biofármacos se deu de maneira linear e razoavelmente prevista pelos projetos, de forma que
cumprisse seu objetivo de aprendizado de habilidades relacionadas ao processo básico de
produção de bioprodutos e sua purificação para futura comercialização e do desenvolvimento
de senso crítico e analítico sobre as melhores abordagens para cada biomolécula e sistema de
produção.
 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Apêndice A - Fluxograma detalhado do processo de extração proposto