Metodos de Trabalho em Bioquimic Avegetal e Tecnologia de Enzimas

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Métodos de Trabalho em Bioquímica Vegetal e Tecnologia de Enzimas
Chapter · January 2014
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Djanira Negrão F. Broetto

Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais São Paulo State University
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1
MÉTODOS DE
TRABALHO EM
BIOQUÍMICA
VEGETAL
E TECNOLOGIA DE
ENZIMAS
Coordenador:
Prof. Dr. Fernando Broetto
IBB/UNESP – Campus de Botucatu

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MÉTODOS DE TRABALHO EM BIOQUÍMICA

VEGETAL E TECNOLOGIA DE ENZIMAS
3
© 2014 Editora UNESP
Cultura Acadêmica
Praça da Sé, 108
01001-900 - São Paulo - SP
Tel.: (0xx11) 3242-7171
Fax: (0xx11) 3242-7172
www.editoraunesp.com.br
feu@editora.unesp.br
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM.
DIVISÃO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP
BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE
Métodos de trabalho em bioquímica vegetal e tecnologia de enzimas

[recurso eletrônico] / coordenador: Fernando Broetto.- Botucatu: IBB, Cultura
Acadêmica, 2014.
Recurso digital
Formato: PDF
Requisitos do sistema: Adobe Acrobat Reader
Modo de acesso: World Wide Web
ISBN 978-85-7983-550-6
1. Células e tecidos vegetais. 2. Enzimas. 3. Plantas - Metabolismo. 4. Proteínas

- Metabolismo. 5. Bioquímica. 6. Química vegetal. 7. Instituto de Biociências de
Botucatu. 8. Cultura Acadêmica. I. Título. II. Broetto, Fernando.
CDD 581.4
4
SUMÁRIO
Capítulo 1: Preparo de Tampões e Métodos para Coleta,
Procedimentos e Extração de Enzimas em Tecidos Vegetais. ................................... 07
Djanira Rodrigues Negrão, Sthefany Rodrigues Fernandes Viana e Fernando Broetto
Introdução / Preparo de Tampões / Métodos para Coleta / Coleta de folhas ou outros órgãos vegetais/
Procedimentos e Extração de Enzimas em Tecidos Vegetais / Preparo da amostra para extração / Obtenção do
extrato bruto / Uso de antioxidantes / Centrifugação / Preparo de Soluções / Referências Bibliográficas.
Capítulo 2: Aminoácidos e Proteínas: estrutura química,

função e propriedades. ............................................................................................ 12
Thalita Cristina Marques Cervezan, Aline Cristina Rabonato, Enrique Alonso Zuñiga, Fernando
Broetto, Juan Plutarco Munguía-López
Aminoácidos / Propriedades Químicas e Elétricas / Curva de Titulação de um Aminoácido / Prática: Titulação
de um aminoácido / Procedimento prático / Proteínas / Prática: Determinação de proteínas solúveis totais em
tecido vegetal / Referências Bibliográficas
Capítulo 3: Atividade de lipoxigenases. ...................................................................... 19

Érica Amanda de Barros, Amanda Cristina Esteves Amaro, Fernando Broetto
Introdução / Material Utilizado / Preparo de Soluções / Procedimento / Resultado e Discussão / Referências
Bibliográficas.
Capítulo 4: Enzimas antioxidativas em pós-colheita de vegetais. .............................. 24

Thalita Cristina Marques Cervezan, Mariana da Silva Caldeira, Fernando Broetto
Introdução / Procedimentos e Extração de Enzimas em Tecidos Vegetais / Preparo da amostra para
extração / Extração enzimática / Análises / Preparo de Reagentes / Resultado / Referências Bibliográficas.
Capítulo 5: Enzimas antioxidativas em tecidos vegetais. ........................................... 29

Marcos de Oliveira Bettini, Renata Bruna dos Santos Coscolin, Dayanne Fabrício Bressan,
Edilson Ramos Gomes, Fernando Broetto
Introdução / Material e Método / Processamento do material vegetal para obtenção do extrato
bruto / Atividade da enzima Superóxido Dismutase (SOD; EC 1.15.1.1) / Atividade da enzima Catalase
(CAT; EC 1.11.1.6) / Atividade da enzima Peroxidase (POD; EC 1.11.1.7) / Atividade da enzima
Ascorbato Peroxidase (APX; EC 1.11.1.11) / Peroxidação de Lipídeos / Referências Bibliográficas.
Capítulo 6: Atividade da enzima Nitrato Redutase. .................................................... 35

Amanda Cristina Esteves Amaro, Érica Amanda de Barros, Marco Antonio Castillo
Campohermoso, Fernando Broetto
Introdução / Material e Método / Preparo das soluções / Teste enzimático / Curva padrão de nitrito (NO2) /
Referências Bibliográficas.
Capítulo 7: Análise de proteínas por Eletroforese Nativa. ......................................... 41

Mariana da Silva Caldeira, Marcos de Oliveira Bettini, Dayanne Fabrício Bressan, Fernando
Broetto
Introdução / Procedimentos / Extração de proteínas / Eletroforese / Preparo do sistema / Preparo do gel /
Preparo da amostra / Corrida do gel / Atividade das enzimas / Superóxido Dismutase – SOD / Catalase
-CAT / Reagentes / Utilizados no preparo dos géis / Utilizados para extração e atividade protéica / Soluções
/ Gel de separação / Gel de empilhamento / Tampão de reservatório / Tampão de extração / Tampão
fosfato / Tampão de coloração para SOD / Tampão de coloração para CAT / Referências Bibliográficas
5
Capítulo 8: Atividade da Invertase de Levedura: valores da constante de Michaelis-

Menten (Km) e velocidade máxima (Vm). ............................................................... 51
Sthefany Rodrigues Fernandes Viana, Djanira Rodrigues Negrão, Fernando Broetto
Introdução / Invertase de Levedura / Reação a ser estudada / Determinação de Km e Vm da Invertase de
Levedura / Referências Bibliográficas.
Capítulo 9: Soluções Tampão: Conceito e Preparação. ..........................................

José Pedro Serra Valente, Fernando Broetto 56
Introdução / Cálculo do pH de uma Solução Tampão / Capacidade Tamponante (Ct) ou Freadora
(Cf) / Prática: Preparação da Solução Tampão / Parte Experimental / Limitações da Equação de
Henderson- Hasselbalch com Base nas Concentrações Nominais (Analíticas) / Referências Bibliográficas
Capítulo 10: Espectrofotometria Quantitativa na Região do UV-Vis (180 - 800 nm). 70

José Pedro Serra Valente, Fernando Broetto
Introdução / Banda de Absorção da Molécula e Absorbância Máxima (ëmax.). / Processo de Absorção
de Radiação UV-Vis da Molécula (m) / Princípios da Espectrofotometria Quantitativa no UV - VIS / Lei
de Lambert / Lei de Beer / Junção das duas leis / Aspectos Práticos / Requesitos para Quantificação do
Analito / Validade da Curva de Referência / Determinação da Concentração do Analito na Amostra /
Procedimento Básico para Operação do Espectrofotômetro / Procedimento para Tratamento dos Dados
Experimentais / Construção da curva de referência e determinação da concentração desconhecida de um
analito / Espectrofotômetro / Esquema do espectrofotômetro / Limitações da Lei de Beer (distorções da
linearidade/erros) / Regra Práticas para Diminuir os Desvios da Lei de Beer / Referências Bibliográficas
Capítulo 11: Proteólise enzimática da carne. ......................................................... 87

Luis Artur Loyola Chardulo, Jessica Moraes Malheiros, Victor Augusto Domingos Dias, Ana
Paula Costa Rodrigues Ferraz, Fernando Broetto
Introdução / Procedimentos e Extração Proteica / Preparo da amostra / Extração das proteínas / Análises /
Cálculo / Preparo de Reagentes / Resultado / Referências Bibliográficas.
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MÉTODOS DE TRABALHO EM BIOQUÍMICA

VEGETAL E TECNOLOGIA DE ENZIMAS
Os trabalhos de laboratório, muitas vezes solitário ou em equipe, requerem

planejamento e disciplina visando análises precisas e confiáveis. Para
análises bioquímicas em tecidos vegetais, por exemplo, faz-se necessário
uma gama de procedimentos que vão desde a coleta e processamento,
até a melhor maneira de armazenar os extratos e por fim a análise
da atividade enzimática ou teor de compostos e macromoléculas de
interesse biológico. Este livro foi proposto como desafio para os alunos
da disciplina Tecnologia de Enzimas (FCA/UNESP- Campus de Botucatu),
como parte de suas atividades acadêmicas. Desafio aceito, o texto foi
organizado em capítulos, os quais descrevem diferentes temas e suas
metodologias utilizadas em aulas práticas. Esperamos que o texto possa
servir de apoio àqueles que necessitem iniciar ou dar continuidade a
trabalhos que envolvam análises bioquímicas em tecidos vegetais.
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Capítulo 1
Preparo de Tampões e Métodos para Coleta,
Procedimentos e Extração de Enzimas em
Tecidos Vegetais
Djanira Rodrigues Negrão
Sthefany Rodrigues Fernandes Viana
Fernando Broetto
Introdução
O estudo de enzimas é fundamental em bioquímica e fisiologia vegetal, visto que praticamente,

todas as respostas da planta envolvem processos metabólicos, os quais são regulados por diversos
complexos enzimáticos. Dada a sua importância, a natureza da estrutura das enzimas e a forma do
sítio ativo podem ser afetadas por quaisquer agentes capazes de provocar mudanças conformacionais
na estrutura protéica. Isso torna a atividade enzimática dependente do meio ambiente, notadamente
do pH e da temperatura.
A maioria das enzimas apresenta um valor de pH para a qual sua atividade é máxima,
e a velocidade da reação diminui à medida que o valor do pH se afasta desse valor ótimo, que é
característico para cada enzima, mas com frequência, está próximo do pH neutro. A influência do
pH sobre a catálise enzimática só pode ser compreendida à partir da análise dos grupos dissociáveis
presentes nos grupos radicais dos aminoácidos.
Assim, para realizar análises enzimáticas de qualquer natureza, i.e. tecidos vegetais, animais
ou de microrganismos, normalmente utiliza-se vários reagentes e, dentre esses, o uso de uma solução
tampão é um recurso altamente necessário. Um tampão é uma mistura de substâncias químicas que
torna possível o extrato enzimático resistir a variações de pH, porém, cada tampão tolera uma variação
de pH dentro de uma faixa particular.
1. Preparo de Tampões
Uma solução tampão é a mistura de um ácido fraco e seu sal correspondente, como por exemplo,
o ácido acético e o acetato de sódio. Por definição, os ácidos são compostos capazes de dissociar-
Métodos de Trabalho em Bioquímica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 01, p.01-05

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se, liberando H+; já ácidos fracos são compostos em que a dissociação não é completa, restando
em solução também uma porcentagem do ácido não dissociado, existindo, portanto, um equilíbrio
químico, que pode ser descrito:
HA ↔ A + H+
Por exemplo, um tampão de ácido acético-acetato de sódio é efetivo entre a faixa de pH 3,5 a
5,5 mas tem pouca capacidade tamponante em pH 7,0. Portanto, esse tampão seria inadequado para
a maioria dos microrganismos. Um tampão comumente utilizado pelos pesquisadores é a mistura de
um ácido fraco, o fosfato monopotássico (KH2PO4), e seu sal, o fosfato dipotássico (K2HPO4). Esta
mistura tem uma forte capacidade tamponante entre pH 6 a 8.
Na prática, quando misturamos as quantidades calculadas do ácido e da base conjugados
para preparar um tampão, o pH resultante não é exatamente o esperado. A principal razão dessa
discrepância é que o pH é governado pelas atividades do ácido e da base conjugados, e não por suas
concentrações. Por esse motivo, após preparar o tampão com as quantidades calculadas, em geral faz-
se necessário um pequeno ajuste no pH (pela adição de uma solução básica ou ácida diluídas) para
obter o pH desejado.
É importante saber que diferentes soluções contêm diferentes quantidades ou concentrações de
compostos dissolvidos. Em bioquímica, geralmente utiliza-se o peso molecular de um composto para
expressar a concentração, nesse caso, da solução tampão, lembrando que o peso molecular é a soma
dos pesos atômicos de todos os átomos na molécula de um composto.
2. Métodos para Coleta

2.1 Coleta de folhas e outros órgãos vegetais
O material vegetal como, por exemplo, as folhas, deverão ser coletadas no terço médio da
planta com uso de estilete. Para a pesquisa com proteínas é recomendável padronizar o local de coleta
nas plantas, além de atentar-se ao melhor período do dia para a mesma. Em seguida, o material deve
ser acondicionado em tubos tipo Falcon (25 ou 50 mL), microtubos tipo eppendorf ou em envelope de
papel alumínio, devidamente identificados (tipo de material vegetal, data da coleta, responsável, etc.).
Após a coleta, o material deve ser rapidamente congelado, a fim de preservar a integridade
das moléculas protéicas, em nitrogênio líquido (-196º C). Caso o congelamento ocorra nos tubos
do tipo Falcon, retirar o excesso de nitrogênio líquido antes de fechar o recipiente. Outra forma de
preservar o material vegetal pode ser feita na forma de discos foliares, com auxílio de um cortador
de diâmetro definido. Esses discos podem ser acondicionados em tubos eppendorf (com um pequeno
furo na tampa que evita que a mesma estoure devido à pressão do nitrogênio) e depois colocados no
nitrogênio líquido para congelamento rápido. O armazenamento das amostras deverá ser feito em
ultrafreezer (-80º C), para preservar maximamente a integridade molecular.
É importante ter muito cuidado no transporte e manuseio do nitrogênio líquido. Para tanto, seu
Métodos de Trabalho em Bioquímica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 01, p.01-05.

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transporte é feito em tambor criogênico para evitar acidentes. É aconselhável utilizar luvas e óculos
de proteção; para o manuseio do material congelado usam-se pinças e nunca descartar o nitrogênio
líquido na tubulação.
3. Procedimentos e Extração de Enzimas em Tecidos Vegetais

3.1 Preparo da amostra para extração
Primeiramente, antes de realizar as extrações, é recomendável que as soluções tampão

necessárias para todos os processos de extração sejam previamente preparadas.
A grande maioria das soluções tampão devem ser armazenadas em geladeira, identificados
com o nome do tampão, molaridade, pH e a data de preparação. Para maior segurança das análises,
recomenda-se utilizar soluções recém-preparadas, além de usar reagentes dentro da data de validade.
Para evitar eventuais alterações bioquímicas no material vegetal a ser analisado, recomenda-se
que os utensílios usados (graal, pistilo, pinças) durante as extrações enzimáticas fiquem mantidos em
gelo (4 ºC ) durante todo o processo.
O material congelado deve ser macerado em graal na presença de nitrogênio líquido, até a
obtenção de um “pó fino”, o qual deve ser armazenado em freezer (-80ºC), devidamente identificado,
para a preservação da atividade bioquímica do tecido moído até o momento das análises. Para análises
isotópicas, que exigem maior pulverização do material, geralmente as amostras são preparadas em
moinho criogênico.
3.2 Obtenção do extrato bruto
Em geral, a quantidade de material vegetal fresco necessário para realizar uma extração é de
300 mg, pesados em balança digital. As amostras do tecido moído e congelado devem ser maceradas
na presença de uma solução tampão, onde a concentração molar e pH variam coforme o objetivo
da extração. Como mencionado, a função da solução tampão é de estabilizar o pH do meio, para
expressão da atividade enzimática.
Ao macerar o tecido vegetal é recomendável colocar, pelo menos, a metade da quantidade da
solução tampão necessária para a extração; após a maceração transferir o extrato para o tubo Falcon
(devidamente pesado) e a quantidade restante de tampão poderá ser utilizado para lavar o graal,
permitindo assim que praticamente todo o material pesado seja analisado.
Eventualmente, dependendo da natureza do tecido vegetal, como os mais fibrosos (raízes,
cascas), uma pequena porção de areia lavada (ponta de uma espátula) pode ser utilizada para facilitar
a maceração, na presença da solução tampão.
Após a obtenção do extrato bruto, o próximo passo é obter o extrato enzimático. Para tanto,
amostras do extrato bruto são acondicionadas em tubos Falcon, juntamente com a solução de extração
e/ou outros reagentes necessários para tal e então levados à centrífuga.

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3.3 Uso de antioxidantes
Algumas espécies vegetais geram compostos fenólicos, no ato das macerações, o que poderá
interferir substancialmente na atividade enzimática ou outra determinação bioquímica, principalmente
aquelas baseadas em métodos óticos. Deste modo, é importante que a oxidação seja controlada pelo
uso de antioxidantes, suplementares às soluções tampão. Como exemplos, citam-se o uso do polímero
não reativo, o PVPP (Polyvinylpolypyrrolidone) e também o ácido ascórbico, dentre outros.
3.4 Centrifugação
A força centrífuga é um recurso básico na pesquisa em bioquímica vegetal, para separar

componentes de densidades diferentes. O processo de centrifugação deve separar as partículas sólidas
(pellets) dos compostos solúveis, os quais devem conter o composto ou a proteína de interesse.
Antes de ligar a centrífuga, é necessário fazer o balanceamento dos tubos com as amostras, de
modo que fiquem em pares ao encaixá-los nos orifícios do rotor. A centrifugação deve ter velocidade
(expressa em g ou rpm) e temperatura controladas, além do tempo de rotação, conforme o protocolo
adotado. Geralmente, as extrações são conduzidas a 4 ºC, com velocidade entre 10 e 12.000 x g.
Existem ainda ultracentrifugações (acima de 50.000 x g) utilizadas para separações diferenciais ou
em gradiente.
Após a centrifugação, o sobrenadante (fase líquida) deve ser recolhido com pipeta automática
ou de Pasteur, acondicionado em tubo eppendorf e armazenado em ultrafreezer, até o momento das
análises em espectrofotômetro.
4. Preparo de Soluções
Exemplos de preparo de soluções tampão comumente utilizadas em processos de extração

enzimática.
A) Solução tampão Fosfato de Potássio 50 mM, com pH 7,8 (1 L):

 Fosfato de potássio monobásico (KH2PO4, PM = 136,09 g L).
1M à 136,09 g L X = 6,8045 g L-1
50 .10-3 M à X
 Fosfato de potássio bibásico (K2HPO4, PM = 174,18).
1M à 174,18 g L X = 8,7090 g L-1
50 .10-3 M à X
Dissolver os reagentes em 500 mL de água destilada, aferir o pH desejado e somente depois
completar para o volume final de um litro com água destilada.
B) Solução tampão de NaOH (PM = 40) a 0,05 M (600 mL).

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Podemos obter através de duas formas:

 Obter o número de moles:
Litros x M à 0,6 x 0,05 = 0,03 moles de NaOH.
Número de moles x PM à 0,03 x 40 = 1,2 g.
 Utilizar os cálculos pela regra de três:
40 (PM) à 1 M x = 0,05 x 40/1 = 2 g L-1
x à 0,05 M ou 1,2 g em 0,6 L
C) Expressar a concentração da solução de NaOH (0,05 M, 600 mL) em porcentagem peso volume
(% p/v):
% p/v = peso em gramas de um soluto por 100 mL de solução, ou seja:
2,0 g.L-1 = 0,2 g.100 mL-1 = 0,2% (p/v).
D) Solução extratora para polifenoloxidades a 0,2 M, com pH 6,7 (1 litro):
KH2PO4 monobásico (solução ácida), PM = 136,09 g (pH 5)
1 molar à 139,09 g x = 27,218 g
0,2 m à x
Para preparar 100 mL:
27,218 g à 1000 mL x = 2,72 g

x’ à 100 mL
5. Referências Bibliográficas
PASSOS, L.P. Métodos analíticos e laboratoriais em fisiologia vegetal. Coronel Pacheco:

EMBRAPA-CNPGL, 1996, 223p.
SKOOG, D.A. et al. Fundamentos de química analítica. 8ª ed. São Paulo: Cengage Learning, 2010,
999p.
TORRES, B.B. Elementos de enzimologia. In: BORZANI, W. et. al. (Coords.) Biotecnologia
industrial. v. 1. Edgar Blücher, 2001, 151-176 p.

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Capítulo 2
Aminoácidos e Proteínas: estrutura química,
função e propriedades
Thalita Cristina Marques Cervezan
Aline Cristina Rabonato
Enrique Alonso Zuñiga
Juan Plutarco Munguía-López
Fernando Broetto
1. Aminoácidos
O aminoácido é uma molécula orgânica composta por átomos de carbono, hidrogênio,

oxigênio, nitrogênio e, em alguns casos, o enxofre. Os aminoácidos são formados pela junção do
grupo amina (NH2), grupo carboxílico (COOH), hidrogênio, carbono α e um radical característico de
cada aminoácido (Figura 1).
Figura 1. Estrutura molecular de um aminoácido simples
Através de ligações peptídicas sequenciadas de vinte aminoácidos, as proteínas são formadas.

Esses vinte aminoácidos principais possuem características estruturais em comum, pois há a presença
de um carbono central α, quase sempre assimétrico, ligados a um grupo carboxila, um grupamento
amina e um átomo de hidrogênio.

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O radical representado esquematicamente por “R” é o responsável pela diferenciação entre os

aminoácidos e por suas características – polaridade e grau de ionização em solução aquosa. Quanto
à polaridade do radical “R” pode-se classificar em apolar, polar não carregado e polar carregado
dividido em duas subclasses: carregado positivamente e carregado negativamente.
Os aminoácidos com ramificação apolar possuem o radical “R” geralmente formado
exclusivamente por carbono e hidrogênio – grupamento alquila. São oito e caracterizados como
hidrofóbicos: Alanina (CH3–CH(NH2)–COOH); Valina (CH3–CH (CH3)–CH(NH2)–COOH); Leucina
(CH3(CH2)3–CH2–CH(NH2)–COOH); Isoleucina (CH3–CH2–CH(CH3)–CH(NH2)–COOH); Prolina
(–CH2–CH2–CH2 - ligando o grupo amino ao carbono α); Fenilalanina (C6H5–CH2–CH(NH2)–COOH);
Triptofano (R aromático - CH(NH2)–COOH); Metionina (CH3–S–CH2–CH2–CH(NH2)–COOH).
Os aminoácidos com ramificação polar não carregado apresentam o radical “R” contendo
hidroxilas, sulfidrilas e grupamentos amida. São sete e caracterizados como hidrofílicos: Glicina
(H–CH(NH2)–COOH); Serina (OH–CH2–CH(NH2)–COOH); Treonina (OH–CH(CH3)–CH(NH2)–
COOH); Cisteína (SH–CH2–CH(NH2)–COOH); Tirosina (OH–C6H4–CH2–CH(NH2)–COOH);
Asparagina (NH2–CO–CH2–CH(NH2)COOH); Glutamina (NH2–CO–CH2–CH2–CH(NH2)–COOH).
Os aminoácidos com radical “R” polar carregado são divididos em duas subclasses: “R”
carregado positivamente e “R” carregado negativamente. O radical “R” carregado positivamente
são aminoácidos diamino e monocarboxílicos, sendo três: Lisina (NH3–CH2–CH2–CH2–CH2–
CH(NH3)–COOH); Arginina (HN=C(NH2)–NH–CH2–CH2–CH2–CH(NH2)–COOH); Histidina (H–
(C3H2N2)–CH2–CH(NH2)–COOH). Os aminoácidos com ramificação “R” carregado negativamente
são aminoácidos monoamino e dicarboxilicos, sendo dois: Ácido Aspártico (HCOO–CH2–CH(NH2)–
COOH); Ácido Glutâmico (HCOO–CH2–CH2–CH(NH2)–COOH).
2. Propriedades Químicas e Elétricas
Todos os aminoácidos são anfóteros, isto é, contêm em sua estrutura pelo menos um grupo
ácido (carboxilico) e um grupo básico (α-amino) funcionais que, em solução aquosa, comportam-se
como ácido e como base.
Os aminoácidos podem também conter outros grupos facilmente ionizáveis em sua molécula, tais
como: grupamentos amino-carboxilíco, p-hidroxifenil, sulfidrilas, guanidino e imidazol. A estrutura
básica da cadeia polipetidíca implica na união do grupo carboxílico de um aminoácido com o grupo
α-amino de um aminoácido adjacente. O caráter iônico dos polipeptídeos se deve principalmente a
estes grupos ionizáveis adicionais aos grupos terminais α-amino e carboxílicos.
Outra propriedade física dos aminoácidos é o alto ponto de fusão, principalmente em sua fração
carboxílica. Esta é uma característica de compostos cuja rede de moléculas no estado cristalino é
estabilizada por forças eletrolíticas de atração entre grupos de cargas opostas. Estes fatos, bem como
outros pontos de evidência levam a conclusão de que os aminoácidos ocorrem em soluções como íons
dipolares e não como moléculas dissociadas.
Quando um aminoácido é dissolvido em água, pode se comportar como ácido (doador de

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prótons) ou como base (receptor de prótons).

Como ácido: H2N+ - CH2–COO- ßà H+ + H2N–CH2–COO-
Como base: H2N+ - CH2–COO- + H+ ßà H3N– CH2–COO-
O grupamento carboxila ioniza-se em solução aquosa liberando próton, e adquirindo carga
negativa. Por sua vez, o grupamento amina ioniza-se em solução aquosa aceitando próton e adquirindo
carga positiva. Este comportamento depende do pH do meio aquoso em que o aminoácido se encontra.
Em meio ácido, os aminoácidos tendem a aceitar prótons, comportando-se como base e
adquirindo carga positiva, pois, ionizam em seu radical amina. Em meio básico, os aminoácidos
tendem a doar prótons, comportando-se como ácidos e adquirindo carga negativa, ionizam-se em seu
radical carboxila.
Em soluções aquosas de pH neutro, os aminoácidos podem existir em duas formas:
eletricamente neutra e ionizada. Ao dizer que o aminoácido está eletricamente neutro, significa que
o grupo amina está desprotonado (-NH2) e o grupo carboxila protonado (-COOH). Em sua forma
ionizada, o grupo amina se encontra protonado (-NH3+) e o ácido carboxílico desprotonado (-COO-),
denominando-se esta forma de zwitteríon - molécula globalmente neutra em termos de carga elétrica,
mas possui cargas locais devido à presença de grupos ionizados.
O valor de pH onde as cargas elétricas do aminoácido de igualam e se anulam chama-se ponto
issoelétrico, ou pH isoelétrico (pI). O ponto isoelétrico é quando o pH em que a carga líquida da
molécula é igual a zero. Em um pH abaixo do valor de pI, os aminoácidos e proteínas apresentam
carga líquida positiva. Em um valor de pH acima do pI, os aminoácidos e proteínas encontram-se com
carga líquida negativa.
3. Curva de Titulação de um Aminoácido
Ao titular um aminoácido é possível determinar o efeito do pH sobre a sua estrutura devido

aos processos de desprotonação. Além disso, pode-se determinar a reatividade das cadeias laterais
dos aminoácidos e a concentração de uma solução através de uma solução padrão de concentração
conhecida. Ao titularmos um aminoácido monoamino e monocarboxilico, temos o seguinte
comportamento.
Ponto 1: Aminoácido totalmente protonado

Ponto 2: [+NH3CHRCOO-]
Ponto 3: Ponto isoelétrico = íon dipolar ou zwitterion (molécula neutra)
Ponto 4: [NH2CHRCOO-]
Ponto 5: Aminoácido totalmente desprotonado

15
3.1 Prática: Titulação de um aminoácido
3.1.1 Procedimento prático
O procedimento prático estudado nesse capítulo irá verificar o comportamento de um aminoácido

essencial em contato com um ácido ou uma base. No aminoácido em questão será determinado os
valores de pK’ e do pI, aplicando-se a equação de Handerson-Haselbach.
 Cálculos envolvidos:
pH = pK’ + log [doador prótons] / [receptor de prótons]
O pI de um aminoácido pode ser calculado pela seguinte equação:
pI = (pKa1 + pKa2) / 2
 Materiais e Reagentes
- Potenciômetro; Bureta de 25 mL; Agitador magnético; Pipetas; Béquer; Soluções: NaOH 0,1 mol
L-1; glicina 0,1 mol L-1; fenolftaleína 5% m/v.
 Procedimento:
Efetua-se a titulação do aminoácido: Volume de 10 mL da solução de glicina 0,1M é transferido
para um Becker de 100 mL; Adiciona-se 10 mL de HCl 0,1 mol L-1 e 3 gotas de fenolftaleína 5%
m/v. Após homogeneização e com o auxílio de uma bureta, titular a solução com NaOH 0,1 mol L-1,
anotando-se o valor de pH aferido no potenciômetro, a cada acréscimo de 1 mL da solução alcalina.
Acrescentar NaOH até que ocorra a viragem completa do corante e o valor de pH não sofra mais
alteração significativa. Distribuir os valores conforme o gráfico (Figura 2) a seguir: (x=mL de NaOH
adicionados; Y=pH)
pKa2
pI
pKa1
Figura 2. Gráfico obtido pela titulação de glicina 0,1M com NaOH 0,1M

16
Resultados e Discussão:
pK1 = (1,95+4,15) à pK1 = 3,05
2
pK2 = (8,45+11,63) à pK2 = 10,04
2
pI = (3,05+10,04) à pI = 6,55
2
O primeiro pH aferido após a adição do NaOH foi de 1,95 (íons protonados), permanecendo
com certa constância até 4,15. À medida que se tem NaOH adicionado, o pH aumenta até o momento
em que o grupo carboxila (COOH-) perde seu próton.
Na alteração do pH 4,15 para 8,45 há a formação de um ponto de inflexão, no qual ocorre a
remoção completa do próton do grupo amina e inicia-se a remoção do próton do grupo amino (NH3+).
Ao final da titulação, com pH de 11,63, tem-se calculado o segundo ponto pK’. O ponto isoelétrico
(pI) calculado pela média aritmética dos valores de pKa obtidos foi de 6,55.
Ao serem comparados com os dados da Tabela 1, com os valores obtidos pela titulação, percebe
que o perfil encontrado do aminoácido analisado se assemelha com os dados de glicina já tabelados.
4. Proteínas
As proteínas são as moléculas mais abundantes e funcionais, presentes em praticamente todos

os processos vitais. Apresentam uma incrível diversidade de funções, embora todas compartilhem a
característica estrutural comum de serem constituídos por aminoácidos.
Quando as proteínas são aquecidas em um meio aquoso, ácido ou básico, as ligações amida
sofrem hidrólise liberando os aminoácidos constituintes, cuja identificação implica no conhecimento
de suas propriedades físico-químicas. A hidrólise também pode ser realizada através de leveduras que
utilizam enzimas para a quebra de molécula. A invertase é comumente usada para quebrar a molécula
de sacarose do substrato para absorver a molécula de glicose e frutose que são menores e transformá-
las em etanol.
Invertase é encontrada em um grande número de tecido de plantas e são frequentes os relatos
que a associam com a parede celular. Em muitos tecidos de reserva tais como raízes e tubérculos de
batata, chicória, cenoura e beterraba, a atividade da invertase é baixa em tecidos normais. Entretanto,
quando esses tecidos são cortados em discos e lavados em água estéril ou tampão, há um grande
aumento na sua atividade.
A análise da atividade da invertase contribui significativamente para a formulação de hipóteses
relativas à cinética da interação entre a enzima e seu substrato. Dos dados obtidos da cinética da
invertase Michaelis e Mentem propuseram que uma molécula enzimática reage com seu substrato
para formar o complexo enzima-substrato.

17
4.1 Prática: Determinação de proteínas solúveis totais em tecido vegetal
O método a ser utilizado emprega um corante, Coomassie Brilliant Blue G-250, o qual sendo
carregado negativamente liga-se com cargas positivas da cadeia polipeptídica. O corante apresenta em
dois picos de absorção: vermelho (Amax.= 465nm) e azul (Amax.= 595 nm). Apesar da predominância
da forma vermelha de absorção, a mesma converte-se para a forma azul, quando o corante reage com
a proteína. A reação é altamente reproduzível e rápida, completando-se em cerca de dois minutos com
estabilidade de cor por até uma hora. No entanto, as leituras devem ser efetuadas após 15 minutos de
incubação.
A) ENSAIO
Obtenção do extrato*
 Macerar 500 mg de tecido em 2 mL de tampão fosfato 0, 1 M, pH 6.7
 Centrifugar por 10 min (4° C) a 5000 rpm e coletar o sobrenadante (extrato bruto);
 Pipetar três alíquotas de 100 µL (triplicata) de extrato* + 5 mL do reativo de Bradford (agitar);
Ler a absorbância em 595 nm após 15 minutos.
 Comparar a leitura obtida em espectrofotômetro com o padrão (BSA), através da equação da
reta.
 Determinar poucas amostras de cada vez para que as leituras não demorem.
 Utilizar preferencialmente cubetas de vidro ou plástico (metacrilato) e não de quartzo para
evitar a adesão do complexo corante-proteína nas mesmas.
B) PREPARO DAS SOLUÇÕES

Comassie Brilliant Blue G-250
 Dissolver 100 mg do corante em 50 mL de etanol 95%;
 Adicionar 100 mL de ácido fosfórico 85% e misturar bem em becker;
 Diluir até 1 litro em balão volumétrico;
 Filtrar 2 vezes após completa dissolução e armazenar em frasco escuro em geladeira.
Albumina de Soro Bovino - BSA (1 mg ml-1)
 Dissolver 0,88 g de NaCl (PM = 58,45) em 100 mL de H2O para sol. salina 0,15 M;
 Dissolver 100 mg de proteína em 100 mL de solução salina 0,15 M
 Armazenar em freezer.

18
C) CURVA PADRÃO
Preparar uma solução estoque de BSA (Albumina de Soro Bovino) em concentração final de 1
mg mL-1. Ver procedimento no item B.
Identificação Componentes do ensaio

Tubo No Concentração µg BSA µL H2O µL Comassie brilliant blue (mL)
1 0 0 100 5.0
2 10 10 90 5.0
3 20 20 80 5.0
4 30 30 70 5.0
5 40 40 60 5.0
6 50 50 50 5.0
7 60 60 40 5.0
8 70 70 30 5.0
9 80 80 20 5.0
10 90 90 10 5.0
11 100 100 0 5.0
A figura abaixo representa uma curva padrão típica, obtida a partir de BSA:
Figura 3. Curva padrão – BSA.
Hayashi, F. Y.; César, M. C. - Relatório 1: Titulação de Aminoácidos. Bioquímica Fundamental-

ZAB0361. UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO, Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Ali-
mentos, Departamento de Ciências Básicas, Pirassununga – SP, Maio/2011.
Recife, J. S. - Bioquímica Vegetal. Engenharia Agrícola e Ambiental – EAA1, Egídio Bezerra Neto,
Universidade Federal Rural de Pernambuco, Abril/2010.
Bradford, M.M. A rapid and sensitive method for the microgram quantities of protein utilizing the
principle of protein-dye-binding. Analytical Biochemistry, 72: 248-254, 1976.

19
Capítulo 3
Atividade de lipoxigenases
Érica Amanda de Barros
Amanda Cristina Esteves Amaro
Fernando Broetto
Introdução
As lipoxigenases (LOX) são isoenzimas que estão amplamente distribuídas em plantas e animais
superiores. Elas catalisam a adição do oxigênio molecular ao sistema pentadieno dos ácidos graxos
poliinsaturados, formando hidroperóxidos dos ácidos graxos correspondentes que se decompõem em
ácidos, aldeídos e cetonas de cadeia curta, (AXELROD et al., 1981; LEONI et al., 1985; MACK et
al., 1987; VICK; ZIMMERMAN, 1987; BUNKER et al., 1995).
Durante um processo de estresse, ocorrem danos físicos às células vegetais, em razão disso, as
lipoxigenases (linoleato: oxigênio oxido-redutase - EC 1.13.11.12) utilizam ácido linolênico (C18:3)
ou ácido linoléico (C18:2) como substrato, tranformando-o em hidroperóxidos do ácido graxo, que
são rapidamente metabolizados para formar vários produtos.
Dentre esses, estão a traumatina, envolvida na resposta a ferimentos e na indução da divisão
celular e formação de calos (SIEDOW, 1991), o ácido jasmônico, associado à ativação de genes que
codificam para a síntese de proteínas de reserva e inibidores de proteases (MELAN et al., 1993), os
aldeídos voláteis e oxiácidos, que causam efeito inibitório sobre o crescimento de fungos patogênicos
(VAUGHN; GARDNER, 1993), insetos e protozoários (CROFT et al., 1993). Esses aldeídos
possivelmente agem também como um sinal químico na atração do inimigo natural do herbívoro para
a planta danificada (PARÉ; TUMLINSON, 1997).
Foram isoladas quatro isoenzimas, as lipoxigenases L-1, L-2, L-3a e L-3b. Estas isoenzimas
diferem entre si em vários aspectos da ação catalítica, tais como pH ótimo de ação, especificidade
para substrato, região-especificidade, produtos primários e secundários formados e valor de Km. As
isoenzimas L-3a e L-3b são muito similares em suas propriedades e, para fins analíticos, podem ser
consideradas idênticas e caracterizadas como L-3 (AXELROD et al., 1981).
As lipoxigenases são proteínas globulares, solúveis em solução salina e consistem em uma
cadeia polipeptídica simples, de peso molecular (Tabela 1) em torno de 100 Kda (HILDEBRAND;
HYMOWITZ, 1981; AXELROD et al., 1981). São dioxigenases, contendo um mol de ferro
em um grupamento não-heme, por mol de proteína, portanto são denominadas metaloproteínas

20
(VLIEGENTHRT et al., 1979). O ferro II oxida-se em ferro III, então é retirado um átomo de
hidrogênio da cadeia carbônica do ácido graxo e este átomo de hidrogênio se oxida a próton. O radical
pentadieno ligado a enzima é convertido em um dieno conjugado que capta o oxigênio. Ocorre então
a liberação de hidroperóxido, iniciando assim uma reação em cadeia (MORETTO; FETT, 1998).
As LOX estão presentes em grande variedade de tecidos animais, como aves, peixes e mamíferos
(GERMAN; KINSELLA, 1985; GROSSSMAN et al., 1988; HSIEH et al., 1988), e estão envolvidas
no passo inicial da biossíntese do ácido araquidônico e de compostos ativos fisiologicamente, como
leucotrienos e lipoxinas (NAVARATNAM et al., 1988; KULKARNI; COOK, 1988). Também em
tecidos vegetais, tais como folhas (alfafa), sementes (cevada, abóbora, oliveira, girassol, milho,
soja), frutos (maçã, tomate), tubérculos (batata). NIELSEN et al. (2003), detectaram e analisaram
compostos de aroma, decorrentes da ação da LOX em alho cortado não branqueado. PÉREZ et al.
(1999) verificaram LOX em morangos. Dentre as plantas, a semente de soja é a fonte mais rica das
enzimas representando cerca de 2% do total de proteínas contidas no grão (AXELROD, 1981).
Os ácidos graxos dos grãos de soja são: os saturados (~15%) palmítico e esteárico; o
monoinsaturado oléico (~24%), e os poliinsaturados, linoléico (~54%) e linolênico (~7%). Portanto,
a soja constitui-se num dos produtos mais susceptíveis a ocorrência da oxidação dos ácidos graxos
(WILSON, 1987).
Os sabores descritos como amargo, adstringente e rançoso, resultantes principalmente da ação
da enzima lipoxigenase limitam o consumo dessa leguminosa. Nos grãos de soja íntegros (secos), o
substrato não está exposto à ação dessa enzima. A reação só ocorre quando os grãos se quebram e
absorvem água (MORAIS; SILVA, 1996).
A atividade da LOX tem sido associada à diminuição da qualidade de vários produtos, e desperta
o interesse de muitos cientistas, devido ao seu papel na gênese de compostos voláteis e na formação
de radicais livres responsáveis por atacar moléculas de vitaminas, compostos fenólicos e proteínas
(DONNELLY; ROBINSON, et al., 1995).
1. Material utilizado
 Pistilo e graal; Tubos Falcon; Pipeta automática; Eppendorf; Cubeta de quartzo;

Espectrofotômetro; Balança analítica; Grãos de soja cultivares: BRS-213, BRS-258 e Embrapa
48.
2. Preparo de Soluções
 Tampão Tris-HCl 50 mM, CaCl2 20 mM, pH 8,0; Solução-estoque de linoleato de sódio 10

mM; Tampão fosfato 50,0 mM, pH 6,5.

21
3. Procedimento
Para extrair a enzima dos grãos macerou-se 20 mg da amostra com 2 mL de tampão Tris-HCl
50 mM, CaCl2 20 mM, pH 8,0, a solução macerada foi transferida para tubos falcon e centrifugada a
5.500 rpm por 10 minutos, à 4 °C. O sobrenadante (extrato enzimático) obtido da centrifugação foi
pipetado para eppendorf.
A atividade de lipoxigenases (LOX) sobre o ácido linoléico foi determinada segundo o método
descrito por Axelrod et al. (1981), o qual se baseia no aumento da absorbância a 234 nm, resultante
da formação de um sistema de duplas ligações conjugadas no hidroperóxido formado.
A solução-estoque de linoleato de sódio 10 mM foi preparada adicionando a um erlenmeyer
envolvido por papel alumínio, contendo aproximadamente 10 mL de água deionizada, previamente
fervida, 78 μL de ácido linoléico (~99%) e 90 μL de Tween 20 (SIGMA). Em seguida, homogeneizou-
se a solução, succionando com auxílio de uma pipeta automática e tomando-se o cuidado para não
formar bolhas. Para o clareamento da solução, foram adicionadas gotas de solução de hidróxido de
sódio 0,5 N. Após o clareamento, a solução foi transferida para um balão volumétrico de 25 mL
coberto por papel-alumínio, após a aferição do volume. A solução-estoque de linoleato de sódio foi
armazenada em tubos eppendorf, envolvidos em papel alumínio e armazenados em freezer a – 20ºC.
Para as análises das atividades de LOX, adicionou-se 10 μL de extrato enzimático e 40 μL da
solução-estoque de linoleato de sódio (substrato) em 500 μL de tampão fosfato 50,0 mM, pH 6,5.
A velocidade da reação foi determinada de 20 em 20 segundos, a 234 nm, por um período de 60
segundos. Sob as mesmas condições, procedeu-se com o branco, que consistiu apenas da mesma
quantidade de substrato e tampão.
Os resultados foram expressos em mol/min/mg de proteína a partir da expressão:
Velocidade da reação: ∆E x VE x FD x VC
ε
∆E = variação da absorbância a 234 nm;

VE= volume do extrato enzimático;
FD= fator de diluição;
VC= volume utilizado na cubeta;
ε = 25000 M-1 cm-1 (coef. de extinção molar dos hidroperóxidos do ácido linoléico a 234 nm).
Atividade específica é o número de unidades de enzima por miligrama de proteína (LEHNINGER,
1995). Assim, os valores de atividade específica foram obtidos dividindo-se os valores de atividade
pela concentração de proteínas em que a velocidade da reação/ mg de proteína presente na amostra.
A quantificação do teor de proteína no extrato enzimático foi realizada pelo método de
BRADFORD (1976), onde a concentração de proteína solúvel presente nos extratos foi determinada
em triplicata, com albumina de soro bovino (BSA) como proteína padrão. A curva padrão foi obtida
através de uma solução de BSA em concentração final de 1mg mL-1.

22
4. Resultado e Discussão
Os resultados médios obtidos para os três cultivares de grãos irradiados diferiram

significativamente dos resultados encontrados para os grãos in natura (Controle) em relação à
atividade de LOX, provando que as dosagens de irradiação utilizadas nos grãos induziram queda da
atividade da lipoxigenase.
Era esperado que os resultados da atividade de LOX do cultivar BRS-213 fossem menores
quando comparados aos resultados encontrados para as cultivares BRS-258 e Embrapa 48, pois a
BRS-213 é um cultivar modificado, livre da LOX, demonstrando valores médios distantes entre eles.
Porém, o cultivar BRS-213 não é livre totalmente de lipoxigenases, apresentando ainda uma atividade
residual.
Tabela 1. Atividade específica de lipoxigenases-LOX (nmol. min.-1mg de proteína-1) em três cultivares de

soja (Controle) e em grãos irradiados.
Atividade de LOX
Dosagem (*kGy) Cultivares
BRS-213 BRS-258 EMB-48
Controle 0,0125a 1,6883c 1,5068c
2,5 0,0261b 0,9911b 0,8565b
5 0,0170a 0,9613b 0,4696a
10 0,0234b 0,3327a 0,2826a

Médias seguidas de letras diferentes na coluna indicam diferença significativa pelo teste de Tukey ao nível de
5% de probabilidade. *kGy= unidade de dose de irradiação ionizante.
Em relação ao controle, os resultados médios encontrados para os cultivares BRS-258 e Embrapa

48 foram próximos. Os valores obtidos para o cultivar BRS-258 irradiado a 10 kGy demonstrou
diferença significativa dos valores expressos para as outras dosagens e o controle. Já o cultivar 48 não
apresentou diferença entre as dosagens de 5,0 e 10,0 kGy, e ambas diferiram da dosagem 2,5 kGy e
do controle. Portanto, pode-se afirmar para os cultivares BRS-258 e EMBRAPA 48 que quanto maior
a dosagem de irradiação maior será a inativação das enzimas lipoxigenases.
AXELROD, B.; CHEESBROUGH, T.M.; LAAKSO, S. Lipoxygenase from soybeans. Methods in
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23
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24
Capítulo 4
Enzimas antioxidativas em pós-colheita de
vegetais
Thalita Cristina Marques Cervezan
Mariana da Silva Caldeira
Fernando Broetto
Introdução
Após a colheita de frutas e hortaliças inicia-se uma série de processos bioquímicos degradativos
que aceleram a senescência, causando perdas de grande parte da produção. Muitas dessas perdas
podem ser atribuídas à ação de enzimas durante a pós-colheita (ZANATTA et al., 2006). Existem
numerosas enzimas oxidativas que promovem alterações nos alimentos. A maioria das reações
metabólicas em frutos e hortaliças é catalisada por enzimas (CHITARRA e CHITARRA, 1990).
Entre elas a polifenoloxidase (PPO), é encontrada praticamente em todos os tecidos vegetais,
resultando na formação de pigmentos escuros, proporcionando mudanças indesejáveis nas
características sensoriais dos produtos. A polifenoloxidase aparentemente se torna envolvida no
metabolismo quando há ruptura da célula e vacúolos com mistura dos seus conteúdos. Isso ocorre
durante a senescência quando a integridade da célula é rompida, ativando a PPO latente (PIMENTA,
2001).
O escurecimento desses alimentos durante o processamento e armazenamento provoca uma
diminuição na qualidade do produto devido á mudança de cor, aroma e sabor, além das propriedades
nutricionais. Essas mudanças são causadas por compostos fenólicos, que são muito encontrados nos
vegetais, sendo os maiores responsáveis pela atividade antioxidante.
O grau de escurecimento nos vegetais está relacionada à divergência na concentração destes
compostos fenólicos, além da quantidade de oxigênio, substâncias redutoras, íons metálicos, pH,
temperatura e atividade de diferentes enzimas oxidativas, especialmente a polifenoloxidase e a
peroxidase. O escurecimento enzimático é causado pela produção de polifenólicos complexos, uma
reação catalisada primariamente pela PPO, produzindo as quinonas reativas.
As polifenoloxidades (PPO ou POF) são enzimas que promovem a oxidação enzimática de
compostos fenólicos, produzindo, inicialmente, quinona que rapidamente condensa, formando
pigmentos insolúveis e escuros, denominados melanina. Essas enzimas podem reagir não-

25
enzimaticamente com aminoácidos, proteínas ou outros compostos.

As polifenoloxidases (PFOs), assim como peroxidases (POX), SOD e outras oxidases, são
enzimas que oxidam substratos orgânicos. Porém, PFOs se diferenciam das demais por catalisarem
uma reação de oxidação dependente de oxigênio de monofenóis. A polifenoloxidase geralmente
é elevada em tecidos infectados e tem grande importância para as plantas, com envolvimento nos
mecanismos de defesa ou na senescência. Em extratos de plantas, a atividade da peroxidase tem
sido encontrada na forma solúvel e também ionicamente ligada à parede celular. Além disso, há um
aumento em sua solubilidade durante o período de maturação e, consequentemente, um aumento na
atividade dessa enzima no pós-climatério.
Figura 1. Mecanismo geral de reação da polifenoloxidase.

Fonte: BELITZ e GROSCH (1997).
1. Procedimentos e Extração de Enzimas em Tecidos Vegetais
1.1 Preparo da amostra para extração
A coleta do material vegetal fresco deve seguir recomendações de coleta citadas no Capítulo 1
deste livro. Após a coleta, a amostra macerada em nitrogênio líquido deve ser quantificada, cerca de
500 mg, e ter seu peso devidamente anotado.

26
1.2 Extração enzimática
Após quantificação, a amostra será colocada em tubo para centrífuga contendo 5 mL da solução
tampão fosfato de potássio pH 6,7 e, posteriormente, acondicionada em centrífuga refrigerada. A
centrifugação deverá ser feita a 10.000 rpm por 5 min na temperatura de 0 - 4ºC.
Ao término da centrifugação, deve-se retirar o sobrenadante e armazena-los em vidros pequenos
sobre refrigeração.
2. Análises
As análises serão realizadas em espectrofotômetro a 395 nm. Para tanto, prepara-se três tubos
de ensaio. O primeiro tubo será o branco da solução, o que irá conter apenas 0,3 mL de solução
tampão e 1,85 mL de catecol 0,1M. O segundo tubo será o branco da amostra, que conterá 0,3 mL
da amostra e 1,85 mL de água deionizada. Para finalizar, o terceiro tubo receberá 0,3 mL da amostra
e 1,85 mL de catecol 0,1 M.
As leituras obtidas pelo equipamento serão anotadas para a determinação da enzima de

polifenoloxidades.
 Cálculo
Para a determinação da enzima de polifenoloxidades, será necessário usar a seguinte fórmula:

POF = (Leitura/30) x 1000
Peso da amostra
Onde:
- 30 é tempo reação
- Leitura: a leitura indicada na fórmula é a subtração da “leitura amostra” com a “leitura do branco da
amostra”. O resultado “x” obtido deverá ser subtraído da “leitura do branco da solução”, determinando
assim o “y”. Veja o exemplo abaixo:
Leitura amostra – Leitura do branco da amostra = x

X – leitura do branco da solução = y
- Peso da amostra: deverá ser determinado conforme o esquema abaixo:

500 mg à 5 mL
X à 1 mL da amostra
X= 0,1
Unidade: µmol catecol transformado . min-1 g-1 massa fresca

27
3. Preparo de Reagentes
A) Solução extratora: Tampão Fosfato de Potássio 0,2 M, com pH 6,7:

Cada enzima tem um pH em que a sua atividade é ótima, no caso das POF esse valor é 6,7. Para
o preparo do tampão é necessário fazer as soluções:
 Fosfato de potássio monobásico (KH2PO4, PM = 136,09).

1,0 M à 136,09 g (pH 5)
0,2 M àx
x = 27,218 g para 1 L de água deionizada ou 2,21 g para 100 mL de água
 Fosfato de potássio bibásico (K2HPO4, PM = 174,18).

1,0 M à 174,18 g (pH 9)
0,2 M àx
x = 34,83 g para 1,0 L de água deionizada ou 3,483 g para 100 mL de água
Para ajustar a solução a um pH mais ácido, coloca-se a solução ácida sobre a solução básica,
ajustando assim, o pH para ácido. Para ajustar a solução a um pH mais básico, coloca-se a solução
básica sobre a solução ácida, ajustando assim, o pH para básico. Para ajustar o pH a 6,7, coloca-se a
solução básica em béquer e acerta o pH com a solução ácida até chegar ao valor 6,7.
B) Preparar solução de Catecol a 0,1M

Deve-se misturar Catecol com Solução tampão de fosfato de potássio pH 6,7
Catecol:
1,0 M à 110 g
0,1M à x
X = 11g para 1,0 L de solução tampão
Para preparar 50 mL:
11 g à 1000 mL
x à 50 mL
x = 0,55 g para 50 mL de solução tampão
C) Solução de Ácido perclórico (HClO4) 2N

Calcular:
C1 x V1 = C2 x V2
2N x 100 mL = 12,1N x X
X= 165,29 mL

28
165,29 mL à 1000 mL
Y à 100 mL
Y= 16,53 mL para 100 mL de água deionizada
4. Resultado
Para compreender melhor a aplicabilidade do processo da enzima polifenoloxidases em pós-

colheita, descreve-se roteiro para sua determinação em goiaba e brócolis.
Conforme o procedimento descrito anteriormente, foram pesadas 500 mg de cada amostra e
extraídas com tampão de extração.
Após realizar as leituras (Tabela 1) no equipamento espectrofotômetro, foi efetuado o cálculo
para determinar o teor da enzima.
Tabela 1. Experimento prático sobre a determinação de enzimas antioxidantes em pós- colheita de vegetais
Leituras em Absorbância
Amostras Branco Branco da amostra Amostra POF
Goiaba 0 0,014 0,050 12,00
Brócolis 0 0,099 0,206 35,67
Essa prática é um exemplo simples para demonstrar através do calculo a atividade da enzima polifenoloxidase.
É perceptível a diferença entre as amostra analisadas demonstrando haver maior atividade nos Brócolis em
relação à Goiaba.
CHITARRA, M. I. F.; CHITARRA, A. B. Pós-colheita de frutas e hortaliças: fisiologia e manuseio.

Lavras: ESAL/ FAEPE, 1990. 320 p.
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2006.

29
Capítulo 5
Enzimas antioxidativas em tecidos
vegetais
Marcos de Oliveira Bettini
Renata Bruna dos Santos Coscolin
Dayanne Fabrício Bressan
Edilson Ramos Gomes
Fernando Broetto
Introdução
O estresse oxidativo em vegetais pode ser definido como o desequilíbrio entre a formação e
a remoção de agentes oxidantes, decorrente da geração excessiva de espécies reativas de oxigênio
(ERO). Segundo Mittler (2002), os agentes oxidantes das ERO são resultantes de uma redução parcial
do oxigênio molecular, podendo estes estar forma de oxigênio singleto 1O2, radical hidroxila OH°-,
ânion superóxido O2 °- e peróxido de hidrogênio H2O2 (Figura 1) (SCANDALIOS, 2005; RESENDE
et al., 2003; MITTLER, 2002).
Fatores como a deficiência hídrica, variações de luminosidade e temperatura, salinidade,
injúrias provocadas por patógenos, uso de herbicidas, entre outros, podem intensificar a formação
dessas espécies aumentando sua concentração no meio celular. O principal ponto de produção das
ERO durante as situações de estresse são as organelas com alta atividade de oxidação metabólica isto
devido ao intenso fluxo de elétrons, exemplo: cloroplastos e mitocôndrias, sendo que nos cloroplastos
a formação das ERO esta relacionada aos eventos fotossintéticos.
Os radicais superóxidos são os primeiros a serem formados, os quais não conseguem atravessar
as membranas biológicas ficando confinados no compartimento onde foram gerados. Em seguida,
haverá a formação da espécie peróxido de hidrogênio que tem a capacidade de atravessar as
biomembranas e se distribuir a partir do local de sua produção (BREUSEGEM et al., 2001). A última
e mais reativa espécie a ser formada é o radical hidroxila (OH.). Esse radical é formado pela redução
do H2O2 por íons metálicos (Fe2+ e Cu2+) e tem grande afinidade por moléculas biológicas em seu
sítio de produção, também apresenta uma meia-vida curta, pois reage rapidamente com moléculas
biológicas sequestrando um átomo de hidrogênio (BREUSEGEM et al. , 2001; NORDBERG e
ARNER, 2001). Portanto todas essas espécies destacam-se pela grande reatividade com biomoléculas
que, por consequência, provocam a lipoperoxidação das membranas celulares (BREUSEGEM et al.,

30
2001), bem como a oxidação de proteínas e quebra na cadeia do DNA (ARGUIRRE et al. , 2005 ;
HAMID et al. , 2002).
Um dos mecanismos que a célula dispõe para dismutar radicais livres produzidos em condição de
DH é a ativação de enzimas antioxidativas, dentre elas a superóxido dismutase (SOD, E.C. 1.15.1.1),
a ascorbato peroxidase (APX, E.C. 1.11.1.11), a catalase (CAT, E.C. 1.11.1.6), peroxidase (POX E.C
1.11.1.7) (MITTLER, 2002).
A enzima superóxido dismutase (SOD, EC 1.15.1.1) são metaloproteínas que catalisam a
dismutação de radicais superóxido a peróxido de hidrogênio e oxigênio. Podem ser detctadas três
classes de SOD diferenciadas de acordo com o metal presente em seu sítio ativo como cofator:
cobre/zinco (Cu/Zn SOD), ferro (Fe-SOD) e manganês (Mn-SOD) e localizadas em diferentes
compartimentos celulares (SCANDALIOS, 2005).
Outra enzima importante no sistema de resposta antioxidativa em plantas é a catalase (CAT;
EC 1.11.1.6), a qual decompõe o peróxido de hidrogênio (H2O2) gerado nos peroxissomos durante a
fotorrespiração (GERBLING et al., 1984), bem como o produto de reação da SOD.
Entre as enzimas degradantes de H2O2, é a única que não consome equivalentes redutores da
célula e que possui um mecanismo muito eficiente para a remoção do peróxido formado em condição
de estresse (SCANDALIOS, 2005).
Essa enzima tem sido descrita como susceptível a fotoinibição e degradação, após sua inativação
por luz, a atividade da catalase é fortemente dependente de uma nova síntese da enzima, como relatado
por Hertwig et al. (1992).
Ânion superóxido Radical hidroxila

Peróxido de hidrogênio
Figura 1. Produção de radicais livres em células.
1. Material e Método
1.1 Processamento do material vegetal para obtenção do extrato bruto.
Processar as amostras para obtenção do extrato (Figura 1), que será obtido através da
ressuspensão do material vegetal (300 mg) em 2,0 mL de tampão fosfato de potássio 0.1 M, pH 6.8,
suplementado com 200 mg de PVPP. Após centrifugação por 10 min. a 10.000 x g, o sobrenadante
será coletado e armazenado em freezer a - 80° C.

31
Figura 1. Procedimento de seleção e maceração do material vegetal
1.2 Atividade da enzima Superóxido Dismutase (SOD; EC 1.15.1.1)
A determinação da atividade da SOD considera a capacidade da enzima em inibir a fotorredução

do NBT (Azul de nitrotetrazólio cloreto). A atividade será determinada pela adição de 50 mL de
extrato bruto a uma solução contendo 13 mM de metionina, 75 mM de NBT, 100 nM de EDTA e 2
mM de riboflavina em tampão fosfato de potássio 50 mM, pH 7,8.
A reação será iniciada pela iluminação dos tubos, em câmara composta por tubos fluorescentes
(15 W), a 25° C. Após 5 minutos de incubação, o final da catálise será determinado pela interrupção
da luz (GIANNOPOLITIS e RIES, 1977). O composto azul formado (formazana) pela fotoredução
do NBT será determinado pela leitura em espectrofotômetro a 560 nm.
Os tubos considerados branco para a análise recebem os mesmos reagentes, porém são mantidos
cobertos com papel alumínio, portanto, abrigados da luz. Uma unidade de SOD é definida como a
atividade da enzima necessária para a inibição de 50 % da fotorredução do NBT. Para o cálculo da
atividade específica da enzima, considera-se a porcentagem de inibição obtida, o volume da amostra
e a concentração de proteína na amostra (mg mL-1).
• Preparo da solução tampão (Fosfato de potássio 50 mM pH 7,8)

Para 1 L de tampão preparar os reagentes e proceder a mistura, controlando-se o pH em
potenciômetro:
KH2PO4 (monobásico, PM = 136,09) = 6,8045 g L
K2HPO4 (bibásico, PM = 174,18) = 8,7090 g L
Após a obtenção do tampão no pH 7,8, o volume deve ser ajustado para 1 L com água destilada.
• Preparo da solução para determinação da SOD (Solução de trabalho)

Para 120 mL de tampão fosfato 50 mM pH7,8 adicionar:
13 mM de Metionina (PM = 149,2) 232,8 mg
75 mM de NBT (PM = 817,6) 7,2 mg

32
100 nM EDTA (PM=380,2): Dissolver 10 mg de EDTA em 0,5 L de água dest. Para a solução,
pipetar 228 mL
2 mM de Riboflavina (diluir por último e manter no escuro PM = 376,4)
Dissolver 10 mg em 500 mL de água destilada 4,48 mL
Obs.: A solução será preparada em Erleinmayer coberto com papel alumínio, para evitar
fotoredução.
• Análise:
Pipetar 50 mL de extrato bruto (amostra)
Pipetar 2,950 mL da sol. de trabalho
1º Tubo em branco - receberá a sol. de trabalho + amostra; deverá estar coberto com papel
alumínio; será utilizado para zerar o espectrofotômetro.
2º Tubo 100% de fotoredução (Controle) - receberá somente a solução de trabalho; deverá

receber luz e será utilizado para determinar a fotoredução total do NBT.
3º Tubo da amostra – receberá a solução de trabalho mais a amostra. Dependendo da atividade

da SOD, na amostra, se determinará a taxa de inibição da fotoredução do NBT.
Após incubação sob luz por 5 min., as absorbâncias serão determinadas a 560 nm.
Ex. para o cálculo: Os tubos sem amostra (controle) apresentam uma taxa de absorbância
média de 0,280 e o tubo com a amostra, uma absorbância em torno de 0,120. utilizando-se a
fórmula , tem-se:
CONTROLE − AMOSTRA
X 100 = % INIBIÇÃO
CONTROLE
Neste ex., tem-se= [(0,280 – 0,120) / 0,280] x 100 = 57,14% de inibição da fotoredução.
Considerando-se que 50 % de inibição de fotoredução representa 1 unidade de SOD,

neste exemplo teríamos (por regra de três) 1,14 U de SOD.
1 Unidade (U) de SOD é definida como a quantidade de enzima requerida para inibir 50 %
da fotoredução do NBT.
Atividade Específica da SOD = U = % de inibição x volume da amostra mL

mg de proteína 50 % x concentração de proteína mg mL

33
1.3 Atividade da enzima Catalase (CAT; EC 1.11.1.6)
A catalase uma hemoproteína (possui o grupo heme) altamente específica, transforma o

peróxido de hidrogênio em água:
Possui o mais alto número de turnover (Kcat) conhecido em enzimas: uma molécula pode
catalisar a decomposição de até 40.000.000 moléculas de peróxido de hidrogênio por segundo.
A atividade da enzima catalase será determinada em espectrofotômetro (240 nm) pelo
monitoramento da variação da absorção do peróxido de hidrogênio, conforme Peixoto et al. (1999).
Para o teste, 50 mL de extrato bruto serão adicionados a 950 mL de um tampão fosfato de potássio
50 mM, pH7,0 suplementado com peróxido de hidrogênio a uma concentração final de 12.5 mM.
A variação da absorção (DE) será calculada em um intervalo de 80 s, sendo a atividade da enzima
calculada utilizando-se um coeficiente de extinção molar e = 39,4 mM-1 cm-1. A atividade específica
(µKat µg Prot-1) da catalase, levou em consideração a concentração de proteína solúvel no teste.
Teste enzimático:
• 50 mL de extrato bruto
• 950 mL of tampão fosfato 50 mM, pH 7.0 (suplementado com 12.5 mM de H2O2 (53.75 mL de
H2O2 (30%) en 100 mL de tampão).
1.4 Atividade da enzima Peroxidase (POD; EC 1.11.1.7)
A peroxidase é uma enzima que possui uma variedade de isoformas e que utiliza diferentes
redutores, se caracteriza também por localizar-se em diferentes compartimentos celulares e por sua
importante função relacionada à biossíntese da parede celular. Utilizam H2O2 ao invés de O2 como
agente oxidante:
+ +
NADH + H + H2O2 à NAD + 2H2O
NADH peroxidase
A atividade da enzima será determinada através da diluição (1:25) de 100 mL de extrato bruto
e adicionados a 4,9 mL de solução tampão fosfato de potássio 25 mM, pH 6,8 contendo 20 mM de
Pyrogallol e 20 mM H2O2. Após incubação por 1 min a reação deve ser paralisada com 0,5 mL de
H2SO4 e a leitura da absorbância feita a 420 nM; A atividade específica (µKat µg Prot-1) da enzima é
calculada usando-se coeficiente de extinção molar de 2,47 mM-1 cm-1 (PEIXOTO et al., 1999).

34
1.5 Atividade da enzima Ascorbato Peroxidase (APX; EC 1.11.1.11)
Para a análise da atividade da enzima APX, inicialmente prepara-se uma solução de trabalho
contendo uma alíquota de 100 mL de extrato bruto com 2,9 mL de tampão fosfato de potássio 50 mM,
pH 6,0 (volume final de 3,0 mL). A esta solução acrescenta-se ascorbato e peróxido de hidrogênio,
em concentração final de 0.8 e 1,0 mM, respectivamente. A determinação da variação da extinção (-),
é efetuada a 290 nm, sendo que a atividade específica da enzima (µKat µg Prot-1) deve ser calculada
a partir de um coeficiente de extinção molar de 2,8 mM-1 cm-1 (KOSHIBA, 1993).
1.6 Peroxidação de Lipídeos
Homogeneizar 200 mg de folhas em 4 mL de tampão TCA (1% w/v); Filtrar o homogenato

em cheesecloth (4X) ou 2X papel de filtro; centrifugar por 15 min a 12.000 x g; Pipetar 1 mL do
sobrenadante + 3 mL de ácido tiobarbitúrico 0,5 % (w/v) em TCA 20% (w/v); Incubar a 95° C por 60
min em dubnoff; Transferir os tubos para banho de gelo (para parar a reação); Centrifugar novamente
os tubos a 9.000 x g por 10 min; Ler os valores de absorbância a 532 nm e 660 nm (para subtrair,
isolando-se interferentes).
A atividade será calculada, utilizando-se um e = 155 mM-1 cm-1
BROETTO, F.; LÜTTGE, U.; RATAJCZAK, R. Influence of light intensity and salt-treatment on
mode of photosynthesis and enzymes of the antioxidativo response system of Mesembryanthemum
crystallinum. Functional Plant Biology, v.29, p.13-23, 2002.
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JENKS, M. A., HASEGAWA, P. A.; Plant Abiotic Stress. Oxford: Blackwell, 270 p., 2005.
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MELO, G. M. O eu-estresse na micropropagação da cana de açucar: variáveis bioquímicas e
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da UNESP, Botucatu, 93p, 2005.

35
Capítulo 6
Atividade da Nitrato Redutase
Amanda Cristina Esteves Amaro
Érica Amanda de Barros
Marco Antonio Castillo Campohermoso
Fernando Broetto
Introdução
O nitrogênio está entre os principais elementos minerais, pois vem logo depois do C, O e H
como componente de biomassa. A energia e a estrutura molecular necessária para a incorporação do
nitrogênio provêm do metabolismo dos carboidratos, o qual depende da fotossíntese, e essa, por sua
vez, depende dos compostos contendo nitrogênio, como, por exemplo, a clorofila, criando, assim, um
ciclo de interdependência (LARCHER, 2006).
A assimilação de nitrogênio é o segundo maior processo metabólico nas plantas superiores,
sendo superado apenas pela fixação fotossintética do CO2. As plantas absorvem o nitrogênio do solo
nas formas de nitrato e amônio, sendo que o nitrato é a principal forma de nitrogênio inorgânico
disponível para as plantas, e sua absorção depende do pH na rizosfera, sendo que, sob pH baixo, a
absorção de nitrato é mais prejudicada que a de amônio (BUCHANAN et al., 2000).
No citoplasma das células, depois de o nitrato (NO3) ser absorvido pelas raízes das plantas, o
primeiro passo é a sua redução para nitrito (NO2), reação essa catalisada pela enzima nitrato redutase
(NR) (LARCHER, 2006).
A forma mais comum da enzima nitrato redutase usa, durante a redução de nitrato para nitrito,
o NADH como doador de elétrons. No entanto, em tecidos não clorofilados pode utilizar tanto o
NADH, quanto o NADPH (YANG e MIDMORE, 2005).
NO3 + NADH + H+ NO2 + NAD+ + H2O

(Nitrato) (Nitrato Redutase) (Nitrito)
A enzima nitrato redutase (NR) é formada por duas subunidades idênticas com três grupos
prostéticos cada (flavina adenina dinucleotídeo – FAD, heme e complexo formado por molibdênio,
mais uma molécula orgânica chamada pterina) presente no citoplasma (TAIZ e ZEIGER, 2009).

36
Depois da redução do nitrato para nitrito, ele é transportado rapidamente do citosol para o
interior dos cloroplastos (em tecidos clorofilados) e plastídeos (em tecidos aclorofilados), onde será
reduzido à amônia pela enzima nitrito redutase (NiR), usando ferredoxina reduzida como doadora de
elétrons; esse transporte deve ser rápido, pois o nitrito é um íon altamente reativo e potencialmente
tóxico para a célula. A ferredoxina reduzida é proveniente do transporte de elétrons da fotossíntese nos
cloroplastos e do NADPH formado na rota da oxidação das pentose-fosfato nos tecidos aclorofilados
(YANG e MIDMORE, 2005; TAIZ e ZEIGER, 2009).
Em seguida, esse amônio é incorporado em moléculas orgânicas, como aminoácidos e
nucleotídeos, por meio da ação conjunta das enzimas glutamina sintetase (GS) e glutamato sintase
(GOGAT) (LARCHER, 2006).
A nitrato redutase é rapidamente produzida, de acordo com as necessidades da planta, sendo
que o nitrato, a luz e os carboidratos interferem na tradução e transcrição (TAIZ e ZEIGER, 2009).
A atividade da nitrato redutase muda de acordo com a fase da vida da planta; assim, possui
sua maior atividade em órgãos de crescimento, durante a fase jovem, pois estes requerem grande
quantidade de nitrato. A citocinina também estimula a produção de nitrato redutase, além de ser
regulada pelas alternâncias entre luz e escuro (LARCHER, 2006).
As alterações diárias na fotossíntese interferem na expressão e atividade da nitrato redutase,
variando de acordo com o dia e com a noite, sendo que, geralmente, possui um pico de produção
no final da noite e nas primeiras horas do dia. Para um grande número de espécies, mesmo se elas
forem colocadas em condições de luz constante, as oscilações circadianas da atividade da nitrato
redutase permanecerão por aproximadamente 24 horas, indicando que esse ritmo é endógeno (YANG
e MIDMORE, 2005).
1. Material e Método
 Fosfato de potássio dibásico (K2HPO4) PM 174,18;
 Fosfato de potássio monobásico (KH2PO4) PM 136,09;
 N-propanol, também conhecido como álcool iso-propílico ou iso-propanol ou 2-propanol PM
60,10;
 N-(1-napthy) ethelenediamine dihydrochloride PM 259,17;
 Ácido Clorídrico (HCl);
 Sulfanilamida PM 172,21;
 Nitrito de sódio NaNO2.
1.1 Preparo das soluções
Tampão fosfato de potássio 0,1 M pH 7,0
• Fosfato de potássio dibásico (K2HPO4) PM = 174,18g

37
1 mol L-1 ----------------- 174,18g

0,1 mol L-1 -------------- X
X = 17,418g em 1 L de H2O destilada
• Fosfato de potássio monobásico (KH2PO4) PM = 136,09g

1 mol L-1 ----------------- 136,09g
0,1 mol L-1 -------------- X
X = 13,609 g em 1 L de H2O destilada
KH2PO4
Acrescentar a solução de KH2PO4 à solução de K2HPO4
até atingir pH final de 7,0. Completar o vol. para 1 L
K2HPO4
 N-propanol (1%)
Para preparar 50 mL de solução:
Pipetar 500 µL de N-propanol em um balão e completar para 50 mL com água destilada.

Tampão de extração
2,527 g de KNO3
2,5 mL da solução de N-propanol
Dissolver no tampão fosfato de potássio até atingir 250 mL em balão volumétrico.
 Solução N-Naftil 0,02%
Dissolver 10 mg de N-(1-napthy) ethelenediamine dihydrochloride em água destilada completando o

volume final para 50 mL.
 Solução de sulfanilamida 1% (Massa/Volume) em HCl 1,5N
• HCl 1,5N
Como: densidade=1,19 g mL-1 (T=37%) PM: 36,48
Então: em 1 mL de solução de HCl: 1,19 X 0,37 = 0,4403 g de HCl em mL do reagente.
NHCl = 0,4403/36,48 = 0,01207
M = 0,01207/ 1,0 X 10-3 L = 12,07 Molar

38
Portanto para preparar 1,0L de uma solução a 1,5N

N1 x V1 = N2 x V2
12,07 x V1 = 1,5 x 1,0
V1 = 0,1242 L de HCl
Colocar 0,1242 L de HCl em balão volumétrico e completar para 1L com água destilada
Para preparar 100 mL de solução de sulfanilamida:

Acrescente 12,4 mL de HCl em 87,6 mL de água destilada
Dissolva 2 g de sulfanilamida
Cuidado:
Soluções concentradas de ácido clorídrico (HCl) são corrosivas e podem causar queimaduras
graves. O vapor é extremamente irritante para a pele, olhos e sistema respiratório. O preparo dessa
solução deve ser feita dentro de uma capela ventilada; Ao diluir ácidos, sempre adicione o ácido à
água, e não o contrário.
1.2 Teste enzimático
 Cortar 200 mg de segmentos foliares, com auxílio de um estilete ou tesoura (Obs.: as plantas
deverão estar iluminadas pelo menos por 2 horas, para a correta ativação da NR);
 Colocar os segmentos em tubos de ensaio, acrescentar 10 mL do tampão de extração e tampar
com a rolha especial para infiltração à vácuo (Figura 1);
 Incubar à vácuo: 3 ciclos de duração de 2 minutos, com intervalo de 1 minuto entre eles. Para
verificar se esta ocorrendo a correta infiltração verifique se há formação de bolhas na beirada
das folhas. Além disso, não deixe que as folhas se depositem no fundo, dê pequenas batidas
no fundo para que elas subam.
 Incubar em banho-maria a 30°C, com agitação e no escuro por 1 hora;
 Coletar 1 mL da solução dos tubos de ensaio e transferir para tubos de ensaio limpos;
 Acrescentar 1 mL da solução de sulfanilamida e 1 mL da solução de N-Naftil
 Incubar em banho-maria a 30°C, com agitação e no escuro por 15 minutos;
 Ler em espectofotômetro a 540 nm.

39
Figura 1. A) Infiltração à vácuo; B) Detalhe da formação de bolhas na beirada das folhas, indicando que esta
ocorrendo a infiltração
Branco do espectrofotômetro: Deve ser feito o mesmo procedimento da amostra, no entanto o

tampão de extração deve ser substituído pelo mesmo tampão sem adição de KNO3.
Dicas:
- Os segmentos foliares devem ser cortados com auxílio de uma tesoura ou gilete, sendo que os
segmentos devem ser os menores e mais finos possíveis.
- Para deixar os tubos de ensaio no escuro tampe o banho-maria com sua tampa própria ou com
auxílio de papel alumínio.
- Não lave as vidrarias com detergente, pois esses podem conter nitrito e, assim, alterar os seus
resultados. O ideal é ferver as vidrarias antes de utilizá-las.
1.3 Curva padrão de nitrito (NO2)
 Solução estoque de 10 mM NaNO2

69 mg de nitrito de sódio (NaNO2)
Dissolver em água destilada até atingir o volume de 100 mL.
 Solução de Nitrito para a curva padrão

Pipetar 1,25 mL (ou 1250 µL) da solução estoque de NaNO2 e completar com água destilada para um
volume final de 500 mL.

40
Volume da solução de Volume de água Concentração final de NO2

Tubo
nitrito (mL) destilada (mL) (nmol)
0 0 10 0
1 1 9 25
2 2 8 50
3 4 6 100
4 6 4 150
5 8 2 200
6 10 0 250
Em seguida proceder a incubação exatamente como apresentado na Técnica (item 1.2) a partir
da primeira incubação em banho–maria. Com os resultados das leituras de concentração de nitrito,
organizar os dados em planilha, para calcular a atividade da NR nos segmentos foliares, com unidade
final em nM NO2 h-1 g-1 MF.
JAWORSKI, E.G. Nitrate reductase assay in intact plant tissues. Biochemical and Biophysical
Research Communications. v.43, p.1274-1279, 1971.

41
Capítulo 7
Análise de proteínas por Eletroforese Nativa
Mariana da Silva Caldeira
Marcos de Oliveira Bettini
Dayanne Fabrício Bressan
Fernando Broetto
Introdução
Eletroforese em gel é uma técnica de separação de moléculas que envolve a migração

de partículas em um determinado gel durante a aplicação de uma diferença de potencial (Figura 1). Esta
técnica é normalmente utilizada para separar proteínas, moléculas de DNA e moléculas de RNA. As
moléculas são separadas de acordo com a massa molecular, carga e conformação.
Figura 1. Esquema do sistema de eletroforese
O gel (suporte para a migração eletroforética) pode ser de acetato de celulose, gel de agarose,
gel de poliacrilamida, entre outros. Os géis de poliacrilamida são comumente utilizados na separação
de proteínas em virtude de ser quimicamente inertes, facilidade de coloração com nitrato de prata
e corante azul de Coomassie (corantes como esses coram totalmente a agarose impossibilitando
a identificação das espécies no eletroforetograma), os poros são facilmente ajustáveis através do
controle de acrilamida e bis-acrilamida que são os polímeros que formam o gel.
Géis de poliacrilamida são formados por copolimerização de acrilamida e Bis-acrilamida (Bis)
na presença de persulfato de amônia e tetrametiletilenodiamina (TEMED) ou riboflavina e TEMED
sob luz ultravioleta ou fluorescente. O TEMED catalisa a liberação de radicais livres de persulfato
SO4- que, por sua vez, iniciam a polimerização (ALFENAS e BRUNE, 1998). A acrilamida é uma

42
molécula linear, enquanto a Bis-acrilamida tem forma de “T”. Ao misturar-se essas duas moléculas,
tem-se a formação de uma “rede” onde diferentes relações entre as concentrações dessas moléculas
permitem a criação de diferentes gradientes de separação.
De acordo com Esteves (2012) existem variantes da técnica de eletroforese, que podem
ser divididas em: eletroforese nativa (em que as proteínas migram de acordo com os três fatores
mencionados anteriormente: carga, massa molecular e conformação), zimografia (em que as
condições de corrida e de detecção permitem que se detecte uma determinada atividade enzimática)
e eletroforese em condições desnaturantes (mais conhecida por SDS-PAGE, em que as proteínas são
desnaturadas previamente, sendo separadas apenas de acordo com a sua massa molecular).
Na eletroforese nativa, utilizada mais comumente para isoenzimas, existe o sistema contínuo
e o sistema descontínuo. No sistema contínuo, o gel tem porosidade uniforme e o tampão usado na
preparação da amostra e do gel é o mesmo utilizado nos tanques dos eletrodos. A escolha da solução-
tampão e de seu valor de pH depende da estabilidade e solubilidade da proteína em estudo.
Por outro lado, existe uma versão em que não somente usam-se tampões diferentes para o gel
e para o tanque, mas também um sistema de duas fases é usado, compreendendo um gel principal
ou de resolução e um gel empilhador de poros pequenos, onde a amostra proteica é aplicada. Esse é
conhecido como sistema descontínuo. Sob eletroforese, as moléculas migram da parte mais porosa
(gel empilhador) para a menos porosa (gel separador). Consequentemente, as moléculas de proteína
concentram-se numa faixa estreita e compacta entre o gel empilhador e o separador, produzindo
melhor resolução que no sistema contínuo, pelo empilhamento no gel empilhador, rendendo elevada
concentração das proteínas em análise.
Muitos tampões de gel diferentes e concentrações diferentes têm sido delineados para ambos os
sistemas, contínuos e descontínuos.
Neste capítulo será explanada a metodologia de eletroforese nativa em sistema descontínuo das
enzimas SOD (Superóxido dismutase) e Catalase extraídas de tecidos vegetais.
A SOD tem a função de catalisar a dismutação do superóxido em oxigénio e peróxido de
hidrogénio, sendo assim, uma importante defesa antioxidante na maioria das células expostas ao
oxigénio. Já a catalase tem a função de catalisar a decomposição do peróxido de hidrogênio, que é
altamente tóxico para as células.
1. Procedimentos
1.1 Extração de proteínas
A coleta do material vegetal deve seguir recomendações de coleta citadas no Capítulo 1

deste livro.
Após a coleta, prosseguir com os seguintes passos (Figura 2):
A) Homogeneizar 1 g de tecido vegetal em 2,5 mL de tampão de extração em um almofariz a 4oC;

B) Peletizar o material não solúvel por centrifugação por 5 min a 12000 xg;

43
C) Separar o sobrenadante em novo eppendorf e determinar a concentração de proteína bruta

(Bradford, 1976);
D) Congelar o sobrenadante imediatamente em nitrogênio líquido a fim de preservar a integridade das
moléculas e posteriormente armazenadas em ultrafreezer a 75oC.
Figura 2. Esquema da obtenção do extrato proteico
1.2 Eletroforese
1.2.1 Preparo do sistema

Todos os componentes da cuba devem estar limpos antes de serem utilizados a fim de evitar
qualquer alteração em função de contaminantes ou resíduos de análises anteriores. As placas de
vidros, borrachas de vedação e pentes devem ser limpos com solução detergente, lavados com água
destilada e posteriormente limpos com etanol. Depois de devidamente higienizado, o sistema deve
ser tocado apenas com luvas.
Para a montagem do sistema vertical, deve-se posicionar os dois espaçadores (1 mm) entre as
placas de vidro e encaixá-los no suporte de forma que o encaixe seja perfeito para completa vedação
com a borracha. Esta montagem deve ser perfeita para que não ocorra vazamento do gel e risco de
perda da amostra (Figura 3).
Suporte com vedação de borracha

Cuba
Pentes
Espaçadores
Placas de vidro
Figura 3. Componentes de uma cuba de eletrosforese

44
1.2.2 Preparo do gel
A concentração de acrilamida do gel separador depende do peso molecular dos componentes

que se deseja analisar. Segundo Alfenas e Brune (1998), usam-se géis na faixa de 7,5 a 10%. Para
variar a concentração de acrilamida no gel, para um mesmo volume de solução, basta alterar o volume
da solução-estoque de acrilamida-Bis em relação ao da água; as quantidades dos demais componentes
do gel permanecem inalteradas. Preparadas as soluções com TEMED e persulfato, deve-se aplicar
imediatamente ao sistema pois a geleificação se processa em poucos minutos.
O preparo do gel se processa da seguinte maneira:
A) Com o auxílio de uma pipeta ou seringa aplicar a solução do gel separador no espaço entre
as placas de vidro até a altura de mais ou menos 1,5 cm abaixo da extremidade inferior do pente;
B) Imediatamente após, aplicar um pequeno volume de isobutanol (ou etanol 70%) sobre o gel
para garantir a uniformidade da superfície deste;
C) Após a polimerização do gel (cerca de 20 min) observa-se uma separação nítida entre o gel
e o isobutanol, que deve ser removido por decantação e uso de papel-filtro;
D) Aseguir, inserir o gel empilhador e, imediatamente, o pente. Evitar ao máximo a formação
de bolhas.
E) Esperar cerca de 20 min para que o gel se polimerize completamente e retirar o pente
cuidadosamente para não romper os poços. Obs: caso a utilização do gel seja posteriormente, deve-se
cobrir o suporte com o gel com um saco plástico e manter em geladeira.
1.2.3 Preparo da amostra
Realizada a extração de proteínas, conforme descrito no item 1.1 deste capítulo, misturar 2
volumes do extrato proteico (proteína solúvel) com 1 volume de glicerol (com azul de bromofenol).
1.2.4 Corrida do gel
A) Remover o pente do gel da amostra com as duas mãos, puxando-o firmemente para cima,
evitando danificar os poços;
B) Montar o suporte com o gel na cuba de corrida;
C) Encher a cuba com tampão do reservatório;
D) Remover possíveis bolhas de ar na base do gel;
E) Pipetar cerca de 15 µL de amostra em cada poço utilizando-se uma seringa Hamilton ou
pipeta com ponteira estrangulada (todos os poços devem ser cheios com amostra ou com solução
tampão);
F) Para determinação da massa molecular aparente das proteínas pipetar padrões de massa

45
molecular conhecida no último poço de corrida.

Um marcador bastante utilizado para massa molecular de proteínas é o LMW-Marker-Kit, da
BioRad, pode-se utilizar por exemplo 5 µL de Marker-Kit mais 170 µL de tampão Laemmli.
A corrida indicada é de 180 mA, com voltagem constante, a 4 oC durante 90 min
(aproximadamente) (Figura 4).
Figura 4. Esquema da corrida das amostras em gel a 4 oC
1.3 Atividade das enzimas
1.3.1 Superóxido Dismutase – SOD E.C. 1.15.1.1
Para analisar a SOD, deve-se seguir o procedimento descrito abaixo (Figura 5):
A) Incubar o gel de poliacrilamida poroi 30 min em 50 mL de solução corante no escuro;
B) Após o incubamento no escuro, incubar na presença de luz até que as bandas de atividade
fiquem claramente visíveis;
C) Parar a reação pela lavagem dos géis em água bidestilada
D) Para inibir a Cu/Zn-SOD adicionar solução de KCN 3 mM (10 mg de KCN em 50 mL da
solução corante) ou ainda para inibir também Fe-SOD, adicionar 24,3 µL 35% H2O2 (concentração
final de 5 mM) em 50 mL da solução corante. Na presença de H2O2, além das bandas de SOD, as
bandas de atividade de catalase também se tornam visíveis.
Figura 5. Esquema de revelação da SOD
1.3.2 Catalase -CAT
Para analisar a CAT, deve-se seguir o procedimento descrito abaixo:
A) Lavar o gel por 10 min, sob agitação, descartar a água;

B) Lavar novamente por 5 minutos, sob agitação e descartar a água (realizar essa etapa duas

46
vezes);
C) Incubar o gel por 5 min em solução de 0,03 % (v/v) de H2O2 sob agitação. Para preparar a
solução de peróxido de hidrogênio, pipetar 0,1 mL de H2O2 (30 vol) w misturar em 99,9 mL de água
bidestilada.
D) Lavar novamente o gel com água bidestilada;
E) Incubar o gel na solução corante (tampão de coloração para CAT) até que as manchas
fiquem visíveis (aproximadamente 2 min) e parar a reação com lavagem em água bidestilada.
2. Reagentes
2.1 Utilizados no preparo dos géis
Na tabela a seguir (Tabela 1) estão os reagentes utilizados para o preparo dos géis de eletroforese
Tabela 1. Reagentes necessários no preparo dos géis de eletroforese
Substância Massa molecular (g mol)

Persulfato de amônia (APS), pA 228,20
Azul de bromofenol 691,94
Ditiotreitol (DL-) (DTT) 154,24
Glicerol, p.A (87% (v/v)) 92,10
GlicinA, p.A. 75,07
Kaleidoscope Prestained Standards -
LMW-Marker-Kit -
Mercaptoetanol (β-) 78,13
TEMED, electr 116,21
Tricina, (N-[2-Hidroxi-1,1-Bis (Hidroximetil) Etil] Glicina) 179,17
Tris [Tris(hidroximetil)aminometano] 121,14

47
2.2 Utilizados para extração e atividade protéica
Na tabela a seguir (Tabela 2) estão os reagentes utilizados para extração e atividade protéica.
Tabela 2. Reagentes necessários no preparo das soluções de extração e revelação
Substância Massa molecular (g mol)

Azul de bromofenol 691,94
Di-potássio hidrogenofosfato (K2HPO4) x 3H2O 228,23
DL-Ditiotreitol (DTT) 154,24
EDTA (Ácido Etilenodiamina Tetracético) 380,2
EGTA[etilenoglicol-bis-(β-aminoetiléter)N,N,N’,N’-ácido
380,4
tetraacético]
Glicerol, p.A (87% (v/v)) 92,10
Peróxido de hidrogênio (H2O2), 35% (v/v) 34,02
Sulfato de magnésio (MgSO4) x 7 H2O 246,48
NBT (Azul de nitro tetrazólio), grade II 817,6
Cianeto de potássio (KCN), pA 65,12
Potássio dihidrogenofosfato (KH2PO4), pA 136,09
Riboflavina (vitamin B12) (C17H20N4O8) 376,4
TEMED, electr 116,21
Tricina, (N-[2-Hidroxi-1,1-Bis (Hidroximetil) Etil] Glicina) 179,17
3. Soluções
3.1 Gel de separação

Solução para 2 Mini-Protean II (0,8% C) (Tabela 3):
Tabela 3. Protocolo utilizado para gel de separação em três diferentes concentrações.
Solução μL para 10% T μL para 12,5% T μL para 15% T
Água bidestilada 5352 4265 3185
Lower Tris (1) 3280 3280 3280
Sol. Acrilamida 4333 5420 6500
TEMED 10 10 10
Start: APS (2) 25 25 25
(1)
Lower Tris: 1,5M Tris, pH 8,8 – manter em temperatura ambiente.

48
Para 100 mL de solução, dissolver 18,17g de Tris em 75 mL de água bidestilada, ajustar para
pH 8,8 com HCl concentrado e completar para 100 mL com água bidestilada.
Persulfato de amônia (APS) – 50% (p/v) - armazenar a solução a 4oC. Dissolver 5 g de APS em 10
(2)
mL de água bidestilada. Esta solução pode ser utilizada por várias semanas.
Atenção: Durante o manuseio com acrilamida usar luvas, pois seus monômeros e derivados são
altamente tóxicos, podem causar câncer e/ou destruir tecidos nervosos.
3.2 Gel de empilhamento
Solução para 2 Mini-Protean II (0,8% C) (Tabela 4)

Tabela 4. Protocolo utilizado para preparo do gel de empilhamento
Solução μL para 5% T
Água bidestilada 2882
Upper Tris (1) 1250
Sol. Acrilamida 833
TEMED 10
Start: APS(2) 20
(1)
Upper Tris: 0,5M Tris, pH 6,8 – manter em temperatura ambiente
Para 100 mL de solução dissolver 6,06 g de Tris em 75 mL de água bidestilada, ajustar para
pH 6,8 com HCl 2 N e completar para 100 mL com água bidestilada.
(2)
Persulfato de amônia (APS) – 50% (p/v) - armazenar a solução a 4oC
3.3 Tampão de reservatório
Tris glicina, 4X concentrada:

0, 1 M Tris base.................................................12,11 g
0,77 M glicina....................................................57,80 g
Dissolver em água bidestilada, completar para 1L e conservar a 4 oC. Antes do uso diluir a
solução a 1:4. Para soluções 10X concentrada, diluir a 1:10. Não é necessário ajustar o pH pois na
diluição o pH cairá para aproximadamente 8.9.

49
3.4 Tampão de extração
Para 100 mL:

100 mM Tricina.................................................1,79 g
3 mM MgSO4.....................................................74 mg
3 mM EGTA.......................................................114 mg
*Para espécies oleaginosas ou resinosas deve-se adicionar 0,5 (p/v) PVPP (=0,05 g).
Dissolver em 75 mL de água bidestilada, ajustar o pH 8,0 com Tris e completar o volume para
100 mL. No momento em que for utilizar adicionar 1 mM de DTT (= 15 mg).
3.5 Tampão fosfato

Para obtenção do tampão fosfato 50 mM, pH 7,8, misturar as soluções 6,81 g KH2PO4 e 11,41
g L K2HPO4 em 1 L e água bidestilada e ajustar o pH.
3.6 Tampão de coloração para SOD
Para 200 mL:

10 mM EDTA....................................................760 mg
28 mM TEMED..................................................651 µg
30 µM riboflavina..............................................2,3 mg
245 µM NBT.......................................................40 mg
Dissolver em 200 mL de tampão fosfato e manter no escuro.
3.7 Tampão de coloração para CAT
Solução de 2% de FeCl3 e 2% de K3Fe(CN)6.
Solução de 2% de FeCl3: 0,5 g em 25 ml de água bidestilada
Solução de 2% de K3Fe(CN)6: 0,5 g em 25 mL de água bidestilada.
Misturar as soluções no momento em que for utilizá-la e completar para 200mL com água
bidestilada.

50
ALFENAS, A.C.; BRUNE, W. Eletroforese em gel de poliacrilamida. In: Eletroforese de isoenzimas

e proteínas afins: fundamentos e aplicações em plantas e microrganismos. Editado por
Acelino Couto Alfenas. Viçosa: UFV, 1998, 574p.
BEAUCHAMP, C.. FRIDOVICH, I. Superoxide dismutase: improved assays and na assays
applicacle to acrylamide gels. Analytical Biochemistry. 44, p. 276-287, 1971.
ESTEVES, A.C. Análise de proteínas por eletroforese. Disponível em: <http://molar.crb.ucp.pt/
cursos/>. Acesso em 15 mar 2012.
LAEMMLI, U.K. Cleavage of structural proteins of the head of bacteriophage T4. Nature:
London, 227, p. 680-685, 1970.
MISZALSKI, Z.; SLEAK, I.; NIEWIADOMSKA, E.; BISCZEK, R.; LUTTGE, U.; RATAJCZAK,
R. Subcellular localization and stress responses of superoxide dismutase isoforms from leaves in
the C3-CAM Intermediate halophyte Mesembryanthemum crystallinum L., accepted.
VOET, D.; VOET, J.G.; Bioquímica. Artmed, Porto Alegre. 3.ed. 2006.

51
Capítulo 8
Atividade da Invertase de Levedura:
valores da constante de Michaelis-Menten
(Km) e velocidade máxima (Vm)
Sthefany Rodrigues Fernandes Viana
Djanira Rodrigues Negrão
Fernando Broetto
Introdução
A análise da atividade da invertase contribui significativamente para formulação de hipóteses

relativas a cinética da interação entre uma enzima e seu substrato (GRACIDA-RODRÍGUEZ, 2005).
Dos dados obtidos da cinética da invertase Michaelis e Menten propuseram que uma molécula
enzimática reage com seu substrato para formar o complexo enzima-substrato.
Invertase é encontrada em um grande número de tecidos de plantas e são freqüentes os relatos
que a associam com a parede celular. Em muitos tecidos de reserva tais como raízes e tubérculos
de batata, chicória, cenoura e beterraba, a atividade da invertase é baixa em tecidos normais (não
injuriados). Entretanto, quando esses tecidos são cortados em discos e lavados em água estéril ou
tampão, há um grande aumento na sua atividade. As leveduras utilizam a invertase para quebrar
a molécula de sacarose do meio para absorver a molécula de glicose e frutose que são menores e
transformá-las em etanol (Figura 1). Nas leveduras a invertase é uma exoenzima.
Figura 1. Reação da invertase

52
O objetivo deste experimento é levar o aluno a aprender uma técnica de medida da atividade
da enzima e utilizando os dados obtidos calcular dois parâmetros da cinética enzimática que são a
constante de Michaelis e a Velocidade Máxima da reação, parâmetros estes que ajudaram Michaelis
e Menten a comprovar sua teoria sobre o mecanismo das reações enzimáticas.
1. Invertase de Levedura
1.1. Reação a ser estudada
Sacarose + água glicose + frutose
C12H22O11 + H2O C6H12O6 + C6H12O6
1.2. Determinação de Km e Vm da Invertase de Levedura

Para compreender a cinética da invertase, esse capítulo abordará a técnica experimental de
medida da atividade da enzima utilizando os dados obtidos para calcular dois parâmetros da cinética
enzimática. Estes parâmetros são a constante de Michaelis e a Velocidade Máxima da reação, que
ajudaram “Michaelis e Menten” a comprovar sua teoria sobre o mecanismo das reações enzimáticas.
A determinação dos parâmetros constante de Michaelis e velocidade máxima é feita medindo
a atividade da enzima em várias concentrações do substrato. Este experimento é também denominado
efeito da concentração do substrato na velocidade da reação.
Procedimento
A saber:
Sacarose + Água + Invertase à Glicose + Frutose
C12H22O11 + H2O à C6H12O6 + C6H12O6
Para a determinação de Km e Vm da invertase de levedura é necessário pipetar, em tubos de

ensaio, os volumes das soluções como indica a Tabela 1. Assim que os tubos atingirem a temperatura
37ºC em banho-maria, acrescenta-se a solução enzimática manter em incubação por 15 min. Após
esse tempo, cada tubo receberá 1 mL de reativo Somogy o qual interromperá a reação enzimática.
Em seguida, após os tubos serem fervidos durante 10 min, deve-se resfria-los em água corrente e
adicionar 1 mL do reativo de Nelson. Agitar e completar o volume a 10 mL com água destilada. Ler a
absorbância a 530 nm no espectrofotômetro e transformar as leituras em quantidades de açúcar redutor
formado por 15 minutos da reação, consultando a curva de calibração previamente estabelecida.

53
Tabela 1. Volumes estipulados a serem acondicionados em tubos de ensaio

Tubo Sacarose H20 Sol. Enzima Sol. Somogy Sol. Nelson
Banho Maria a 100ºC por

(mL) (mL) (mL) (mL) (mL)
Banho Maria a 37ºC por

0 0,0 1,0 0,2 1 1
15 minutos
10 minutos
1 0,2 0,8 0,2 1 1
2 0,4 0,6 0,2 1 1
3 0,6 0,4 0,2 1 1
4 0,8 0,2 0,2 1 1
5 1,0 0,0 0,2 1 1
Dados: Concentração de Sacarose 0,01 mol/L
Resultados:
Para a determinação das análises enzimáticas segundo Lineweaver-Burk, deve-se utilizar a
seguinte fórmula:
Equação de Lineweaver-Burk: 1/Vo = Km/Vmax . 1/[S] + 1/Vmax onde,
Y = a x + b
Equação de Michaelis-Menten, sendo:
Vo=Vmax . [S]
Km + [S]
Após obtenção dos dados (Tabela 2), deve-se construir um gráfico, colocando no eixo
das abscissas o inverso da concentração do substrato (1/S) e no eixo das ordenadas o inverso da
velocidade da reação (1/V) que é igual à quantidade de açúcar redutor formado durante os 15 minutos.
Os valores de R² obtidos no gráfico representam uniformidade nas concentrações, portanto, quanto
mais aproximado de 1, melhor os resultados.
Tabela 2. Valores de absorbância após hidrólise da sacarose.
mL Sacarose Leituras
0 0,000
20 0,054
40 0,084
60 0,111
80 0,157
100 0,186

54
Figura 1. Gráfico representativo das leituras após a inversão da sacarose
Conforme os dados apresentados na Figura 1 e Tabela 2, pode-se calcular os valores de Vmax

e o Km, usando a equação de Lineweaver-Burk. Desde modo, substituindo os valores obtidos no
gráfico, obtêm-se:
Dados:
Y = ax + b à Y= 0,0018x + 0,0082
Sabendo-se que:
1/Vo = Km/Vmax . 1/[S] + 1[Vmax]
Então:
1/Vo = 0,0018 . 1/[S] + 0,0082
Portanto:
1/Vo = 0,0082 à Vmax = 121,95 g L.h
Logo,
Km/Vmax = 0,0018 à Km = 121,95 . 0,0018 à Km = 0,220 g/L
Tabela 3. Obtenção da reta-padrão da glicose

Tubo Glicose mL H20 mL µg glicose Nelson H20 mL Leituras
Banho maria a 100ºC por
(ƛ)
0 1,0 0,0 100 1 7 0,474
20 min - esfriar
1 0,8 0,2 80 1 7 0,365

2 0,6 0,4 60 1 7 0,291
3 0,4 0,6 40 1 7 0,174
4 0,2 0,8 20 1 7 0,074
5 0,0 1,0 0 1 7 0,000

55
Figura 2. Gráfico representativo das leituras da glicose (reta padrão)
Calculando os valores de Vmax e Km, conforme a equação de Lineweaver-Burk. Substituindo

os valores obtidos e descritos na Figura 2, tem-se:
Dados:
Y = ax + b à Y= 0,0048x + 0,0103
Sabendo-se que:
1/Vo = Km/Vmax . 1/[S] + 1[Vmax]
Então:
1/Vo = 0,0048 . 1/[S] + 0,0103
Portanto:
1/Vo = 0,0103 à Vmax = 97,09 g/L.h
Logo,
Km/Vmax = 0,0048 à Km = 97,09 . 0,0048 à Km = 0,466 g/L
A concentração de glicose pode ser calcular através da fórmula Y=ax+b, onde x é expresso
em µg glicose ou pelos dados:
100 mg glicose em 100 mL à 1mg/mL

100 mL da solução em 100 ml à 10 mg/mL
Portanto: 100 ml de solução ------ 10 mg

1 mL -------------------------- x
X= 0,1 mg ou 100 µg
GRACIDA-RODRÍGUEZ, J.; FAVELA-TORRES, E.; PRADO-BARRAGÁN, A.; HUERTAOCHOA,
S. SAUCEDO-CASTAÑEDA, G. Invertases. In: PANDEY, A.; WEBB, C.;SOCCOL, C.R.;
LARROCHE, C. (Ed.) Enzyme Technology. New Delhi: Asiatech Publishers, 2005. p. 449-464.

56
Capítulo 9
Soluções Tampão: Conceito e Preparação
José Pedro Serra Valente
Fernando Broetto
Introdução
A principal finalidade de uma solução tampão, ou simplesmente um tampão, é controlar o pH

de uma solução. Secundariamente os tampões podem ser utilizados para controlar a força-iônica de
um meio, estabilizar a estrutura do ácido nucléico, controlar a atividade etc.
Neste texto vamos considerar o principal uso. Assim, podemos dizer que um tampão é uma
solução que não varia significativamente de pH com a adição de pequenas quantidades de ácidos,
bases ou por efeito de diluição (adição de água) ou da concentração (evaporação do solvente água).
As soluções tampão também são chamadas de:
“Soluções reguladoras de pH”
“Soluções estabilizadoras de pH”
“Soluções que contém acidez e alcalinidade de reserva”
Exemplo:
Comparação entre a variação do pH da água e do sangue após a adição de 0,01 mol de HCl e
0,01 mol de NaOH?
0,375 g de HCl 0,400 g de NaOH
1 Litro de 1 Litro de
água pura água pura
à
pH=7 à pH=2 pH=7 à pH=12

57
A acidez é alterada rapidamente em cinco ordens de grandeza.
0,375 g de HCl 0,400 g de NaOH
1 Litro de 1 Litro de
sangue sangue
à
à
pH=7,4 à pH@7,3 pH=7,4 àpH@7,5
O pH praticamente se mantém estável.
O sangue possui um sistema tampão que estabiliza o pH quando é aumentado a concentração

do ácido ou base.
Isto ocorre devido ao sistema H2CO3/HCO3- (ácido carbônico/ bicarbonato) e HPO42-/H2PO4-/
(monohidrogenofosfato/ dihidrogenofosfato) existente no sangue. O H2CO3 é um ácido fraco e o
HCO3- é sua base conjugada, o mesmo ocorre para o sistema fosfato, o HPO42- é uma base fraca (mais
forte que o H2PO4-) e o H2PO4- é seu ácido conjugado. Um par conjugado são duas espécies químicas
cuja diferença é um hidrogênio.
A classificação como ácido ou base depende da constante de equilíbrio, pKa ou pKb. Em um
par conjugado quem tem menor pKa é ácido e quem tem maior pKa é básico.
Tampão é a tradução da palavra Buffer do inglês que significa amortecer, pára-choque, isto
porque a solução “amortece” a variação do pH.
Quando é adicionado um ácido em um meio, o pH tende a cair, mas imediatamente volta a
condição inicial pelo restabelecimento do equilíbrio, como se fosse um impacto amortecido por um
colchão ou mola.
APLICAÇÃO
A) Química:
Muitas reações químicas são favorecidas ou são mais quantitativas em um pH especifico ou

faixa estreita. Desta maneira quando é necessário manter o pH constante é adicionado na solução
de interesse um pequeno volume de tampão com o pH estabelecido, favorecendo, assim, a reação
química desejada.

58
As soluções tampão também são utilizadas para calibração de pHmetros, eletroforese,

cromatografia líquida, cromatografia de íons etc.
B) Bioquímica:
Os sistemas biológicos são dependentes de reações bioquímicas que ocorrem em pH constante

ou em faixa muito estreita. Assim, muitos sistemas biológicos possuem naturalmente um sistema
tampão, permitindo que ocorram as reações bioquímicas necessárias para a manutenção da vida e/ou
saúde. Por exemplo, o sangue possui um pH entre 7,35 e 7,45, nessa faixa consome o ácido láctico
que é produzido nos exercícios e que deve ser eliminado rapidamente para que o pH das células do
corpo não caia e produza a morte das células. Quando o dióxido de carbono é dissolvido no sangue
aumenta a acidez e diminui a capacidade do sangue de transportar oxigênio. Em condições em que
é introduzido pouco ácido ou base, os sistemas H2CO3/HCO3-, H2PO4-/HPO42-e algumas proteínas,
presente no sangue, mantém o pH do sangue na faixa desejada. Uma alta introdução de ácido no
sangue pode causar acidose ou mesmo a morte celular, e uma alta introdução de base pode causar
alcalose ou morte celular.
As enzimas só são ativas em faixas de pH muito estreita. Em outros pHs pode ocorrer
diminuição ou perda total da atividade da enzima com a desnaturação.
Soluções tampões são utilizadas para estabilizar ácidos nucleicos e complexos proteínas - ácidos
nucleicos, meios de cultura como fermentações etc.
pH E MECANISMO DO FUNCIONAMENTO DO TAMPÃO
Os tampões são geralmente preparados misturando um ácido fraco e um sal da base conjugada
ou uma base fraca e um sal do ácido conjugado, para obter uma solução com pH definido.
Vamos considerar um ácido fraco (um próton ligado a um ânion A-):
HA H+ + A- (equilíbrio químico em meio aquoso)
Muito pouco pouco
e um sal solúvel (eletrólito forte) com o ânion igual ao do ácido, ligado a um cátion (C+) em meio
aquoso:
CA C+ + A- (não existe equilíbrio químico)

Nada muito muito
A equação de equilíbrio do ácido é:

Kc = [H+] [A-] (Constante de Dissociação)
[HA]

59
Quando o interesse é o pH podemos rearranjar a equação:

[H+] = Kc[HA]
[A -]
Multiplicando ambos os lados por p = -log, temos:

pH = pKa + log [Ácido] (equação de Henderson-Hasselbalch)
[Sal]
Considera-se que a concentração total do ânion A- seja igual ao do sal visto que a
contribuição do íon comum pelo ácido é desprezível:
Esta equação, denominada de Henderson-Hasselbalch, fornece o pH através do pKa e razão
das concentrações de um par conjugado ácido – base, do sistema tampão considerado.
Mecanismo do tampão:
Exemplo: Tampão ácido de acético 0,2 mol/L

HAc : Na+Ac- Onde, Ac- = Acetato
0,1 mol/L 0,1 mol/L

H+ ou OH-
HAc Ac- + H+
muito pouco pouco
Na+Ac- Ac- + Na+

nada muito muito
Na mistura, em meio aquoso, temos muito Ac- e HAc, pouco H+ e o Na+ que é inerte, não participa
das reações apenas participa do equilíbrio elétrico do meio.
Adicionando H+ nessa mistura:
O excesso de Ac- (básico) reagirá com o H+ adicionado formando o ácido não ionizado,
mantendo o pH constante.
Ac- + H+ HAc

60
A base Ac- está relativamente em grande concentração e não é significativa a alteração da

sua concentração ao consumir o H+.
Adicionando OH- na mistura:
Os íons OH- reagem com os íons H+ formando H2O.
OH- + H+ + H2O
O equilíbrio é restabelecido com o HAc não dissociado liberando H+ para repor o H+
consumido, mantendo o pH constante.
HAc Ac- + H+
Isto significa que a solução possui acidez de reserva, o HAc dissocia mantendo a
concentração inicial de H+ praticamente constante.
O deslocamento do equilíbrio para o lado contrário ao da espécie adicionada é explicado
pelo princípio de Le Chatelier.
A solução tampão deve consumir a maioria dos íons H+ ou OH- adicionados caso contrário o pH
será alterado significativamente.
1. Cálculo do PH de uma Solução Tampão

A) Tampão Ácido (ácido fraco ou sal do ácido e sal da base conjugada)
O pH de uma solução tampão depende do pKa e razão entre as concentrações do ácido e sal
que contém a base conjugada do ácido. A equação de Henderson-Hasselbalch para um tampão ácido
é:
B) Tampão básico (base fraca e sal do ácido conjugado)
O pH do tampão básico é determinado subtraindo o pOH de 14. O pOH é determinado somando

o pKb (pKb=14-pKa) e a razão entre as concentrações da base fraca e sal que contém conjugado o
ácido conjugado da base. A equação de Henderson-Hasselbalch para o tampão básico é:
Sendo,
Ca=concentração nominal de ácido fraco ou sal do ácido em mol/L
Cb=concentração nominal da base fraca em mol/L
Cs= concentração nominal do sal que fornece o ácido ou base conjugada em mol/L

61
2. Capacidade Tamponante (Ct) ou Freadora (Cf)
Capacidade tamponante ou freadora é a capacidade do sistema tampão em consumir íons H+

ou OH-, acrescentados na solução, resistindo a variação de pH. Esta capacidade é limitada e é uma
medida da eficiência do tampão.
1) A CT é maior quando a relação das concentrações do par conjugado é igual a unidade:
Além de ser mais eficiente, é mais fácil de escolher o pH, pois é igual ao pKa:
quando Cs = Ca
pH = pKa + log 1 Como o log de 1 é zero, o
pH = pKa
Quando a concentração do tampão é alta e o pH = pKa a capacidade tamponante é máxima.
2) Quando a razão de está entre 10 e 0,1 a CT é satisfatória.
Isto implica: pH = pKa ± 1
Isso significa que concentração do sal pode ser dez vezes maior ou menor que a do ácido. Na
prática quando o valor for superior a um, ou inferior a um não temos uma solução tampão.
3) A princípio a CT de uma solução tampão aumenta com as concentrações efetivas dos seus
componentes.
 Na prática, em geral, as concentrações em que os tampões funcionam bem estão entre 0,050
e 0,200 mol/L (50 e 200 mmol/L).
 A escolha da concentração do tampão depende da estimativa do consumo de H+ ou OH-. Se
no meio será adicionado muito H+ ou OH- escolher uma concentração maior, se pouco uma
concentração menor.
 Se no meio tamponado não for acrescentado significativamente H+ ou OH-, utilizar uma
concentração entre 50 a 100 mmol.
 Se for necessário um meio com uma força-iônica grande, escolher uma concentração do
tampão maior ou adicionar um sal inerte como NaCl, KCl, Na2SO4 etc.
 Se é esperado diminuir o pH durante o experimento deve-se escolher um tampão com pKa um

62
pouco abaixo do pH de trabalho e inversamente se o pH for aumentar.

 Na preparação de uma solução tampão deve-se sempre procurar um ácido que tenha pKa igual
ou próximo ao pH desejado, isso favorece a capacidade tamponante, aumenta a capacidade de
neutralizar H+ e OH-.
Concentração de uma solução tampão:

É a soma da concentração do ácido (ou base) e sal (ácido conjugado ou base conjugada), em
mol/L.
Exemplo: Tampão acetato 0,1 mol/L
Esta concentração pode corresponder a várias proporções da razão , de acordo com o pH
estabelecido, por exemplo:
ácido acético 0,05 mol/L + acetato de sódio 0,05 mol/L = 0,1 mol/L;
ácido acético 0,06 mol/L + acetato de sódio 0,04 mol/L = 0,1 mol/L etc.
No preparo de uma solução tampão devemos sempre estabelecer a concentração desejada. A

concentração do tampão é importante para avaliar a capacidade tamponante e força-iônica.
3. Prática: Preparação da Solução Tampão
O melhor procedimento para obtenção de uma solução tampão é seguir o procedimento dado
pelo protocolo experimental.
Em uma situação nova ou falta de um protocolo de procedimento existem vários métodos para
a preparação de um sistema tampão. Os dois métodos principais são:
A) Quando existe no laboratório os dois reagentes, o ácido (ou base) e o sal do conjugado
Após definir a concentração da solução tampão e a proporção dos componentes da mistura,
para obter o pH desejado, pesar o ácido (ou base) e o sal separadamente, dissolver os mesmos em
água e completar o volume desejado em um balão volumétrico.
Exemplo:
Como preparar um litro de tampão de fosfato com pH = 7,5 e concentração 0,2 mol/L?
Consultando uma tabela de pKa encontramos:
H3PO4 pKa1 =2,15 pKb=11,85
H2PO4- pKa2 =7,21 pKb=6,79
HPO4 2-
pKa3=12,67 pKb=1,33
O H2PO4- é básico em relação ao conjugado H3PO4 e ácido em relação ao conjugado HPO42-.

Para fazer o tampão deve-se se escolher o ácido com pKa mais próximo do pH desejado, o
H2PO4 pKa2 =7,21, e o conjugado básico em relação ao ácido, o H2PO4- pKa=12,67.
-
Os ânions derivados do ácido fosfórico são encontrados como sais de sódio ou potássio. Esses
cátions são inertes na maioria das situações.

63
Como o pH desejado não é igual ao pKa devemos ajustar a proporção das concentrações da
base H2PO4- e o seu conjugado HPO4-, na equação de Henderson-Hasselbalch para tampão básico.
pKb = 6,8
HPO42- + H+ H2PO4-
Base Ácido (sal)
1ª. opção de cálculo:

Dados:
Volume do tampão = 1 litro

Podemos substituir Cb e Cs por:
pH = 7,5
[HPO42-] = concentração mol/L da base pKb = 6,8
[H2PO4-] = concentração mol/L do sal do ácido conjugado

Concentração do tampão:
[Base] + [Sal] = 0,2
[Base]= 0,2 – [Sal]
Massa molar (M):

0,2-[Sal] = 1,95[Sal] (vide dados)
M(K2HPO4)=136,1 g/mol
0,2=2,95[Sal]
M(KH2PO4)=174,29 g/mol
[Sal]=0,068 mol/L de KH2PO4 (ácido conjugado)
Massa do sal?
1 litro da solução tem 0,068 mol de KH2PO4
m=n.M
m = 0,068mol . 136,1 g/mol
m = 9,26 g de KH2PO4
Massa da base ?
[Base]= 0,2 – [Sal]

[Base] = 0,2-0,068
[Base] = 0,132 mol/L de K2HPO4
1 litro da solução tem 0,132 mol de K2HPO4
m= 0,132 g/mol.174,2 g/mol

m = 23,0 g de K2HPO4

64
2ª. opção de cálculo:
Podemos chegar ao mesmo resultado prático utilizando o pKa e a equação do tampão ácido:
pKa2 = 7,2
H2PO4 -
HPO42- + H+
Ácido (sal) base
como [Sal] + [Ácido] = 02 [Sal] = 0,2 - [Ácido] temos:
0,2-[Ácido] = 1,95[Ácido] (vide dados em 1ª. opção)

0,2=2,95[Ácido]
[Ácido] = 0,068 mol/L = 9,26 g de KH2PO4/L (na realidade o sal do ácido)
[Sal] = 0,2 – 0,068 = 0,132 mol/L = 23,0 g de K2H PO4/L (na realidade a base)
Os dois componentes são adicionados na forma do sais contendo os conjugados. Estamos chamando
de sal a base (maior pKa).
4. Parte Experimental
Dissolver 23,0 g de K2HPO4 e 9,26 g de KH2PO4 em cerca de 900 mL de água, medir o pH e

corrigir se necessário com um ácido forte (Por exemplo, HCl) ou base forte (por exemplo, NaOH),
finalmente completar o volume para 1000 mL em um balão volumétrico.
A) Quando existe só um dos reagentes
Se houver só o ácido (ou base) este é dissolvido ou diluído em um pouco de água e em seguida
é adicionado uma quantidade (calculada) de base forte (ou ácido forte) para obter o pH desejado.

65
Se houver só o sal (base conjugada), adicionar a quantidade de ácido forte necessária para obter
o pH desejado.
Exemplo 1:
Como preparar 1000 mL de uma solução tampão Tris com pH 8,1 e concentração 0,1 mol/L,
tendo apenas a base Tris.
Para isso temos que ter HCl 1,0 mol/L para adicionar na base Tris e gerar o sal do conjugado.
O Tris (trishidroximetilaminometano) tem massa molar igual a 121,14 g/mol, pKa=8,1(25oC)

(básico, pKb=5,9).
Tris-Base + HCl Tris–ácido
Para saber o volume de HCl 1,0 mol/L é necessário adicionar na base Tris para obter o
tampão com pH 8,1 devemos utilizar a equação de Henderson-Hasselbalch para tampão básico:
Isto significa que a concentração do [Sal] tem que ser igual a da [base], então metade da base
deve ser convertida em sal, para que ambas concentrações sejam iguais (0,05 mol/L).
Na reação do Tris-Base com o HCl a proporção é de 1:1.
Como deve ser convertido 0,05 mol de Tris-Base para Tris-ácido é necessário 0,05 mol de
HCl. Se em 1000 mL de HCl 1 mol/l temos 1 mol de HCl, em 50 mL teremos 0,05 mol de HCl.
Preparo
Devemos dissolver 0,1 mol da Tris-Base (cristalino) que corresponde a 12,1 g (0,1 mol x
121 g/mol) em 900 ml de água e a seguir adicionamos 50 mL de HCl 1,0 mol/L. Medir o pH, se
necessário ajustar com HCl ou NaOH.

66
Alternativamente podemos dissolver 12,1 g da base cristalina em 900 mL de água e titular

com HCl 1,0 mol/L até pH = 8,1, finalmente completar o volume para 1000 mL.
Comercialmente é encontrado o Tris-Base (mais comum) e o Tris–HCl (tris cloridrato de
Tris, pKa=8,06 e Massa Molar 157,6 g/mol), que é titulado com NaOH ou KOH para obter o sal. O
Tris é muito dependente da temperatura, a 20oC o pKa=8,3.
Exemplo 2:
Preparo de um tampão a partir de uma solução estoque
O Tris é vendido também na forma de solução estoque.
Como preparar 25,00 mL de um tampão Tris com pH 7,8 e concentração 100 mmol (0,100
mol/L) a partir de uma solução estoque 2000 mmol (2,000 mol/L) e HCl 1 mol/L (pKa=8,1).
Dados:
Tris-Básico pKa = 8,1
Concentração da solução estoque do Tris-Basico = 2,000 mol/L
Concentração do tampão: [Tris-Base] + [Tris-HCl] = 0,100 mol/L =>[Tris-Base] = 0,100 - [Tris-
HCl]
Volume para preparar = 25,00 mL

Inicialmente deve-se diluir a solução estoque:
C1V1 = C2V2 (lei da diluição)

2,000 mol/L . V1 = 0,100 mmol/L . 25,00 mL
V1 = 1,25 mL
Assim deve-se transferir 1,25 mL da solução estoque para um balão volumétrico de 25,00 mL
com um pouco de água. Em seguida adicionar o volume calculado de HCl 1,0 mol/L para obter o
tampão e completar o volume para 25,0 mL com água em balão volumétrico.
Cálculo:

67
A equação de Henderson- Hasselbalch para tampão BÁSICO :
Substituindo [Tris-Base] pela concentração fornecida nos dados:

[Tris-HCl] = 2(0,100-[Tris-HCl]) [Tris-HCl] = 0,200 - 2[Tris-HCl])
3[Tris-HCl]=0,200 [Tris-HCl] = 0,0667 mol/L

Então [Tris-Base] = 0,100 –0,0667 = 0,0333 mmol/L
Se em 1000,0 mL há 0,0667 mol de Tris-HCl, em 25,00 mL temos 0,00167 mol.
A proporção de Tris-Base com HCl para formar Tris-HCl é de 1:1, então para formar 0,00167
mol (1,67 mmol) de Tris-HCl são necessários 0,0167 mol de HCl.
1000,0 mL do HCl possui 1,0 mol de HCl, então em 1,67 mL deste ácido há 0,00167 mol de HCl.
Assim, se deve acrescentar 1,67 mL de HCl 1,0 mol/L no balão volumétrico com 1,25 mL
da solução estoque de Tris-Base, adicionar outros reagentes como MgCl2 e EDTA, se a metodologia
determinar, e completar o volume para 25,00 mL com água ultrapura, para obter a solução tampão
desejada.
Medir o pH e ajustar com ácido forte ou base forte se necessário, antes de completar o volume
para 25,00 mL.
INTERNET
Na internet há um site da University of Liverpool (Liverpool L69 3BX

United Kingdom) com uma calculadora on line que fornece receitas para preparação das principais
soluções tampão:
http://www.liv.ac.uk/buffers/buffercalc.html
Para obter a receita de preparação do tampão é necessário informar:
a) Tipo de tampão (acetato, fosfato, tris etc.)

b) Volume desejado
c) pH desejado
d) Concentração do tampão
d) Temperatura de preparo
e) Temperatura de uso
f) Se for necessário controlar a força iônica, qual a força-iônica desejada (em mmol/L). Tem opção
de escolha do sal a ser utilizado para controle da força-iônica (NaCl, KCl, Na2SO4 etc)
Alguns cuidados na preparação e armazenamento da soluções tampão:

68
 Em geral as soluções tampão são estáveis e mantém o pH constante por um longo período,
para isso é necessários alguns cuidados:
 É recomendado utilizar água ultrapura com resistividade 18,2 MΏ-cm (0,055 µS/cm), a 25oC.
Esta água tem um pH neutro na saída do sistema de purificação (sem gás carbônico), mas ela
é rapidamente contaminada pelo CO2 do ar até um pH~5,5. A água destilada é obtida com
CO2 e no contato com o ar ocorre aumento da contaminação. Caso só se tenha água destilada
comum, eliminar o gás carbônico em um destilador, com o condensador na vertical, e fechar
rapidamente o frasco de armazenamento após a separação da água para minimizar novas
entradas.
 Após o uso da solução tampão, fechar rapidamente o frasco para evitar a entrada de
contaminantes da atmosfera. O gás carbônico é o principal contaminante atmosférico dos
tampões básicos e a amônia dos tampões ácidos.
 Um tampão ácido deve ser armazenado em frasco de vidro.
 Não armazenar tampão básico em frascos de vidro comum, impurezas do vidro como sílica
podem dissolver contaminando o tampão.
 A contaminação microbiana pode acontecer em pHs próximos de 7. Para evitar a contaminação
é recomendado a esterilização, refrigeração ou aumento da força-iônica, por exemplo, utilizar
uma concentração de 500 mmol/L para um tampão de fosfato.
 Alguns íons existentes na solução tamponada podem interagir com componentes do tampão.
Ex. Ca2+ com o fosfato precipita, Cu2+ com a amina do Tris se ligam fortemente.
 Sais de potássio são mais prontamente solúveis em algumas soluções orgânicas.
 Tomar cuidado no armazenamento dos reagentes, por exemplo, os sais anidros são
mais higroscópicos que os hidratados, assim a hidratação pode causar erro na pesagem e
consequentemente na proporção ácido e base.
 A melhor maneira de evitar alteração na força-iônica de um tampão é utilizar as quantidades
fornecidas pela razão dos componentes na equação de Henderson-Hasselbalch. No preparo
do tampão, o volume gasto para ajustar o pH, antes de completar o volume final, deve
corresponder no máximo a cerca de 10% do volume final (a ser preparado). Nesta condição
o volume de ácido ou base gasto para o ajuste do pH são pequenos e não causam mudanças
significativas na força-iônica.
5. Limitações da Equação de Henderson- Hasselbalch com Base nas

Concentrações Nominais (Analíticas)
Quando se faz uma solução tampão com base nas concentrações calculadas na equação
Henderson- Hasselbalch é utilizado um eletrólito forte (sal), assim à força-iônica é significativa e
o pH obtido difere ligeiramente do esperado. Isto acontece porque a concentração real (atividade

69
iônica) do tampão é menor que a concentração nominal (analítica). Assim as equações de equilíbrio
deveriam ser expressas em termos de atividade iônica (a) e não da concentração nominal.
Dessa forma, o pH de uma solução feita com base nas concentrações analíticas possui um pH
ligeiramente diferente do esperado e deve ser ajustado no final do preparo da solução tampão.
Os cálculos feitos através das equações de equilíbrio químico em termos de concentração só
são exatos para soluções ideais (concentrações muito baixas) em que as partículas estão afastadas
uma da outra não havendo interações entre elas.
Uma solução feita com um eletrólito forte (sal solúvel) produz uma força-iônica significativa
causando a formação de aglomerados iônicos, diminuindo a concentração efetiva (real). Cada
aglomerado iônico age como se fosse uma partícula individual, assim a soma de aglomerados e
partículas é chamada de atividade iônica (concentração efetiva/ real) menor que a concentração
nominal ou analítica. Concentração analítica é a concentração encontrada em uma análise química
através de reações químicas, ou seja, quantifica todos os íons adicionados em um meio.
Alcard, J.C. e Mattiazzo Prezotto, M.E. Equilíbrio Químico: Atividade Iônica. Dep. Química, Escola
Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Piracicaba-SP, 1990.
Beynon, R.J. e Esaterby, J.S. Buffer solution: The basics. Oxford: Bios Scientific Publisherss, 1996.
Brown, T.L., Jr. H.E.L., Bursten, B.E. Chemistry The Central Science, Sixth Edition, New Jersey
USA: Prentice Hall, Inc., 1977.
Harris, D.C. Quantitative chemical analysis, fifth edition, New York: W.H.Freeman, 199.
Skoog, D. A., West, D.M. e Holler, F.J. Fundamental of Analytical Chemistry, Seventh Edition,
Orlando USA: Saunders College Publishing., 2001
Pfannkoch, E.A. Molecular Biology Problem solver: A Laboratory Guide. Wiley-Liss, Inc. Cap. 3,
2001.
Chemistry 1B Experiment 11, Buffer solutions. College of Alameda, California USA.

70
Capítulo 10
Espectrofotometria Quantitativa na Região do
UV-Vis (180 - 800 nm)
José Pedro Serra Valente

Fernando Broetto
Introdução
Espectrofotometria é um método de análise química baseado na absorção de fótons (energia)

correspondente aos comprimentos de onda (λ) (ou freqüência) da região do Ultravioleta e do Visível,
por espécies químicas.
As espécies químicas (átomos, moléculas, íons e radicais) absorvem energia quantizada
(fótons).
Equação de Planck/Einsten
E = energia do fóton
h = constante de Planck
c = velocidade da luz (constante)
λ = comprimento de onda
ν = frequência
• A energia do fóton varia com o λ ou ν.

• Fóton é uma partícula de energia da
radiação eletromagnética.
• Radiação monocromática é um fluxo
(feixe) de fótons com o mesmo λ e
mesma energia.
Figura 1. O fornecimento de fótons com energia mínima igual à diferença entre dois níveis de energia

71
causa a absorção e transição de um elétron no estado fundamental para excitado.

Quando a solução da espécie química é colorida ela absorve fótons de luz visível (400-780 ou
800 nm) é quando incolor pode absorver fótons de luz ultravioleta (180-400 nm).
Embora a energia de transição eletrônica seja a principal energia que participa do processo,
outros tipos de energia estão envolvidos.
Energia da Molécula:
ET = Ee + Er + Ev
ET = energia total da molécula
Ee = energia eletrônica
Energia devida à transição de elétrons de valência, do estado fundamental
para um nível ou subnível de energia superior (excitado)
Ev = energia vibracional de átomos na molécula
Energia devida ao aumento das vibrações dos átomos da molécula entre os
subníveis vibracionais.
Er= energia rotacional da molécula
Energia devida ao aumento das rotações das moléculas na transição entre os
subníveis rotacionais.
Figura 2. Movimentos que ocorrem na molécula quando recebe fótons com energia
correspondente a frequência do movimento.
Estas energias variam aproximadamente de acordo com os valores a seguir:

Er < Ev < Ee

72
1 : 50 : 1000
Como se nota a energia eletrônica (de transição nos níveis energéticos) é mais importante.
1. Banda de Absorção da Molécula e Absorbância Máxima (λmax.).
Figura 3. O comprimento de onda associado ao pico da banda corresponde

ao máximo de absorbância da molécula.
Quando uma amostra contendo determinada molécula é varrida por um espectro de radiação
(faixa de comprimentos de ondas variando continuamente) e é registrada simultaneamente a energia
absorvida (absorbância) temos um gráfico como acima, denominado de banda ou espectro de absorção.
O pico de absorbância fornece o comprimento de onda que é mais absorvido pela molécula.
No espectro de absorção nota-se que a molécula absorve vários comprimentos de ondas com
intensidade diferente, um deles é máximo (λmax.). Isto é devido à existência de diferentes níveis e
subníveis na molécula (vibracional, rotacional e eletrônico). Sendo que o (λmax.) inclui a transição
eletrônica principal (preferencial).
Os espectros de banda também são utilizados para a análise qualitativa de grupos funcionais
de moléculas orgânicas. As bandas obtidas nas amostras são comparadas com as bandas obtidas com
padrões.
Figura 4. Transições eletrônicas quantizadas possíveis pela absorção de fótons com energia igual a
diferença entre os níveis e subníveis.
Entre dois níveis ou subníveis de energia existe uma zona proibida onde os elétrons não podem

73
permanecer, apenas podem atravessar.
As regiões onde os elétrons podem permanecer são denominadas de níveis e subníveis de

energia e possuem energia definida. Quanto mais distante do núcleo estiver do nível e subnível, maior
é a energia do elétron. Estas diferenças de energia entre níveis e subníveis são características de cada
espécie química.
Um elétron para ir de um nível ou subnível a outro deve receber fótons com energia no
mínimo igual à diferença entre os níveis e subníveis. Um elétron ao receber energia não é livre para
permanecer onde esta, sofre transição. Após a transição o elétron dissipa a energia e volta ao estado
inicial (fundamental). O estado excitado é transiente, tem um tempo de vida curto e decai para o
estado fundamental por emissão de fótons, em nanosegundos.
A energia necessária para a transição de um estado fundamental para um estado excitado é
específica para cada espécie química, assim cada molécula absorve de maneira particular.
2. Processo de Absorção de Radiação UV-Vis da Molécula (m)

Todas as moléculas orgânicas são capazes de absorver radiação eletromagnética porque todas
contêm elétrons de valência que podem ser excitados a níveis de energia mais altos. O processo
ocorre em duas etapas:
1) Excitação por absorção de fótons
M + hν → M*
O tempo de vida da espécie química excitada é de 1–10 ns (nano segundo). Após ocorre
um processo de relaxação em que o excesso de energia é dissipado e a molécula volta para estado
fundamental.
2) Relaxação
a) Ocorre por liberação de calor:

M* → M + calor
b) Decomposição de M* (reação fotoquímica/ fotólise)
M* → A + B (ocorre em condições mais energéticas)
c) Reemissão de radiação por fluorescência ou florescência

74
Estado fundamental e Estado excitado e emissão Emissão de luz fluorescente

de calor ou fosforescente
absorção de luz
Ef = E3-E2 Ef = E2-E1
Ef = E3 – E1
Figura 6. Transição eletrônica com absorção e emissão de radiação
Se os fótons absorvidos tivessem a Ef = E2-E1 a volta para o estado fundamental se daria

apenas com emissão de calor.
A quantificação da energia absorvida por uma espécie química permite determinar a
concentração do analito1 em uma amostra. A técnica que permite isso é chamada de espectrofotometria
e o equipamento de espectrofotômetro.
3. Princípios da Espectrofotometria Quantitativa no UV - Vis
A espectrofotometria quantitativa é baseada na medida da absorbância (A) ou transmitância (T)

de um feixe de luz monocromática, após passar por uma amostra contendo um analito. A concentração
do analito é proporcional a absorbância de acordo com a lei de Lambert-Beer.
Figura 7. Absorção de radiação monocromática (fótons com o mesmo λ)

pelo analito na amostra.
Quando uma parte da luz incidente é absorvida (It < Io)
Absorbância: A = Io/It
Transmitância: T = It/Io

75
Io : Intensidade do feixe de luz incidente

It ; Intensidade de feixe de luz transmitido
Quando um feixe de radiação monocromática com λmax atravessa uma solução que contenha
uma espécie absorvente (centros absorventes) uma parte da energia radiante é absorvida enquanto a
outra é transmitida pelo meio.
3.1 Lei de Lambert

Esta lei diz que a absorbância de uma radiação monocromática por um analito é proporcional
ao comprimento do caminho óptico na solução.
A = α1 b
A = absorbância (sem unidade)
b = comprimento de caminho óptico (cm) (espessura da cubeta, em geral 1 cm)
α1 = constante de proporcionalidade, característica de cada solução
3.2 Lei de Beer

Esta lei diz que a absorbância da luz monocromática por uma solução, com solvente
transparente, é proporcional a concentração do analito.
A = α2 C
C = concentração em mol L-1 ou g L-1
α2 = constante de proporcionalidade, característica de cada solução
3.3 Junção das duas Leis
Lei de Lambert–Beer
Juntando a lei de Lambert e lei de Beer temos:
A = α1 b . α2 C α1 α2 = ε ou α1 α2 = a
A=εbC ou A= abC
A = Absorbância
T = transmitância
C = concentração do analito absorvente em mol.L-1 ou g L-1

76
ε (epsilon) = absortividade molar (cm-1.mol-1.L) (característico do analito absorvente) =

capacidade da molécula em absorver energia com determinado λ e solvente
(utilizado para C em mol L-1)
a = absortividade (cm-1.g-1.L) (característico do analito absorvente) = capacidade da
molécula em absorver energia com determinado λ e solvente (utilizado para C
em g L-1)
Outras considerações
A = -log T
T = Pt/Po ou T(%) = P/Po x 100
Po = potência do feixe de radiação incidente (quantidade de energia de um feixe de energia

monocromada transportada de uma fonte por segundo)
Pt = potência do feixe de radiação transmitida após atravessar a solução do analito
Embora as medidas experimentais sejam realizadas em função da potência radiante de uma fonte é
mais comum encontrar o termo intensidade de radiação para definir a transmitância:
T = It/Io
Io = Intensidade do feixe incidente
It = Intensidade do feixe transmitido
Potência radiante e intensidade da radiação não correspondem à mesma coisa, mas estão
relacionadas entre si. A intensidade de radiação, I, é definida como a razão entre a potência radiante e
a área irradiada. Intensidade (Io) é o número de fótons incidente.
Quando um feixe de radiação passa por uma substância absorvente, a intensidade da radiação
incidente (Io) será menor que da radiação emergente.
A intensidade do feixe de radiação (monocromática) transmitida decresce exponencialmente

com o aumento da espessura da cubeta, T = It/Io = 10 –ε b C:
Outras formas de expressar a lei:

77
T = 10 –ε b C
log T = log 10 –ε b C
log T = -C ε b
-log T = C ε b
log 1/T = C ε b
log Io/It = absorbância (A) = C ε b
4. Aspectos Práticos
Resumo da lei de Lambert-Beer
A = kC
A = -log T = ε b C ou ε b = k (inclinação/slope)
A = -log T = a b C ab=k C = A/k
A = -log T C = (A-cL )/ ca (Equação

da reta – recomendado)
A= absorbância de luz monocromática pelo analito (sem unidade)

T= transmitância da luz monocromática
ε = absortividade molar do analito (capacidade da espécie química absorver λ/constante)
(unidade: cm-1 mol-1 L).
a = absortividade do analito (unidade: cm-1 g-1 L).
b = comprimento do caminho óptico (espessura da
cubeta/geralmente 1 cm)
C = concentração do analito (mol L-1ou g L-1) (equação da reta da curva de calibração)
cL = Coeficiente linear da reta (intercepto y)(equação da reta da curva de calibração)
ca = Coefciente angular da reta (regreção linear da curva de calibração)
k = inclinação da reta (curva de calibração)

78
5. Requesitos para Quantificação do Analito:
1) Para utilizar a faixa do visível é necessário que o analito em solução seja colorido
(absorva luz visível). Geralmente é necessário fazer um pré-tratamento químico na
amostra. Por exemplo, para determinar a concentração total de um elemento ou íon,
em geral é feito uma digestão com ácidos e oxidantes, para liberar o analito em uma
forma definida (igual ao da forma utilizada na solução de referencia utilizada para
fazer a curva de calibração) e reagir com reagentes que formarão uma espécie química
colorida (centro absorvente), proporcional a concentração do analito.
2) Conhecer o λmax (comprimento de onda com máxima absorbância pelo analito). Este
é o melhor comprimento de onda, dentro do espectro de absorção, porque permite a
detecção de concentrações mais baixas do analito. Este λmax é obtido no desenvolvimento
da metodologia da análise e pode ser checado facilmente fazendo uma varredura do
espectro na amostra.
3) Fazer uma solução estoque do analito e fazer diluições da solução estoque de acordo
com a metodologia.
4) Fazer a reação do analito com reagentes para obter uma solução da espécie química
que absorva luz monocromática proporcional a concentração do analito.
5) Fazer um “branco” com água destilada e os reagentes utilizados nos padrões.
5) Fazer as medidas de absorbâncias para obter a curva de calibração (referência).
6) Construir a curva de referência (A vs. C) para determinação de concentrações
desconhecidas de analitos em amostras.
6. Validade da Curva de Referência
A curva de referência será válida enquanto não for alterado algum acessórios do aparelho e
forem utilizados os mesmos reagentes utilizados para fazer a curva de calibração.
Quando houver alguma modificação ou em caso de alguma suspeita pode-se utilizar uma
solução com concentração exatamente conhecida (padrão) como amostra e checar o resultado na
curva. Se o erro não for aceitável deve-se fazer outra curva de referência.
O ideal é sempre correr um padrão junto com as amostras quando for realizar medidas, alguns
reagentes são instáveis e podem ocorrer alterações ou contaminação.
7. Determinação da Concentração do Analito na Amostra:
1) Fazer o pré-tratamento químico da amostra de acordo com a metodologia.

2) Processar as reações para obter o analito colorido na solução da amostra, para determinação no
visível. Se a amostra for incolor, usa-se a luz no UV. Muitas substâncias orgânicas absorvem na região

79
ultravioleta e nestes casos o pré-tratamento só envolve eliminação de interferentes

3) Fazer um “branco” com água destilada e os reagentes
4) A radiação incidente pode sofrer reflexão, refração e espalhamento no sistema cubeta-amostra,
sendo, portanto, contabilizada como energia absorvente. O branco desconta este erro, desde que seja
utilizado sempre à mesma cubeta ou cubetas diferentes de alta qualidade, de preferência da mesma
marca e lote.
5) Ajustar o espectrofotômetro e medir a absorbância.
6) Calcular a concentração do analito na amostra
8.Procedimento Básico para Operação do Espectrofotometro
1) Ajustar o comprimento de onda para o descrito no protocolo de análise.

2) Ligar o espectrofotômetro e esperar o tempo para estabilização.
3) Zerar o espectrofotômetro.
4) Colocar a cubeta do branco no suporte e zerar novamente o aparelho em zero de absorbância ou
100% de transmitância.
5) Retirar o branco e colocar outra cubeta com a amostra de referência ou desconhecida, ler a
absorbância.
6) Se o espectrofotômetro tiver suporte para várias cubetas (carrossel) colocar o branco e completar
o carrossel com as cubetas das amostras ou padrões.
7) Se o espectrofotômetro for de duplo feixe, a cubeta do branco não é alternada com a cubeta das
amostras. As leituras do branco e amostras são sempre feitas simultaneamente. O feixe monocromático
da luz é dividido em dois antes dois feixes, um vai para o branco e o outro para a amostra.
Observações
1. O branco, dependendo do protocolo de análise, pode ser a cubeta só com o solvente, geralmente a
água, ou com o solvente e reagentes, conforme utilizado para amostras.
2. O objetivo do branco é descontar os erros devido à absorção da radiação pela cubeta, solvente,
reagentes e impurezas dos reagentes.
9. Procedimento para Tratamento dos Dados Experimentais:
9.1 Construção da curva de referência e determinação da concentração

desconhecida de um analito.
Método 1 (grosseiro): dois procedimentos
Colocar (plotar) as concentrações dos padrões, C (abscissa) e absorbâncias, A (coordenada)

80
em um papel milimétrico para obter a curva de calibração, C vs. A.
a) O resultado da concentração da amostra desconhecia é obtido por interpolação na curva de

referência.
b) Calcular a inclinação da reta (k) k = εb => A = k C
O resultado (C) é obtido dividindo A/k
Figura 8. A curva de referência descreve a relação linear entre a absorbância e a concentração, em

uma faixa de concentração onde a lei de Lambert-Beer é obedecida.
Método 2: determinação da equação da reta (método estatístico/recomendado)

Sabe-se que a equação da reta é calculada pela expressão:
ax + b – y = 0,
y = ax + b
onde,
x = concentração (C)
y = absorbância (A)
a = coeficiente angular da reta (slope)
b = coeficiente linear da reta (intercept y)
Equação da reta:
A = aC + b < = > C = (A - b)/a
Cd = (Ad – intercept)/Slope
Cd = Concentração desconhecida
Ad = Absorbância da amostra com concentração desconhecida

81
Matematicamente, a estimativa dos coeficientes de uma curva de calibração a partir de um

conjunto de medidas experimentais pode ser obtida através da regressão linear
Cálculo de a e b pelo método dos mínimos quadrados
a = [n(∑CA) - (∑C)(∑A)]/ [n(∑C2 ) - (∑C)2 ] (coeficiente angular)
b = [(∑A)(∑C2)-(∑C)(∑C.A)]/[n(∑C2)-(∑C)2] (coeficiente linear)
n = número de medidas (incluindo o branco)
A = Absorbância
C = concentração
n = número de medidas
Além dos coeficientes de regressão a e b, pode-se calcular o coeficiente de correlação (r) que
permite obter uma estimativa da qualidade da curva obtida. Quanto mais próximo de um, melhor é a
qualidade da curva. Uma curva boa deve ter pelo menos três noves após a vírgula.
Cálculo do coeficiente de correlação (r):
r = [n(∑C A) – (∑C) (∑A)]/ √{ [n(∑C2)-( ∑C)2][n(∑A2) – (∑A)2]}
10. Espectrofotômetro
O equipamento utilizado, um espectrofotômetro, é relativamente barato pela sua versatilidade.

Possibilita a quantificação de um grande número de analitos, possui boa sensibilidade e é de fácil
manuseio. Possivelmente o espectrofotômetro é o aparelho para análise química mais utilizado no
mundo. Em geral os espectrofotômetros possuem:
1) Fonte radiação
Para radiação no visível a fonte mais utilizada é uma lâmpada incandescente com filamento de
tungstênio (350-2500 nm), é utilizado também tungstênio-halogênio fornecendo também λ>350 nm
(tempo de vida de 10.000 horas).
Para radiação UV são utilizadas lâmpadas fluorescentes de hidrogênio, deutério e hélio que
emitem radiação entre 180 e 370 nm (tempo de vida de 1.000 horas).
Dependendo do espectrofotômetro pode-se ter:
1 lâmpada (360-1000 nm): para determinações no espectro do visível
2 lâmpadas (190-1100 nm): para determinações no UV-Vis
2 lâmpadas (175-3300 nm): para determinações no UV-Vis e Infravermelho
O feixe da radiação é direcionado para a face de um prisma ou para uma rede de difração,
através de um sistema colimador, para decompor a luz e separação da luz monocromática.

82
(a) (b)
Figura 9 . Representação de uma rede de difração (a) e um prisma (b)
2) Monocromador:
O monocromador é um sistema utilizado para dispersar a luz e selecionar um feixe

de comprimentos de ondas estreito, idealmente só com um comprimento de onda (radiação
monocromática). O monocromador é constituído por um sistema colimador, ou seja, um tubo que
recebe a luz da fonte e através de uma fenda de entrada, cuja largura é ajustável, conduz a luz para
lentes convergentes para aperfeiçoar o paralelismo da radiação. A luz colimada é incidida em um
prisma ou rede de difração para ser decomposta. Após a luz ser fracionada, a rede de difração ou prisma
é girado para sair a luz monocromática por uma fenda em direção a cubeta contendo a amostra. Para
espectrofotômetros de duplo feixe há um jogo de espelhos que divide o feixe da luz monocromática
em dois, um vai para a cubeta da amostra e o outro para a amostra.
3) Compartimento de cubetas:
As cubetas são utilizadas para colocar as amostras contendo o analito. Em geral se utiliza
cubetas com um caminho óptico de 1 cm. Alguns protocolos de análise recomendam cubetas de até
10 cm de caminho óptico para aumentar a sensibilidade da determinação. O aumento da sensibilidade
é proporcional a espessura da cubeta (lei de Lambert). Para isso é necessário trocar o adaptador de
cubetas para a espessura desejada.
As cubetas devem ser transparentes a radiação e podem ser de:
 Vidro ou plástico para o visível. No caso de plástico o solvente da amostra não deve atacar o
plástico.
 Cubetas de quartzo para o UV e Visível. Nas medidas com radiação UV só utilizar cubeta de
quartzo.
 Quando o espectrofotômetro também faz medicas de infra-vermelho (IR) utilizar cubetas de
quartzo livre de OH medidas no IR próximo.
As cubetas devem estar sempre bem limpas e sem marca dos dedos.

83
4) Detector:
O detector mede a intensidade da luz transmitida após a radiação passar pela cubeta com a
amostra e é medida em uma célula fotoelétrica ou fotmultiplicador e amplificador (galvanômetro).
10.1 Esquema do Espectrofotômetro:
Figura 10. Esquema básico de um espectrofotômetro
Espectrofotometro de duplo feixe
Os espectrofotômetros podem ser de um feixe ou de duplo feixe. Nos de duplo feixe a radiação
antes de atingir a amostra é desdobrada em dois feixes, um vai para a cubeta com a amostra e o
outro para a cubeta do branco. As medidas são realizadas simultaneamente e a absorção do branco é
descontada da amostra automaticamente.

84
Figura 11. Esquema de um espectrofotômetro UV-Vis de dois feixes.
Os espectrofotômetros mais modernos após a calibração fornecem a curva de calibração,

coeficiente de correlação, equação da reta e os resultados das absorbâncias e concentrações.
11. Limitações da Lei de Beer (Distorções da linearidade/erros)

Quando a reta não passa pela origem e foge da linearidade está ocorrendo desvios da Lei de
Beer.
Os fatores que causam os desvios são chamados de desvios reais, químicos e instrumentais.
a) Desvios Reais
A lei de Beer considera que os centros absorventes (espécies químicas) não interagem entre
si, isso só acontece para soluções ideais, muito diluídas. Quando a solução é concentrada (desvios
reais), ocorrem interações entre as moléculas ou íons, com formação de aglomerados, e a atividade do
analito torna-se menor que a concentração analítica, reduzindo a absorção de luz. O índice de refração
também é a afetado em concentrações altas. Assim, a Lei de Beer só é válida para soluções diluídas
(<0,01 mol/L).
O solvente não deve absorver a radiação utilizada para análise do analito.
b) Desvios químicos
Surgem quando parcialmente um analito se dissocia, associa, forma complexo, polimerização,

solvólise ou reage com o solvente para dar um produto que tem um espectro de absorção diferente
do analito na forma principal (desvios aparentes), pois a Lei de Beer estabelece que a absorbância
é diretamente proporcional à concentração real da espécie absorvente, mas não necessariamente
concentração total de um componente (soma do analito em todas as formas químicas),

85
Um equilíbrio químico é afetado pela diluição, o grau de dissociação depende da concentração.

Assim, quando o analito está envolvido em um equilíbrio químico e no preparo da amostra para análise
ocorrem diluições com os reagentes e o solvente, para ajustar a concentração dentro da linearidade
da lei de Beer, é alterdao a concentração inicial do analito. Por exemplo, o grau de ionização de um
ácido fraco varia com a diluição. Quando a diluição for pequena, isso pode ser solucionado com uso
de um tampão.
c) Desvios Instrumental
São desvios causados pela qualidade e limitações dos aparelhos (desvios aparentes), como por
exemplo, instabilidade da fonte, não linearidade do detector, introdução de radiação policromática,
limites para conseguir isolar faixas espectrais muito estreitas etc.
A lei só é válida para radiação monocromática, ou seja, para um único comprimento de onda
(λ), na prática é impossível de obter.
12. Regra Práticas para Diminuir os Desvios da Lei de Beer

 Uma concentração alta do analito na amostra é principal causa dos desvios da lei. A
absorbância aumenta proporcionalmente com a concentração, mas a partir de um ponto esta
proporcionalidade deixa de existir e a reta começa subir exponencialmente, conforme a figura
9.
A lei de Beer é somente valida dentro do limite de linearidade.
Figura 9. Desvio da lei de Beer para concentrações elevadas
 Para evitar este desvio (diminuir o erro) deve-se trabalhar em uma faixa em que a
absorbância fique entre 0 e 1.
 Se a absorbância da amostra foi alta, diluir a amostra e repetir a análise.
No UV muitas moléculas orgânicas, que não absorvem no visível (incolor) absorvem na
mesma banda (intervalo do espectro de absorção), ou seja pode ocorrer sobreposição

86
de parte das bandas, assim é necessário fazer um pré-tratamento químico para eliminar
o possível interferente do analito (espécie química de interesse).
 Só utilizar cubetas de alta qualidade.
 Só utilizar cubeta de quartzo no UV. Cubetas de vidro absorvem luz UV.

Ohweiler, O. A., Química Analítica Quantitativa, vol. 3, Livros Técnicos Científicos SA, Rio de Ja-
neiro, (1974).
Voet, D, Voet, J. G., Biochemistry, 2nd Ed. John Wiley & Sons, Inc. New York, (1995).
Atkins, P. W., Physical Chemistry, 5th Ed. Oxford Univ. Press, (1994)
Atkins, Peter and Julio de Paula. Physical Chemistry for the Life Sciences. New York: Oxford
University Press, 2006.
Gore, Michael. Spectrophotometry & Spectrofluorimetry. New York: Oxford University Press,
2000.
Owen, T., “Fundamentals of Modern UV-Visible Spectroscopy”, 1996.

87
Capítulo 11
Proteólise enzimática da carne
Luis Artur Loyola Chardulo
Jessica Moraes Malheiros
Victor Augusto Domingos Dias
Ana Paula Costa Rodrigues Ferraz
Fernando Broetto
Introdução
A sequência de eventos bioquímicos que influenciam o músculo no período ante e

postmortem são de suma importância para o entendimento da qualidade da carne. Após o abate
dos animais ocorre o rigor mortis, conhecido também por rigidez cadavérica, convertendo
assim o músculo em carne e dando início a degradações enzimáticas e desnaturação protéica
que variam de acordo com os procedimentos de conservação utilizados, tornando menos rígida
à carcaça.
A maciez da carne é o resultado de diferentes fatores, tais como a quantidade e
solubilidade do tecido conjuntivo, o encurtamento do sarcômero durante o desenvolvimento
do rigor e postmortem e a proteólise das proteínas miofibrilares (Koohmaraie & Geesink, 2006).
O amaciamento da carne ocorre devido a alterações ultra-estruturais, que enfraquecem
a integridade das fibras musculares no tecido muscular. Uma indicação da degradação das
proteínas miofibrilares musculares sob condições de pos mortem pode ser alcançado através da
determinação do grau de fragmentação de miofibrilas que define o comprimento médio destas,
sabendo que quanto menor são as miofibrilas maior a maciez.
As medidas da degradação das proteínas musculares no postmortem têm sido realizadas
através de diferentes técnicas, dentro das quais se destacam a eletroforese, a determinação
dos aminoácidos livres e a fragmentação das miofibrilas. Quanto aos métodos utilizados para
se calcular o índice de fragmentação miofibrilar (MFI), podemos citar dois. A primeira técnica
descoberta requer homogeneização do músculo e verificação das miofibrilas pela análise
microscópica, e a segunda, atualmente mais utilizada, também requer homogeneização do
músculo seguido da determinação total de proteína e medida da turvação das amostras ajustadas
para uma concentração comum de proteína (Hopkins et al., 2000). Este método reflete o grau
de proteólise, indicado através da ruptura e quebra de ligações miofibrilares na banda I (Taylor

88
et al., 1995).
Ultimamente a determinação do método do MFI é frequentemente utilizada por
pesquisadores de diversos países. A metodologia empregada e o processamento das amostras
nem sempre são os mesmos, encontrando assim alterações impactantes nos valores observados
entre os diferentes estudos. De acordo com as diferenças na metodologia podemos citar a
utilização de amostras frescas e congeladas, a velocidade e o tempo de homogeneização, o tipo
de homogeneizadores e fatores utilizados para os cálculos do índice.
Na determinação do MFI normalmente são utilizadas amostras de carne fresca
(Koohmaraie, 1990), mas é importante ressaltar que muitas vezes a única opção viável quando
há um grande número de amostras coletadas é o congelamento destas, para posterior realização
das análises. Sendo o tempo entre o descongelamento e a homogeneização muito curto, não
sendo suficiente para ocorrer alterações na proteólise (Hopkins et al., 2000). Diversos autores
optam pela opção da utilização de amostras congeladas em seus trabalhos (Culler et al., 1978;
Mc Donagh, 1998). Em resultados observados por Hopkins et al. (2000), com amostras frescas
e submetidas ao congelamento, indicaram que a velocidade de homogeneização interfere nos
valores de índice de fragmentação miofibrilar, de tal modo que a velocidade de homogeneização
a 15.000 rpm acaba com as possíveis diferenças entre o uso de amostras frescas e congeladas.
A duração do tempo de homogeneização é demonstrada em vários estudos como
interferente nos valores observados através de espectrofotômetro a 540 nm, sabendo-se que
os valores de MFI são baseados na quantidade de refração de luz que ocorre na suspensão de
miofibrilas. Quando os valores aumentam existe um correspondente aumento do número de
partículas em decorrência da fragmentação da estrutura miofibrilar pela atuação de enzimas
proteolíticas (Veeramuthu; Sams, 1999). Utilizando o método de turvação na análise de MFI,
Olson et al. (1976) demonstrou que as amostras necessitam de pelo menos 60 segundos de
homogeneização, a fim de fornecer resultados viáveis. Portanto, é de suma importância pesquisar
as diferentes metodologias e as condições de cada experimento para melhor adequação do
método a ser empregado.
O MFI tem sido amplamente adotado como método de avaliação indireta da extensão da
atividade proteolítica, pois reflete o tamanho das miofibrilas, prediz mais de 50% da variação
da maciez da carne (Hopkins et al., 2000), demonstrando uma alta correlação com índices de
maciez aferidos pela Força de Cisalhamento utilizando o equipamento Warner Bratzler Shear
Force e análise sensorial realizadas por “panelistas treinados” (Kriese et al., 2007; Culler et al.,
1978). Assim as miofibrilas mais curtas resultam em elevações do MFI e diminuição dos valores
obtidos pelo shear force, evidenciando consequentemente maior maciez (Moller et al., 1973).
Segundo Culler et al. (1978), valores do índice de fragmentação de 60 ou acima de 60 para o
músculo Longissimus dorsi denota-se uma carne muito macia, valores de 50 uma carne macia e
valores abaixo de 50 uma carne pouco macia.
Para músculos que não são grandes o suficiente para se determinar valores de shear force
ou análise sensorial, este índice torna-se bastante preciso e viável sendo utilizado na análise de
proteólise muscular como indicador de maciez da carne (Veiseth et al., 2001).

89
1. Procedimentos e Extração Protéica
1.1 Preparo da amostra
A coleta das amostras para realização da análise deve ser de 3 g do músculo em questão,
livre de gordura e tecido conjuntivo, embaladas em papel alumínio e devidamente identificadas.
Após a separação das alíquotas a análise pode ser realizada com as amostras estando frescas
ou congeladas.
1.2 Extração das proteínas
As amostras devem ser colocadas em tubos de centrífuga, para homogeneização em Ultra

turrax com haste de cisalhamento (Marconi - MA102/E) a 18000 rpm em 30 mL de tampão de
índice de fragmentação miofibrilar (TMFI) à 2°C (100mM KCl, 20mM de fosfato de potássio pH
7, 1mM EDTA, 1mM MgCl2 e 1mM NaN3, em pH 7,0) duas vezes por 30 segundos com mesmo
intervalo em gelo. Após a homogeneização as amostras deverão ser centrifugadas a 1000 x g
por 17 minutos à 2°C e o sobrenadante será descartado. O pellet deverá ser ressuspendido em
30 mL de TMFI à 2ºC e homogeneizado com bastão de vidro.
As amostras serão centrifugadas a 1000 x g por 17 minutos à 2°C e o sobrenadante será
novamente descartado. O pellet será então ressuspendido em 8 mL de TMFI à 2°C e submetido
ao Vortex até a amostra tornar-se bastante homogênea para ser filtrada em filtro de polietileno
com malha de 1 mm aproximadamente. Ao filtrado serão adicionados 7 mL de TMFI à 2°C para
a lavagem do tubo de centrífuga e auxiliar na filtragem.
Ao término da filtragem as amostras devem ser armazenadas em tubos falcon (15 mL)
sobre refrigeração.
2. Análises
2.1 Determinação da proteína
As análises serão realizadas em espectrofotômetro. Para isso, será necessário o

preparo de três tubos de ensaio. O primeiro tubo será o branco da amostra para a calibração
do equipamento, contendo apenas 1,0 mL de solução tampão e 4,0 mL de reagente/reativo de
Biureto. Os outros dois tubos irão conter 0,75 mL de solução tampão, 0,25 mL de amostra e 4,0
mL de reagente/reativo de Biureto (O reagente de Biureto deve ser colocado por último e com
o menor intervalo de tempo possível entre as amostras, pois é um reagente de cor e assim que
entra em contato com as proteínas se inicia a reação).

90
Os tubos de ensaio devem ser agitados após a adição do Biureto para que a reação
ocorra de maneira homogênea e colocados em local escuro por 30 minutos. Realiza-se a leitura
de absorbância em espectrofotômetro a 540 nm. As leituras obtidas pelo equipamento serão
anotadas para a determinação da quantidade de proteína e fornecimento dos valores de tampão
e amostra que devem ser utilizados para realização da segunda leitura.
2.2 Determinação do índice de fragmentação miofibrilar
As análises também serão realizadas através de leituras em espectrofotômetro. Para

isso, será necessário o preparo de dois tubos de ensaio, onde se deve adicionar quantidades
apropriadas de amostras e de solução tampão (TMFI), para que a concentração da solução seja
de 0,5 mg proteína/mL de solução, num total de 4 mL de solução.
Para zerar o equipamento utilizar a solução tampão (TMFI), submeter os tubos de
ensaio com amostra e TMFI ao Vortex para homogeneizar e realizar a leitura da absorbância no
comprimento de onda de 540 nm em espectrofotômetro.
 Cálculo
Para a determinação do índice de fragmentação miofibrilar (MFI), será necessário usar

a seguinte expressão:
MFI = 200 x absorbância
3. Preparo de Reagentes
A) Solução extratora: Tampão de MFI (TMFI) com pH 7,0:

Para o preparo do tampão é necessário fazer a solução utilizando água destilada com
temperatura de 2-4°C:
100 mM Cloreto de Potássio (KCl); 20 mM Fosfato de potássio monobásico (KH2PO4); 20 mM
Fosfato de potássio dibásico (K2HPO4); 1 mM Ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA); 1 mM
Cloreto de Magnésio (MgCl2⋅6H2O); 1 mM Ázida sódica (NaN3).
KCl............14,91 g
KH2PO4......2,72 g
K2HPO4......3,50 g
EDTA..........0,76 g
MgCl2..........0,41 g
NaN3...........0,13 g
Pesar os reagentes e dissolver em aproximadamente 700 mL de água destilada. Acertar

91
o pH para 7,0 utilizando solução de NaOH (Hidróxido de sódio - base) ou HCl (Ácido clorídrico -
ácido). Após o ajuste do pH, transferir para um balão volumétrico de 2,0 L e completar o volume
com água destilada. Armazenar em recipiente de vidro sob refrigeração.
B) Solução reagente/reativo de Biureto

Deve-se dissolver 1,5 g de Sulfato de cobre (CuSO4⋅5H2O) e 6 g de Tartarato de sódio e
potássio (KNaC4H4O6·4H2O) em 500 mL de água destilada. Preparar 300 mL de solução de NaOH
a 10% e transferir ambas as soluções para um balão volumétrico de 1,0 L e completar com água
destilada. Armazenar a solução em vidro âmbar.
4. Resultado
Para melhor compreensão da utilização do índice de fragmentação miofibrilar em cortes

cárneos, apresenta-se abaixo um roteiro para a determinação em animal da raça Nelore (Bos
indicus), animal Piemontês (Bos taurus), Frango e Cordeiro.
Conforme o procedimento descrito anteriormente, foram pesadas 3 g de músculo de
cada amostra livre de tecido adiposo e conectivo, foram extraídas as proteínas com o tampão de
extração (TMFI).
Após a realização das leituras (Tabela 1) no equipamento espectrofotômetro utilizando
o comprimento de onda de 540 nm, foi efetuado o cálculo para determinar o teor de proteína e
o valor encontrado de índice de fragmentação miofibrilar (MFI).
Tabela 1. Experimento prático sobre a determinação de índice de fragmentação miofibrilar (MFI)
Leituras em Absorbância
Leitura [Proteína] Volume Volume Leitura
Amostras MFI - 200
Proteína Amostra Tampão MFI
Nelore 0,339 25,84 0,08 3,92 0,254 50,80
Piemontês 0,348 26,57 0,08 3,92 0,376 75,20
Cordeiro 0,328 24,95 0,08 3,92 0,383 76,60
Frango 0,391 30,06 0,07 3,93 0,342 68,40
Essa prática é um exemplo simples para demonstrar através do cálculo o Índice de

fragmentação miofibrilar (MFI), sendo perceptível a diferença entre as amostra analisadas.
CULLER R. D., PARRISH, F. C., SMITH, G. C., CROSS, H. R. (1978). Relationship of myofibril
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Métodos de Trabalho em Bioquímica Vegetal e Tecnologia de Enzimas

Chapter · January 2014

Djanira Negrão F. Broetto

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Methods of fragmentation of lignin and lignin valorization View project

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Prof. Dr. Fernando Broetto

IBB/UNESP – Campus de Botucatu

MÉTODOS DE TRABALHO EM BIOQUÍMICA

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Tel.: (0xx11) 3242-7171

Fax: (0xx11) 3242-7172

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1. Células e tecidos vegetais. 2. Enzimas. 3. Plantas - Metabolismo. 4. Proteínas

Capítulo 2: Aminoácidos e Proteínas: estrutura química,

Capítulo 3: Atividade de lipoxigenases. ...................................................................... 19

Capítulo 4: Enzimas antioxidativas em pós-colheita de vegetais. .............................. 24

Capítulo 5: Enzimas antioxidativas em tecidos vegetais. ........................................... 29

Capítulo 6: Atividade da enzima Nitrato Redutase. .................................................... 35

Capítulo 7: Análise de proteínas por Eletroforese Nativa. ......................................... 41

Capítulo 8: Atividade da Invertase de Levedura: valores da constante de Michaelis-

Capítulo 9: Soluções Tampão: Conceito e Preparação. ..........................................

Capítulo 10: Espectrofotometria Quantitativa na Região do UV-Vis (180 - 800 nm). 70

Capítulo 11: Proteólise enzimática da carne. ......................................................... 87

MÉTODOS DE TRABALHO EM BIOQUÍMICA

Os trabalhos de laboratório, muitas vezes solitário ou em equipe, requerem

O estudo de enzimas é fundamental em bioquímica e fisiologia vegetal, visto que praticamente,

Métodos de Trabalho em Bioquímica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 01, p.01-05

2. Métodos para Coleta

Métodos de Trabalho em Bioquímica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 01, p.01-05.

3. Procedimentos e Extração de Enzimas em Tecidos Vegetais

Primeiramente, antes de realizar as extrações, é recomendável que as soluções tampão

3.2 Obtenção do extrato bruto

Métodos de Trabalho em Bioquímica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 01, p.01-05.

3.3 Uso de antioxidantes

A força centrífuga é um recurso básico na pesquisa em bioquímica vegetal, para separar

Exemplos de preparo de soluções tampão comumente utilizadas em processos de extração

A) Solução tampão Fosfato de Potássio 50 mM, com pH 7,8 (1 L):

B) Solução tampão de NaOH (PM = 40) a 0,05 M (600 mL).

Métodos de Trabalho em Bioquímica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 01, p.01-05.

Podemos obter através de duas formas:

27,218 g à 1000 mL x = 2,72 g

PASSOS, L.P. Métodos analíticos e laboratoriais em fisiologia vegetal. Coronel Pacheco:

Métodos de Trabalho em Bioquímica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 01, p.01-05.

O aminoácido é uma molécula orgânica composta por átomos de carbono, hidrogênio,

Figura 1. Estrutura molecular de um aminoácido simples

Através de ligações peptídicas sequenciadas de vinte aminoácidos, as proteínas são formadas.

Métodos de Trabalho em Bioquímica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 02, p.06-12.

O radical representado esquematicamente por “R” é o responsável pela diferenciação entre os

2. Propriedades Químicas e Elétricas

Métodos de Trabalho em Bioquímica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 02, p.06-12.

prótons) ou como base (receptor de prótons).

3. Curva de Titulação de um Aminoácido

Ao titular um aminoácido é possível determinar o efeito do pH sobre a sua estrutura devido

Ponto 1: Aminoácido totalmente protonado