Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho”

Faculdade de Ciências Farmacêutica

Produção e Separação de Biofármacos

PROJETO DE EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA VERDE

FLUORESCENTE (EGFP) EM Escherichia coli BL21 (DE3)

Prof.ª Dr.ª Valéria de Carvalho Santos Ebinuma

Prof. Dr. Heitor Buzetti Simões Bento
Técnico: Flávio Pereira Picheli
Estágio Docência: Me. Caio de Azevedo Lima

Bruno Coelho da Fonseca

Isadora Arcanjo Gori
Izadora Barreto Alves dos Santos
Mariana Ribeiro de Castro

Araraquara
2023
 Resumo

A extração e purificação da EGFP recombinante produzida em Escherichia coli é uma

técnica crucial na biologia molecular e em outras áreas de pesquisa. Existem diversas técnicas
disponíveis para a extração e purificação desta proteína, e duas que aqui serão empregadas
são a precipitação por sais e a precipitação por solventes orgânicos. A primeira é um método
simples e eficaz para a purificação de bioprodutos a partir de soluções celulares. Neste
processo, a solução celular contendo a EGFP é adicionada a um sal inorgânico, como o
sulfato de amônio, em uma concentração específica próxima à sua saturação. A proteína de
interesse é precipitada em função da redução da solubilidade no meio, enquanto as outras
proteínas permanecem solúveis. Após a separação do precipitado por centrifugação, é
possível realizar etapas de lavagem e concentração da biomolécula. Enquanto que a segunda
é uma técnica que se baseia na solubilidade diferencial de proteínas em diferentes solventes.
Neste processo, a solução celular contendo a biomolécula alvo é misturada com um solvente
orgânico, como o etanol ou n-butanol, como no presente caso, que é capaz de precipitar a
proteína. Após a precipitação, é possível realizar etapas de lavagem com outros solventes ou
com água. Em suma, a escolha da técnica de extração e purificação da EGFP recombinante
produzida em E. coli dependerá das características da proteína de interesse, das necessidades
do projeto e da presença de impurezas específicas. Cada método apresenta vantagens e
desvantagens que devem ser avaliadas cuidadosamente antes da escolha final.
SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO.................................................................................................................................. 5
1.1. Rompimento celular................................................................................................................... 5
1.2. Purificação.................................................................................................................................. 7
1.2.1. Características físico-químicas da EGFP......................................................................................... 9
1.2.2. Precipitação de Proteínas Contaminantes por Sais........................................................... 9
1.2.3. Purificação por solventes orgânicos................................................................................10
1.3. Eletroforese SDS-PAGE...........................................................................................................12
2. OBJETIVOS.....................................................................................................................................13
2.1. Objetivos específicos................................................................................................................13
3. MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................................................14
3.1. Fluxograma do processo...........................................................................................................14
3.2. Materiais................................................................................................................................... 14
3.2.1. Rompimento celular........................................................................................................14
3.2.2. Purificação...................................................................................................................... 14
3.2.3. Preparo tampão Tris-HCl................................................................................................ 15
3.2.3. Eletroforese SDS-PAGE................................................................................................. 15
3.3. Metodologia..............................................................................................................................15
3.3.1. Rompimento celular........................................................................................................15
3.3.2. Purificação...................................................................................................................... 16
3.3.2.1. Precipitação de Proteínas Contaminantes por Sais................................................16
3.3.2.2. Purificação por solventes orgânicos...................................................................... 17
3.3.2.2.1. Purificação por etanol.................................................................................. 17
3.3.2.2.2. Purificação por n-butanol.............................................................................18
3.3.2.2.3. Purificação por clorofórmio.........................................................................18
3.3.2.2.4. Extração da fase orgânica da etapa anterior por precipitação......................18
3.3.3. Ultrafiltração................................................................................................................... 19
3.3.4. Preparo do tampão Tris-HCl........................................................................................... 19
3.3.5. Eletroforese SDS-PAGE................................................................................................. 19
3.3.6. Descarte de resíduos........................................................................................................20
3.3.7. Métodos Analíticos......................................................................................................... 21
3.3.7.1. Quantificação de EGFP......................................................................................... 21
3.3.7.2. Método de Bradford.............................................................................................. 21
3.3.7.3. Análise de Pureza.................................................................................................. 22
4. RESULTADOS ESPERADOS........................................................................................................ 22
4.1. Rompimento celular................................................................................................................. 22
4.2. Precipitação de Proteínas Contaminantes por Sais...................................................................24
4.3. Purificação por solventes orgânicos......................................................................................... 24
4.4. Eletroforese SDS-PAGE...........................................................................................................25
5. CRONOGRAMA............................................................................................................................. 26
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................................................... 27
 1. INTRODUÇÃO

1.1. Rompimento celular

O rompimento celular é uma etapa importante em muitos processos biotecnológicos,

como a produção de compostos bioativos, enzimas e proteínas recombinantes, sendo de
extrema importância levar em consideração fatores como a eficiência, especificidade, custo e
impacto na qualidade da amostra, a fim de obter os resultados desejados com o mínimo de
impacto negativo possível.
Entre os métodos mecânicos de rompimento celular, o moinho de esferas e ultrassom
são amplamente utilizados. Cada um desses métodos apresenta vantagens e desvantagens
distintas: O ultrassom é um método não invasivo que utiliza ondas sonoras de alta frequência
para promover o rompimento celular. Este método tem sido amplamente utilizado em
diferentes processos biotecnológicos, no entanto, a eficácia do método pode ser influenciada
por vários fatores, como a potência do ultrassom, a duração do tratamento e a temperatura da
suspensão. Por outro lado, apesar de a ultrasonicação apresentar ótimos rendimentos em
escala laboratorial, não é adequada para aumento de escala, uma vez que, além do alto custo,
apresenta riscos à saúde devido ao ruído (CHISTI et al., 1986). Enquanto o rompimento
celular através de moinho de esferas é um processo mecânico que utiliza a fricção entre as
esferas e a amostra biológica para quebrar as células e liberar seu conteúdo intracelular. Entre
as vantagens deste método, podemos citar a alta eficiência de rompimento, a capacidade de
processar grandes volumes de amostras e a possibilidade de controle das condições de
processamento (Geciova et al., 2002). Porém, o método também pode apresentar
desvantagens como a geração de calor e estresse mecânico que podem afetar a integridade de
certos componentes celulares e a necessidade de um equipamento específico que pode ter um
alto custo inicial e de manutenção (CHISTI et al., 1986).
Dentre os métodos físicos não mecânicos, podemos citar a termólise e o choque
osmótico. A termólise envolve o aquecimento da suspensão celular a temperaturas elevadas,
acima do ponto de ebulição da água, para romper as células, sendo sua principal vantagem a
simplicidade do processo, uma vez que não requer equipamentos sofisticados. No entanto,
pode afetar negativamente a estrutura das moléculas biológicas, além de não ser adequada
para todas as amostras de células (MIDDELBERG et al., 1995). Já o choque osmótico é um
método que utiliza a mudança rápida na pressão osmótica para romper as células. Esse
procedimento envolve a suspensão celular em um meio hipotônico, seguido de uma rápida
transferência para um meio hipertônico. Seu maior benefício é a rápida ruptura celular e a
preservação da integridade das moléculas biológicas. No entanto, esse método pode ser
limitado pela concentração celular e pela resistência da célula à mudança osmótica (ISLAM
et al., 2017).
Os métodos químicos e enzimáticos não mecânicos para rompimento celular
envolvem a utilização de substâncias químicas, como detergentes e enzimas, para degradar ou
dissolver a membrana celular e liberar o conteúdo celular. Os detergentes são compostos que
interagem com a membrana celular para solubilizar e remover as proteínas da membrana, o
que leva à ruptura das células. A mais significativa vantagem deste método é a simplicidade
do processo e a capacidade de romper uma ampla variedade de células. Entretanto, pode levar
à desnaturação de proteínas e outros componentes celulares (ISLAM et al., 2017). As
enzimas, como a lisozima, podem ser usadas para romper a parede celular de algumas
bactérias e liberar o conteúdo celular. As enzimas são principalmente vantajosas por sua
especificidade para determinados tipos de células e a preservação de algumas moléculas
biológicas. No entanto, o uso das mesmas pode ser limitado por sua disponibilidade, custo e
eficácia em determinadas amostras (CRAPISI et al., 1993).
Sendo assim, apesar de haver diversos métodos de rompimento celular, o processo de
ultrasonicação se torna uma alternativa interessante, uma vez que os demais métodos podem
apresentar riscos de degradação da molécula de interesse, além de alto consumo de energia e
longos períodos de processamento (MARTINS et al., 2018). Conforme descrito pelos
mesmos autores, o rompimento celular da cepa de E. coli BL21 (DE3) [pLysS; pET28(a)] foi
realizado utilizando ultrasonicação, através da otimização de um protocolo já descrito
anteriormente na literatura por Jain et al. (2004).
Primeiramente, as células úmidas a 0,025 wt% foram homogeneizadas por meio de
um disruptor ultrassônico digital numa amplitude de 40%. Em seguida, para evitar a
desnaturação da proteína decorrente das altas temperaturas geradas pelo processo, as células
foram mantidas em banho de gelo. O número de ciclos do procedimento foi otimizado
utilizando 30 ciclos, sendo cada um correspondente a pulsos de 5s ON / 10s OFF. Essa
configuração se apresentou como a mais adequada para a liberação da proteína recombinante
uma vez que foi observado que um número de ciclos superior a 30 não promoveu um
aumento dos níveis de proteínas totais liberadas e que períodos menores de intervalos OFF
(como 5 segundos) provocaram a desnaturação da proteína de interesse, ao passo de que
períodos superiores a 5 segundos aumentaram, ainda que minimamente, o conteúdo de GFP
liberada nas amostras.
1.2. Purificação

A purificação, inclusive de proteínas, se faz de suma importância para garantir o

máximo rendimento e o grau de pureza necessário para que, neste caso, estas sejam aplicadas
e comercializadas livres de contaminantes, principalmente em se tratando de biofármacos,
imunobiológicos, etc., a fim de atender às regulamentações (determinadas pela Agência
Nacional de Vigilância Sanitária – ANVISA –, Food and Drug Administration – FDA –,
European Medicines Agency – EMA) e garantir a eficácia e a segurança do produto obtido
(IPEA, 2018; PRIVATO; MARTINEZ; SCHMIDT, 2020). Assim sendo, sabe-se que existem
diferentes e possíveis métodos para realizar a purificação de proteínas, tais como
cromatografias (troca iônica, exclusão molecular, afinidade, etc.), precipitação por sais como
salting-in e salting-out, purificação por solventes orgânicos, filtração (Microfiltração,
Ultrafiltração, Nanofiltração e Osmose Reversa) e afins. A Tabela 1 a seguir ilustra alguns
estudos feitos por diferentes métodos de purificação e quais mostram-se mais adequados para
determinada situação.
 Tabela 1: Estudos com diversos métodos de purificação de proteínas.

ARTIGO MÉTODO MATERIAIS RESULTADOS REFERÊNCIA

O teor de impurezas passou

de 87% (inicial) para 37% ao
final. A massa de proteínas
manteve-se constante no
Concentração e Membrana
concentrado, enquanto
Purificação das Filtrações: comercial de
ocorreu a redução de sólidos
Proteínas do Soro Diafiltração (DF) e polietersulfona BOSCHI (2006)
totais no decorrer do tempo
do Queijo por Ultrafiltração (UF) em módulo
de experimentação. A
Ultrafiltração espiral
membrana apresentou
retenção parcial da lactose,
dificultando a purificação
proteica.

Purificação de Coluna de leito

MANERA;
amiloglicosidase Cromatografia de fixo contendo Fator de Purificação de 9,9 e
MEINHARDT;
de Aspergillus Troca iônica resina aniônica recuperação de 47,6%
KALIL (2011)
niger DEAE-celulose

Brometo de
cetiltrimetilamô Utilizando a CTI,
Desenvolvimento Cromatografias: nio (CTAB), precipitação com CTAB e
do processo de Troca iônica (CTI), crioprecipitação crioprecipitação em pH 4,
purificação da afinidade por metais com ácido atingiu-se a pureza requerida
proteína A de (CAM), interações acético glacial, de PspA4Pro (>95%) com FIGUEIREDO
superfície de hidrofóbicas (CIH). CTI em recuperação entre 14% e (2014)
pneumococo do Precipitação por Q-Sepharose, 33%. As CAM e CIH não
clado 4 surfactante e CIH em contribuíram para o aumento
(PspA4Pro) crioprecipitação Fenil-Sepharose, da pureza e acarretaram em
CAM em grande perda de PspA4Pro.
IMAC-NÍQUEL

Purification of the
recombinant green
fluorescent
Sistema de Duas Etanol,
protein from
Fases Aquosas N-butanol,
tobacco plants Ao final recuperou-se 34,1%
(SDFA) - álcool-sal NaCl, sulfato de DONG et al.
using alcohol/salt de GFP e a pureza foi
e cromatografia de amônio, coluna (2019)
aqueous superior a 95%.
interação HiScreen Capto
two-phase system
hidrofóbica Butyl
and hydrophobic
interaction
chromatography

Purification and
characterization of Sulfato de
thermostable Salting-out, amônio (30-60% DIVAKAR;
As três etapas de purificação
organic Cromatografia de saturação), PRIYA;
resultaram em um rendimento
solvent-stable exclusão molecular coluna de GAUTAM
total de 32%.
protease from e troca aniônica cromatografia de (2010)
Aeromonas filtração em gel
veronii PG01
Fonte: Autores (2023).
1.2.1. Características físico-químicas da EGFP

Composta por 238 aminoácidos e com peso molecular de aproximados 29 kDa, a

proteína em si mostra-se termoestável após produzida, no entanto, o processo de produção é
termossensível – o rendimento proteico diminui significativamente em temperaturas
superiores a 30 ºC. A proteína nativa possui faixa de excitação em 395 nm e pico de emissão
em 508 nm. A fluorescência é emitida pela ciclização dos resíduos Ser 65 e Gly 67 (serina e
glicina, respectivamente), formando um intermediário denominado imidazolin-5-ona (YANG;
MOSS; PHILLIPS, 1996).
A EGFP (proteína verde fluorescente aprimorada) é uma variante monomérica e que
não precisa de agentes adicionais para exibir atividade de fluorescência (SOUSA, 2019) da
proteína de fluorescência verde (GFP) originalmente isolada da água viva Aequorea victoria
e é caracterizada por sua forte emissão de fluorescência verde quando exposta à luz
ultravioleta ou azul (SHANER et al., 2007). A diferença mais notável entre a GFP e a EGFP
é a maior fluorescência da versão aprimorada, além de possuir maior estabilidade, pois a
versão nativa da proteína demonstra indícios de desnaturalização por volta da temperatura de
37 °C, condição esta não apresentada na EGFP (LOPES et al., 2019).
De acordo com Yang, Moss e Phillips (1996), a formação do fluoróforo se dá pela
presença do resíduo de Gly 67 na GFP recombinante. Estudos mostraram que a proteína
purificada apresenta resistência à desnaturação, sendo necessário expô-la a tratamentos a
90 ºC e pHs inferiores a 4 e superiores a 12. Assim sendo, pode ser recuperada e renaturada
(parcial ou integralmente) após neutralização e/ou diálise. No entanto, apesar de a proteína
possuir certa estabilidade mesmo após mudanças em diversas condições ambientais, o pH é
um dos fatores que interfere diretamente na fluorescência desta, a qual é diminuída quando
em ambientes muito ácidos (ROBERTS et al., 2016).

1.2.2. Precipitação de Proteínas Contaminantes por Sais

De acordo com Moraes et al. (2013), a presença de elevada concentração salina no

meio proporciona a diminuição da solubilidade proteica, ocasionando a precipitação destas
proteínas ao gerar agregados proteicos. Tal efeito é denominado salting out e pode ser
realizado utilizando sais neutros como o sulfato de amônio.
O método de salting out é regido pelo princípio de interações hidrofóbicas a partir da
redução da camada de hidratação da proteína, podendo ser adotado como uma etapa de
concentração/purificação de baixa resolução que precede processos de alta resolução e possui
como vantagens o baixo custo e a possibilidade de recuperação da atividade proteica após a
solubilização. Ainda, os sais agem de tal maneira que há a estabilização da proteína contra I)
desnaturação; II) proteólise; e III) contaminação bacteriana. No entanto, possui como
principal desvantagem, neste caso, o caráter corrosivo do sulfato de amônio – que será
empregado para esta etapa (KILIKIAN; JR., 2020).
A eficiência dos sais neutros utilizados no método de salting out foi estudada por
Hofmeister em 1888. Os cátions e ânions que apresentaram maior poder de estabilidade e
desestabilidade proteica foram organizados de acordo com a Série de Hofmeister, ilustrada na
Figura 1 a seguir:

Figura 1: Série de Hofmeister.

Fonte: Patel et al. (2014).

Assim sendo, pode-se observar que ânions polivalentes como o sulfato e o fosfato,
bem como os cátions monovalentes amônio e potássio são boas escolhas para realizar a etapa
de salting out, pois têm baixa probabilidade de ocasionar a desnaturação proteica. De modo
geral, o sulfato de amônio é tido como um dos mais utilizados, pois sua solubilidade não
sofre grandes variações entre 0 e 30 ºC, além de garantir estabilidade à proteína e sua
densidade (1,235 g/cm3) ser inferior à densidade média de agregados proteicos (1,29 g/cm3),
fato este que favorece a precipitação (KILIKIAN; JR., 2020).

1.2.3. Purificação por solventes orgânicos

Esse tipo de metodologia é baseada na adição de um solvente orgânico – como etanol,

n-butanol ou clorofórmio – à solução de biomoléculas, causando uma redução na solubilidade
da biomolécula de interesse ou de contaminantes, resultando na formação de um precipitado.
As propriedades físico-químicas dos solventes orgânicos, como a polaridade e a capacidade
de formar ligações de hidrogênio, afetam a interação com a biomolécula, com o solvente em
que se encontra ou com os contaminantes e, portanto, influenciam a eficácia da precipitação.
Sendo assim, a escolha depende das propriedades da biomolécula a ser purificada e das
condições de precipitação, como temperatura e pH (BRITES et al., 2012). A precipitação por
solventes orgânicos é uma técnica amplamente utilizada na purificação de proteínas, ácidos
nucléicos e outras biomoléculas, com alta eficiência e baixo custo.
O etanol é uma molécula orgânica amplamente empregada na precipitação de
biomoléculas, tais como proteínas e ácidos nucleicos. A sua popularidade deve-se à sua
ampla disponibilidade, segurança e baixo custo. De acordo com Yoshikawa et al. (2012), o
etanol é capaz de provocar a precipitação de moléculas biológicas, uma vez que reduz a
solubilidade das proteínas e ácidos nucleicos. Entretanto, a eficácia da precipitação com
etanol pode ser influenciada pela presença de íons salinos e pelo pH da solução, o que pode
levar à co-precipitação de impurezas.
Em relação ao n-butanol, ele é frequentemente utilizado na precipitação de proteínas
em pH ácido, pois é menos hidrófilo do que o etanol e, portanto, mais eficaz na remoção de
íons solúveis em água. Além disso, o n-butanol é menos tóxico do que o clorofórmio e pode
ser facilmente removido por evaporação ou por lavagem com água. No entanto, a
concentração de n-butanol necessária para precipitação de proteínas pode variar dependendo
da proteína em questão e do pH da solução. É importante ressaltar que a precipitação com
n-butanol pode ser sensível à temperatura e ao tempo, e pode ser necessário otimizar esses
parâmetros para obter o máximo rendimento de recuperação da proteína (LOVRIEN et al.,
1997).
O clorofórmio é um solvente orgânico apolar que é capaz de precipitar lipídios e
outras biomoléculas hidrofóbicas. O mecanismo de precipitação por clorofórmio é baseado na
formação de complexos hidrofóbicos entre as moléculas de clorofórmio e as biomoléculas
hidrofóbicas presentes na solução (WESSEL; FLÜGGE, 1984). A adição de água à solução
precipitada de clorofórmio pode resultar na re-solubilização parcial das biomoléculas
precipitadas, mas a completa dissolução é difícil (CELIS, 2012).
A técnica de precipitação utilizando solventes orgânicos é uma estratégia efetiva e
simples para a purificação de biomoléculas. Contudo, a seleção do solvente orgânico deve ser
minuciosamente considerada em função da natureza química da biomolécula a ser purificada,
e a otimização das condições de precipitação deve ser executada para assegurar a eficiência e
o rendimento da biomolécula de interesse.
1.3. Eletroforese SDS-PAGE

A eletroforese é uma técnica laboratorial que permite separar moléculas de acordo

com o seu tamanho e carga elétrica. Essa técnica é usada para diversas finalidades, como
diagnóstico de doenças, identificação de microrganismos, teste de paternidade e análise de
proteínas. A eletroforese consiste na aplicação de um campo elétrico sobre um gel que
contém as amostras a serem separadas. As moléculas migram pelo gel em direções e
velocidades diferentes, dependendo da sua carga e massa. As moléculas menores e mais
carregadas migram mais rápido do que as maiores e menos carregadas. Para visualizar as
moléculas separadas, usa-se um corante fluorescente que emite luz sob uma fonte de UV ou
LED. O resultado da eletroforese é um padrão de bandas que representa os diferentes
fragmentos das moléculas analisadas (OLIVEIRA et al., 2015).
A SDS-PAGE é um método de eletroforese que permite separar proteínas com base no
seu tamanho. A SDS (sulfato de dodecil sódio) é um detergente anfipático que se liga às
proteínas e confere-lhes uma carga negativa uniforme, eliminando a influência da estrutura e
da carga intrínseca das proteínas. O meio é um gel de poliacrilamida descontínuo, que atua
como um filtro através do qual as proteínas se movem em resposta ao campo elétrico
(HAGIWARA, 2022). A técnica faz uso do β-mercaptoetanol, agente redutor que atua
rompendo as pontes dissulfeto que mantêm a estrutura terciária e quaternária das proteínas,
permitindo que elas sejam desnaturadas pelo calor e pelo SDS (“Immunodetection of bacteria
causing brucellosis”, 2020). As proteínas são separadas de acordo com as suas massas
moleculares, sendo as menores as que migram mais rapidamente em direção ao anodo. Para
visualização das bandas após a corrida, é necessário que haja um corante capaz de marcar as
proteínas, como é o caso do Coomasie Blue Brilliant G-250 (CBB G-250), um corante
triarilmetano que se liga às proteínas e permite a sua visualização no gel. O CBB G-250 tem
uma tonalidade azul esverdeada e é usado principalmente no ensaio de Bradford para a
quantificação de proteínas, este forma um complexo com as proteínas que absorve luz na
faixa do visível, com um máximo de absorção em 595 nm (GRINTZALIS; GEORGIOU;
SCHNEIDER, 2015). A figura 2, a seguir, exemplifica uma corrida de SDS-PAGE para
separação de EGFP.
 Figura 2: Corridas de SDS-PAGE para análise da separação de EGFP.

Fonte: Yakhnin et al. (1998).

2. OBJETIVOS

Realizar a extração da proteína verde fluorescente aprimorada (EGFP) produzida a

partir do cultivo de Escherichia coli BL21 (DE3) contendo os vetores plasmidiais pLyss e
PET28(a), tal como a purificação da mesma.

2.1. Objetivos específicos

● Realizar de forma bem sucedida a lise celular da bactéria Escherichia coli BL21
(DE3) a partir do método de ultrasonicação;

● Purificar de forma eficiente, por precipitação salina, a EGFP presente no extrato do

lisado celular;

● Quantificar os resultados de cada etapa através de métodos analíticos e avaliar o grau

de purificação obtido.
 3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Fluxograma do processo

Fonte: Autores, 2023.

3.2. Materiais

3.2.1. Rompimento celular

● Disruptor ultrassônico digital;

● Banho termostatizado;
● Banho de gelo;
● Centrífuga Hitachi - High Speed Refrigerated Centrifuge CR22N (R18 A).

3.2.2. Purificação

● Sulfato de amônio [(NH4)2SO4] anidro;

● Gelo;
● Etanol (maior pureza disponível, se possível analítico);
● n-Butanol (maior pureza disponível, se possível analítico);
● Clorofórmio (caso necessário) (maior pureza disponível, se possível analítico);
● Centrífuga Hitachi - High Speed Refrigerated Centrifuge CR22N (R18 A);
● Tubos para centrífuga;
● Balança semianalítica.
 3.2.3. Preparo tampão Tris-HCl

● Sal Tris (Tris(hidroximetil)amino metano) (MM = 121,14 g/mol);

● 100 mL de água Milli-Q;
● Ácido clorídrico (HCl);
● Medidor de pH de bancada Tecnopon previamente calibrado;
● Agitador magnético;
● Barra magnética cilíndrica;
● Frasco tipo béquer 100 mL.

3.2.3. Eletroforese SDS-PAGE

● Dodecil-sulfato de sódio (SDS) 10%;

● Acrilamida;
● Metileno-bis-acrilamida;
● Tampão Tris-HCl (0,5 M pH 6,8 e 1,5 M pH 8,8);
● Persulfato de sódio;
● Tetrametiletilenodiamina (TEMED);
● Glicerol;
● β-mercaptoetanol;
● Azul de bromofenol;
● Coomassie Brilliant Blue G-250;
● Metanol;
● Água;
● Sistema de eletroforese.

3.3. Metodologia

3.3.1. Rompimento celular

Primeiramente, os pellets de células previamente ressuspendidos em 6 mL de tampão

de extração (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0) e congelados a -20 °C em tubos cônicos tipo Falcon
de 50 mL, obtidos na fase prévia do projeto, serão descongelados em banho termostatizado à
temperatura de 40 °C até atingir o descongelamento total (LOPES et al., 2018).
Em seguida, assim como descrito por Martins et al. (2018), o rompimento celular de
E. coli BL21 (DE3) [pLysS; pET28a)] será realizado através do processo de ultrasonicação,
utilizando um disruptor ultrassônico digital (QR350 ©Ecosonics) numa amplitude de 40%
(correspondente a 112 W) em banho de gelo, com 30 ciclos totais, sendo cada um
correspondente a pulsos de 5s ON / 10s OFF, totalizando assim 7,5 minutos.
Por fim, as amostras serão então centrifugadas a 18.000 rpm (≈ 42200,65 x g), por 5
minutos a 4 ºC utilizando a centrífuga Hitachi - High Speed Refrigerated Centrifuge CR22N
(R18 A) e o sobrenadante resultante do processo será coletado a fim de promover a separação
do pellet contendo o debris celular.
Ademais, será coletado uma alíquota da amostra ao final do processo para análise da
pureza, de acordo com as equações apresentadas na seção de Métodos Analíticos e os
procedimentos propostos: Bradford para a determinação das proteínas contaminantes e leitura
da fluorescência para a concentração de EGFP.

3.3.2. Purificação

3.3.2.1. Precipitação de Proteínas Contaminantes por Sais

Conforme descrito por Yakhnin et al. (1998), para a realização da etapa de

precipitação, será adicionados ao sobrenadante coletado uma quantidade pré-determinada de
(NH4)2SO4 anidro em pó para se obter uma concentração final de 1,6 M (solução com 40% de
saturação - cerca de 4 M) e a solução resultante será incubada em gelo por 1 hora.
Como as células cultivadas foram inicialmente ressuspendidas em 6 mL de tampão
Tris-HCl, a massa m de (NH4)2SO4 em pó utilizada será determinada a partir da fórmula:

𝑚 = 𝑀. 𝑚𝑀 . 𝑉 (Equação 1)

Onde M corresponde à concentração molar, mM à massa molar de sulfato de amônio

e V ao volume de sobrenadante obtido após o rompimento celular. Dessa forma, tem-se:

𝑚 = 1, 6 . 132, 14 . 0, 006
𝑚 = 1, 27 𝑔 de (NH4)2SO4 em pó

Em seguida, após a incubação em gelo por 1 hora, a remoção das proteínas

precipitadas será feita por centrifugação a 18.000 rpm (≈ 42200,65 x g), por 5 minutos a 4 ºC,
utilizando a centrífuga Hitachi - High Speed Refrigerated Centrifuge CR22N (R18 A) e será
novamente adicionado uma quantidade pré-determinada de (NH4)2SO4 em pó ao
sobrenadante resultante da centrifugação para promover uma concentração final de 2,8 M
(solução com 70% de saturação).
 Da mesma maneira como feito anteriormente através da Equação 1, a massa m de
(NH4)2SO4 em pó utilizada será:
𝑚 = 2, 8 . 132, 14 . 0, 006
𝑚 = 2, 22 𝑔 de (NH4)2SO4 em pó

Ademais, após esse processo, assim como será feito após a etapa de rompimento
celular, será coletado uma alíquota da amostra resultante para análise da pureza, de acordo
com as equações apresentadas na seção de Métodos Analíticos e os procedimentos propostos
(Bradford para a determinação das proteínas contaminantes e leitura da fluorescência para a
concentração de EGFP).

3.3.2.2. Purificação por solventes orgânicos

É importante salientar que durante todas as etapas subsequentes de extração de EGFP,

as amostras serão protegidas da luz para evitar a perda da fluorescência. Além disso, da
mesma maneira como será feito para as etapas anteriores, ao final de cada extração, será
coletado uma alíquota da amostra resultante para posterior análise da pureza, de acordo com
as equações apresentadas na seção de Métodos Analíticos e os procedimentos propostos
(Bradford para a determinação das proteínas contaminantes e leitura da fluorescência para a
concentração de EGFP), a fim de se obter os desempenhos de cada processo para
comparações futuras.

3.3.2.2.1. Purificação por etanol

Partindo para a etapa de extração da proteína de interesse, a suspensão obtida na etapa

anterior, contendo tanto o sobrenadante quanto o precipitado em sulfato de amônio
(NH4)2SO4 anidro a 70%, será submetida a duas etapas de extração.
A primeira etapa envolve adicionar à suspensão um volume de ¼ de etanol (de
máxima pureza disponível) seguido de agitação vigorosa durante 1 minuto. A separação das
fases aquosa e etanólica será realizada através da centrifugação por 5 minutos a 18.000 rpm
(≈ 42200,65 x g) à temperatura ambiente. A proteína verde fluorescente será extraída na fase
orgânica (etanólica), que poderá ser observada como uma forte fluorescência verde da fase
superior sob luz do dia ou iluminação UV.
Analogamente, será adicionado à fase superior coletada anteriormente na primeira
1
etapa de extração um volume de 16
de etanol, novamente seguido de agitação vigorosa

durante 30 segundos e centrifugação por 5 minutos a 18.000 rpm (≈ 42200,65 x g) à

temperatura ambiente para promover a separação de fases. Dessa forma, a EGFP será mais
uma vez extraída na fase orgânica (etanólica), podendo ser identificada pela fluorescência
verde emitida. É importante ressaltar que ambas as fases etanólicas (que contêm a proteína de
interesse) serão coletadas cuidadosamente em cada etapa de extração a partir de sua rápida
versão em outro recipiente adequado e/ou com o auxílio de uma pipeta para evitar perturbar a
interface.

3.3.2.2.2. Purificação por n-butanol

Após a etapa de precipitação por etanol, uma solução contendo ¼ do volume de

n-butanol (de máxima pureza disponível) será adicionada à fase etanólica contendo EGFP
coletada anteriormente. A solução resultante será submetida à agitação vigorosa por 30
segundos e, posteriormente, centrifugada por 5 minutos a 18.000 rpm (≈ 42200,65 x g) em
temperatura ambiente para separação das fases. A proteína de interesse será identificada na
fase aquosa inferior, enquanto a fase orgânica superior poderá ser descartada.
Ao final desse processo, como descrito anteriormente, será analisada a pureza das
amostras de acordo com as equações descritas adiante na seção de Métodos Analíticos. Caso
apresente um valor inferior ao desejado (cerca de 80% de pureza), as amostras serão
submetidas às demais etapas de extração especificadas abaixo (seções 3.3.2.3. e 3.3.2.4.).

3.3.2.2.3. Purificação por clorofórmio

Em sequência à eliminação da fase orgânica superior, um volume equivalente de

clorofórmio (de máxima pureza disponível) será adicionado à fase aquosa inferior, onde a
EGFP estará presente. A mistura será agitada vigorosamente por 30 segundos e centrifugada
por 5 minutos a 18.000 rpm (≈ 42200,65 x g) em temperatura ambiente para separação das
fases. A fase aquosa superior, na qual EGFP estará presente, será coletada, e a fase inferior
seguirá para uma subsequente etapa de precipitação.

3.3.2.2.4. Extração da fase orgânica da etapa anterior por precipitação

A fase etanólica inferior decorrente da etapa anterior será submetida a um novo

processo de precipitação com um volume equivalente de uma solução de (NH4)2SO4 com
30% de saturação em água (massa de sulfato de amônio em pó calculada conforme o volume
da fase inferior resultante do processo anterior). Da mesma maneira como citado
anteriormente, a solução será submetida à agitação vigorosa durante 30 segundos e
centrifugada por 5 minutos a 18.000 rpm (≈ 42200,65 x g) em temperatura ambiente para
separação das fases. A fase aquosa superior contendo EGFP será coletada e combinada com a
outra fase aquosa obtida através da extração por clorofórmio, e a fase inferior será descartada.

3.3.3. Ultrafiltração

A fim de promover a separação entre a EGFP purificada do n-butanol e/ou

clorofórmio aplicado na extração (dependendo da necessidade de realização das etapas de
extração com clorofórmioF), será realizado o processo de Ultrafiltração utilizando uma
membrana apropriada, a qual pode possui diâmetro variando entre 1 e 500 nm, retendo assim,
macromoléculas e deixando passar apenas água e íons (SALA, 2013). A membrana em
questão deverá possuir cut off menor que 26,9 kDa (peso molecular da EGFP) (Prospec-Tany
Technogene Ltd., 2016) para que seja possível promover a retenção da mesma.

3.3.4. Preparo do tampão Tris-HCl

Serão preparados duas soluções de tampão Tris-HCl, uma à 0,5 M pH 6,8 e outra à 1,0
M pH 8,8, ambas tendo 100 mL de volume, para serem utilizados durante a eletroforese
SDS-PAGE. Para tal, serão pesados em balança analítica 6,057 g e 12,114 g de sal
Tris(hidroximetil)amino metano que será posteriormente dissolvido em cerca de 50 mL de
água Milli-Q dispostos em frasco béquer de 100 mL. Após a completa dissolução da base,
será utilizado um Medidor de pH de Bancada Tecnopon para medir o pH da solução. O ajuste
se dará a partir do gotejamento de solução de ácido clorídrico (HCl) com auxílio de um
agitador magnético para manter a agitação constante e facilitar a ionização do ácido. Após a
correção, as soluções deverão ser transferidas para um balão volumétrico de 100 mL, tendo
seu volume completado e aferido segundo a calibração da vidraria.

3.3.5. Eletroforese SDS-PAGE

Para análise qualitativa dos resultados, amostras do extrato celular obtido após
processo de lise e amostras obtidas após a purificação da proteína serão submetidas à
eletroforese utilizando SDS-PAGE 10%.
Baseado na metodologia de Magalhaes; Arruda (2007), o gel de empilhamento deverá
ser composto água Milli-Q, SDS 10% (m/v), Acrilamida 12,5% (m/v),
Metileno-bis-acrilamida 0,4% (m/v), tampão Tris-HCl (1,0 M pH 8,8), 10% (m/v) de
Persulfato de amônio e Tetrametiletilenodiamina (TEMED). As proporções da placa devem
ser de 10 cm x 10 cm.
 Para cada poço deve haver uma quantidade de 5 μg de proteína de interesse, no caso a
EGFP, em um volume de 20 μL de solução, pois será a quantidade a ser injetada no gel para
corrida, sendo assim, será necessário realizar a quantificação das amostras de tal modo a
saber quanto deve ser retirado para chegar no valor desejado. Serão utilizados proteínas de de
tamanho molecular conhecidos para o padrão de comparabilidade da corrida.
Como será uma eletroforese SDS-PAGE utilizando Coomassie Brilliant Blue G-250,
deverão ser preparados 10 mL do tampão de desnaturação, contendo 0,8 mL de Tris-HCl (0,5
M, pH = 6,8); 1,0 mL de glicerol; 2,0 mL de SDS 10% (m/v); 0,5 mL de β-mercaptoetanol;
0,2 mL de azul de bromofenol e volume completado com água. As amostras deverão então
ser submetidas a condições de desnaturação, com banho fervente a 100 °C por 5 minutos.
Após o resfriamento das amostras, estas serão injetadas nos poços para iniciar a corrida, com
a corrente elétrica constante de 100 V e 20 mA. Os reservatórios deverão conter tampão Tris
(0,25 mol/L), glicina (1,92 mol/L) e SDS (0,1% (m/v)).
Ao término da corrida, o gel deve ser retirado cuidadosamente para não sofrer danos e
então submerso em uma solução de coloração contendo 0,15 g de Coomassie Brilliant Blue
G-250, 90 mL de metanol, 30 mL de ácido acético e 180 mL de água Milli-Q por 2 horas. Em
seguida, o gel deve ser lavado, sendo transferido para a mesma solução, porém sem o corante
Coomassie Brilliant Blue G-250, por 10 horas.

3.3.6. Descarte de resíduos

De acordo com a RDC Nº 306, de 7 de dezembro de 2004, os materiais biológicos

pertencentes ao grupo denominado A1, tais como culturas microbianas/estoques de
microrganismos; meios de cultura e instrumentais utilizados para transferência, etc.
necessitam passar por um tratamento prévio para que sejam descartados; enquanto os
materiais pertencentes ao grupo B são os resíduos de substâncias químicas que, a depender de
suas características como inflamabilidade, corrosividade e toxicidade, podem apresentar risco
tanto para a saúde pública como para o meio ambiente.
Portanto, o material contendo o lisado celular será inicialmente autoclavado para
garantir a descontaminação antes de ser descartado, enquanto que os resíduos das substâncias
químicas utilizadas na metodologia serão descartados conforme as normas vigentes (os
considerados não perigosos poderão ser tratados como lixo comum e a depender das
características, serão acondicionados em locais específicos para então serem descartados de
maneira adequada) [LASSALI, 20--].
 3.3.7. Métodos Analíticos

3.3.7.1. Quantificação de EGFP

A quantificação da EGFP será realizada através da leitura da fluorescência utilizando

uma leitora de placas EnSpire® Multimode Plate Reader em microplaca preta de fundo chato
e preto de 96 poços, selecionando o comprimento de onda de 488 nm para excitação e 507
nm para leitura da emissão. A concentração de EGFP (mg/L) será determinada através da
curva fornecida pelos docentes (LOPES et al., 2018).

3.3.7.2. Método de Bradford

Para as quantificações de proteínas totais que serão realizadas ao longo do projeto,

será aplicado o método de Bradford (1976). Para tal, deverá ser preparado o reagente
específico da técnica, pensado para 100 mL de solução. Deverá ser pesado, em um frasco
béquer de 5 mL, 1 mg do sal Coomassie Brilliant Blue G-250 e dissolvidos em 5 mL de
etanol 95%, para em seguida adicionar 1 mL de ácido fosfórico 85% (m/v). Após a
dissolução do reagente, deverá ser adicionado ao frasco, de forma vagarosa,
aproximadamente 50 mL de água Milli-Q. A solução deverá então ser transferida a um balão
volumétrico calibrado para 100 mL e então completar o volume restante com água Milli-Q
até a aferição do menisco. Para finalizar o preparo da solução reagente, esta deverá ser
filtrada a partir de papel filtro.
Para construção da curva analítica, será utilizada uma solução padrão de albumina
bovina sérica (BSA - Bovine Serum Albumin, Sigma-Aldrich) 1 mg/mL. Serão preparadas seis
amostras, contando com o branco, retirando 10, 20, 30, 40 e 50 μL da solução padrão e
diluindo-as em água Milli-Q até completarem o valor de 100 μL, deve-se adicionar também 1
mL do reagente de Bradford para cada uma delas (NOBLE; BAILEY, 2009). As amostras
serão preparadas em tubos de centrífuga de 2 mL, em triplicata, e o branco será composto
somente por água e reagente. Estas deverão descansar por cerca de 5 minutos e então
transferidas para cubetas, onde serão analisadas a por espectrofotometria, no comprimento de
onda de 595 nm.
Após as leituras, deve-se criar a curva de calibração responsável pela quantificação
das proteínas totais, considerando sempre o fator de diluição utilizado na construção da reta,
no caso, de 1:100. As análises serão feitas em triplicatas, onde deverão ser retirados 20 μL da
amostra em questão, transferida para um tubo centrífuga de 2 mL onde será misturada com 1
mL do reagente preparado. Estas deverão descansar por 5 minutos e então medir suas
absorbâncias por espectrofotômetro a 595 nm.

3.3.7.3. Análise de Pureza

A eficiência das metodologias de purificação serão avaliadas submetendo os

resultados de concentrações de EGFP e proteínas totais ao cálculo apresentado na equação
X, disposta a seguir.
𝐶𝑥
𝑃 (%) = 𝐶𝑇
. 100 (Equação 2)

Onde P representa o grau de pureza em porcentagem, Cx equivale à concentração de

EGFP e CT a concentração de contaminantes. Para cada etapa da purificação, será avaliado
também o aumento de pureza por precipitação, utilizando a equação X a seguir:

𝑃𝑛
𝐴𝑃 = 𝑃𝑛−1
(Equação 3)

Em que Pn representa a pureza calculada no estágio atual e Pn-1 equivale ao grau de

pureza obtido no estágio anterior de precipitação.
Será realizado também o cálculo de porcentagem de recuperação da EGFP a partir das
amostras obtidas, utilizando a equação X.
𝐶𝑥𝑛. 𝑉𝑛
η(%) = 𝐶𝑥𝑜. 𝑉𝑜
. 100 (Equação 4)

Tal que Cxn representa a concentração de EGFP no estágio atual de purificação e Vn o

volume da amostra em que a mesma se encontra, enquanto Cxo equivale a concentração de
EGFP inicial, antes da purificação, e Vo o volume em que se encontrava.

4. RESULTADOS ESPERADOS

4.1. Rompimento celular

Espera-se que o método de rompimento celular selecionado seja eficiente para

promover a liberação e prevenção da desnaturação da proteína recombinante produzida,
conforme citado anteriormente, visto que o processo de rompimento celular, empregando-se
banho de água gelada e ultrassom para a precipitação de proteínas é uma técnica altamente
eficiente para a obtenção de proteínas a partir de sedimento bacteriano, uma vez que garante a
estabilidade das proteínas obtidas. No entanto, é importante destacar que as condições
experimentais podem variar em função do tipo de célula e proteína que se deseja obter, sendo
necessário adaptar o protocolo para cada caso específico.
Ho et al. (2008) verificaram o desempenho de diferentes métodos de rompimento
celular (interrupção da célula de moagem de esferas, homogeneização de alta pressão,
ultrasonicação e lise celular enzimática) para a liberação de proteína recombinante do
antígeno central da Hepatite B em Escherichia coli e relataram que a ultrasonicação
apresentou o segundo melhor resultado, promovendo cerca de apenas 13% a menos de
proteína de interesse liberada quando comparado a homogeneização de alta pressão.
Benove e Al-Ibraheem (2002) também compararam diferentes métodos de
rompimento celular em E. coli, como Prensagem francesa, Sonicação, congelamento e
descongelamento e moinho de bolas e observaram que a sonicação apresentou o melhor
desempenho quando comparado ao processo de congelamento e descongelamento, visto que
esse último não se mostrou eficiente para a obtenção de um alto teor de concentração de
proteína ou para a liberação de enzimas viáveis.
Neste momento, espera-se que o sobrenadante esteja carregado com diversas
proteínas, tanto a EGFP de interesse, quanto contaminantes resultantes do metabolismo
celular da E.coli. Considerando que serão tomados os devidos cuidados para não danificar as
proteínas durante o processo de lise celular, estima-se que a concentração de EGFP, se
mantenha igual, ou próxima, ao valor obtido na quantificação realizada no cultivo, sendo de
35,85 mg/L (3,37 mg em 94 mL de meio). No entanto, é de ciência que possa haver perda de
produto durante a metodologia, seja resultado do processo de rompimento celular,
centrifugação ou na própria coleta do sobrenadante, sendo assim é possível que haja redução
da concentração de EGFP.
No que se diz respeito às proteínas totais, é difícil estimar um valor preciso do que
será quantificado, no entanto, McRae et al. (2005) mostrou que em condições de cultivo de
E.coli semelhantes ao realizado neste projeto, o sobrenadante do extrato da lise celular
apresentou valor de 25 mg de proteínas contaminantes para uma liberação de 4,2 mg de
EGFP resultantes de 100 mL de cultivo. O autor utilizou altas pressões para romper as
células, embora, por seu resultado, é possível estimar que haja uma massa de proteínas totais
semelhante ao mostrado pelo mesmo.
4.2. Precipitação de Proteínas Contaminantes por Sais

O sulfato de amônio (NH4)2SO4 é amplamente utilizado como precipitante para

purificação inicial da EGFP (YAKHNIN et al., 1998; PECKHAM et al., 2006; ZHOU et al.,
2006; McRae et al., 2005; VESSONI et al., 2002; SKOSYREV et al., 2003; SAMARKINA
et al., 2009).
McRae et al. (2005) obtiveram uma redução de 10 g (cerca de 60%) de proteínas
contaminantes através da precipitação por sulfato de amônio, promovendo um aumento da
pureza da amostra de EGFP de 17% para 27% com relação ao conteúdo presente inicialmente
no lisado celular.
Por sua vez, Yakhnin et al. (1998) reduziram a quantidade de proteínas contaminantes
no lisado celular de GFP de 152 g para 106 g (aproximadamente 30% de redução) através da
precipitação com sulfato de amônio, sendo o Fator de Purificação aumentado de 1 para 1,4.
Zhou et al. (2006) alcançaram 64,8 g de proteínas contaminantes após precipitação
com sulfato de amônio quando comparado a cerca de 118,4 g no extrato inicial após
rompimento celular (cerca de 45% de redução), apresentando um Fator de Purificação de 1,7
nesta etapa de precipitação.
Packham et al. (2006) conseguiram uma redução de aproximadamente 3,6 g (cerca de
34%) de proteínas contaminantes após a precipitação com (NH4)2SO4, obtendo um Fator de
Purificação de 1,4 nessa etapa, quando comparado a 1 resultante da etapa de lise celular.
Dessa forma, é esperado que a etapa de precipitação utilizando sulfato de amônio seja
eficiente para a redução das proteínas contaminantes presentes no extrato após o rompimento
celular, apresentando uma redução de 30-60% das proteínas contaminantes com base nos
artigos citados.

4.3. Purificação por solventes orgânicos

A purificação de EGFP através de solventes orgânicos é uma técnica amplamente

utilizada em pesquisas de biotecnologia e bioquímica. Neste estudo serão utilizados etanol,
n-butanol e (caso necessário) clorofórmio, para purificar e isolar a proteína de interesse a
partir de uma mistura complexa de outras proteínas e compostos derivados do extrato celular.
Espera-se que a purificação de EGFP utilizando os solventes orgânicos mencionados
apresente uma alta eficiência de separação da proteína alvo em relação aos outros compostos
presentes na mistura e que as perdas sejam mínimas. Além disso, espera-se que a técnica seja
capaz de produzir uma proteína de alta pureza e qualidade, adequada para ser utilizada em
experimentos e estudos.
Dong et al. (2019) utilizou a técnica de purificação de EGFP por meio de sistema
bifásico aquoso, com sais – sulfeto de amônio e cloreto de sódio – e solventes orgânicos –
etanol e n-butanol – seguida de cromatografia de interação hidrofóbica. Os autores
observaram grande diminuição da quantidade da proteína de interesse (de 51,2% para 34,1%)
e baixo aumento da pureza (de 89,4% para 96,6%) após a etapa de purificação de alta
resolução.
Desta forma, espera-se que sua metodologia de purificação de baixa resolução
proporcione ao menos 80% de pureza ao fim do desenvolvimento do presente trabalho.
Entretanto, se a meta de pureza não for alcançada, deve-se seguir para o último passo da
metodologia proposta por Yakhnin et al. (1998), que realizou a purificação de EGFP
utilizando os mesmos solventes que o trabalho de 2019, e finalizando com clorofórmio, etapa
que apresentou alta eficiência. Portanto, espera-se que seja obtida, ao menos, 80% de pureza
da proteína.
Além da eficácia na purificação da proteína alvo, espera-se que a técnica de
purificação utilizando solventes orgânicos seja capaz de produzir EGFP com alta
fluorescência e estabilidade, o que permitirá sua utilização em experimentos de fluorescência
e microscopia de fluorescência.
Por fim, espera-se que estudos futuros possam aprimorar a técnica de purificação de
EGFP utilizando solventes orgânicos, otimizando as condições de purificação para produzir
uma proteína EGFP ainda mais pura e de alta qualidade, e tornando-a ainda mais eficiente e
escalável para uso em diferentes aplicações.

4.4. Eletroforese SDS-PAGE

A eletroforese SDS-PAGE será feita utilizando amostras de dois momentos

específicos da prática, portanto espera-se que as corridas apresentem características distintas
entre si, correspondentes aos momentos em que as amostras foram preparadas. Como a
primeira amostra será retirada do extrato obtido após a lise celular e como citado na seção
4.1, espera-se que haja diversas proteínas ao longo das bandas de diversos tamanhos,
inclusive a proteína de interesse, a EGFP, na banda equivalente a 26,9 kDa, uma vez que este
seja o tamanho molecular que a mesma apresenta (CHALFIE, 2005).
 Já a corrida referente à segunda amostra, representa o momento após os processos de
purificação, sendo assim é esperado que as proteínas contaminantes, que ocupavam as
diversas bandas do gel, não se façam mais presente, estando somente ocupada a banda
referente ao tamanho molecular da EGFP, representando a eficiência da purificação da
proteína de interesse.

5. CRONOGRAMA

Figura 2: Cronograma da etapa de extração.

Fonte: Autores (2023).

 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ANDRADE, K. K. S.; DUARTE, H. S. Solubilização e Precipitação de Proteínas Pelo Método “Salting In” e
“Salting Out”. 2011. Disponível em: <http://www.eventosufrpe.com.br/2011/cd/resumos/R0112-2.pdf>. Acesso
em: 24 abr. 2023.

BENOV, L.; AL-IBRAHEEM, J. Disrupting Escherichia coli: A Comparison of Methods. Journal Of

Biochemistry and Molecular Biology, v. 35, n. 4, p. 428–431, 2002. Disponível em:
<https://www.researchgate.net/publication/11126409_Disrupting_Escherichia_coli_A_Comparison_of_Methods
>. Acesso em: 24 abr.

BOSCHI, J. R. Concentração e Purificação das Proteínas do Soro de Queijo por Ultrafiltração. Dissertação
(Mestrado em Engenharia Química) – Universidade Federal do Rio Grande do Sul. 2006. Disponível em: <
https://www.lume.ufrgs.br/bitstream/handle/10183/8693/000586800.pdf?sequence=1&isAllowed=y>. Acesso
em: 25 abr. 2023.

BRASIL. Resolução da Diretoria Colegiada - RDC Nº 306, de 7 de dezembro de 2004. Dispõe sobre o
Regulamento Técnico para o gerenciamento de resíduos de serviços de saúde. Disponível em:
<http://www.fiocruz.br/biosseguranca/Bis/manuais/legislacao/residuos/lei%20federal/RDC%20N%20306,%20
DE%207%20DE%20DEZEMBRO%20DE%202004.pdf>. Acesso em: 10 mar. 2023.

BRITES, L. M. et al . Lat. Am. appl. res., Bahía Blanca , v. 42, n. 1, p. 65-70, jan 2012 . Disponível em
<http://www.scielo.org.ar/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0327-07932012000100011&lng=es&nrm=iso>.
accedido en 25 abr. 2023.

BRADFORD, M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein
Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Analytical Biochemistry, v. 72, n. 1-2, p. 248–254, 7 maio
1976.

CELIS, J. Two-Dimensional Gel Electrophoresis of Proteins. [s.l.] Elsevier, 2012.

CHALFIE, M.; KAIN, S. R. (Ed.). Green fluorescent protein: properties, applications and protocols. John
Wiley & Sons, 2005.

CRAPISI, A. et al. Enhanced microbial cell lysis by the use of lysozyme immobilized on different carriers.
Process Biochemistry, [S.L.], v. 28, n. 1, p. 17-21, 1993. Elsevier BV. Disponível em:
<http://dx.doi.org/10.1016/0032-9592(94)80031-6>. Acesso em: 24 abr. 2023.

DIVAKAR, K.; PRIYA, J. D. A.; GAUTAM, P. Purification and characterization of hermostable organic
solvent-stable protease from Aeromonas veronii PG01. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, v. 66, n.
3–4, p. 311-318, 2010. Disponível em: <www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1381117710001499>.
Aceso em: 25 abr. 2023.

DONG, J. et al. Purification of the recombinant green fluorescent protein from tobacco plants using alcohol/salt
aqueous two-phase system and hydrophobic interaction chromatography. BMC Biotechnology, v. 19, n. 1, dez.
2019.

FIGUEIREDO, D. B. Desenvolvimento do processo de purificação da proteína A de superfície de

pneumococo do clado 4 (PspA4Pro). 2014. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Universidade de São
Paulo, São Paulo, 2014. Disponível em: <doi:10.11606/D.87.2018.tde-22102018-152147>. Acesso em: 25 abr.
2023.

GECIOVA, Jana et al. Methods for disruption of microbial cells for potential use in the dairy industry—a
review. International Dairy Journal, [S.L.], v. 12, n. 6, p. 541-553, 2002. Elsevier BV. Disponível em:
<http://dx.doi.org/10.1016/s0958-6946(02)00038-9>. Acesso em: 24 abr. 2023.

23
GRINTZALIS, K.; GEORGIOU, C. D.; SCHNEIDER, Y.-J. An accurate and sensitive Coomassie Brilliant Blue
G-250-based assay for protein determination. Analytical Biochemistry, v. 480, p. 28–30, jul. 2015. Disponível
em: <https://doi.org/10.1016/j.ab.2015.03.024>. Acesso em: 24 abr. 2023.

HAGIWARA, M. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis and western blotting analyses via
colored stacking gels. Analytical Biochemistry, v. 652, p. 114751, set. 2022. Disponível em:
<https://doi.org/10.1016/j.ab.2022.114751>. Acesso em: 23 abr. 2023.

HO, C.W., Tan, W.S., Yap, W.B. et al. Comparative evaluation of different cell disruption methods for the
release of recombinant hepatitis B core antigen from Escherichia coli. Biotechnol Bioproc E 13, 577–583
(2008). Disponível em: <https://doi.org/10.1007/s12257-008-0020-9>. Acesso em: 24 abr. 2023.

Immunodetection of bacteria causing brucellosis. Methods in Microbiology, v. 47, p. 75–115, 1 jan. 2020.

INSTITUTO DE PESQUISA ECONÔMICA APLICADA. Biofármacos no Brasil: Características,

Importância e Delineamento de Políticas Públicas Para Seu Desenvolvimento. Brasília: Rio de Janeiro: Ipea.
2018. Disponível em: <https://repositorio.ipea.gov.br/bitstream/11058/8522/1/TD_2398.pdf>. Acesso em: 25
abr. 2023.

ISLAM, Mohammed Shehadul et al. A Review on Macroscale and Microscale Cell Lysis Methods.
Micromachines, [S.L.], v. 8, n. 3, p. 83, 2017. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.3390/mi8030083>. Acesso
em: 24 abr. 2023.

KILIKIAN, B. V.; JR., A. P. Purificação de produtos biotecnológicos: operações e processos com aplicação
industrial. Editora Blucher, 2020. Disponível em:
<https://integrada.minhabiblioteca.com.br/#/books/9788521219477/>. Acesso em: 21 abr. 2023.

LASSALI, T. A. F. Gerenciamento de Resíduos Químicos: Normas e Procedimentos Gerais. Universidade de

São Paulo, Laboratório de Resíduos Químicos. 20--. Disponível em:
<https://www.sorocaba.unesp.br/Home/CIPA/normas_gerenciamento.pdf>. Acesso em: 25 abr. 2023.

LOVRIEN, Rex E. et al. Selective Precipitation of Proteins. Current Protocols In Protein Science, [S.L.], v. 7,
n. 1, mar. 1997. Wiley. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1002/0471140864.ps0405s07>. Acesso em: 24 abr.
2023.

MAGALHAES, C.; ARRUDA, M. Sample preparation for metalloprotein analysis: A case study using horse
chestnuts. Talanta, v. 71, n. 5, p. 1958–1963, 30 mar. 2007. Disponível em: <10.1016/j.talanta.2006.08.039>.
Acesso em: 24 abr. 2023.

MANERA, A. P.; MEINHARDT, S.; KALIL, S. J. Purificação de amiloglicosidase de Aspergillus niger.

Semina: Ciências Agrárias, [S. l.], v. 32, n. 2, p. 651–658, 2011. Disponível em:
<https://ojs.uel.br/revistas/uel/index.php/semagrarias/article/view/3499>. Acesso em: 25 abr. 2023.

MARTINS, Margarida et al. Extraction of recombinant proteins from Escherichia coli by cell disruption with
aqueous solutions of surface-active compounds. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, v. 93, n.
7, p. 1864-1870, 2018. Disponível em: <http://hdl.handle.net/11449/170804>. Acesso em: 21 abr. 2023.

MCRAE, S. R.; BROWN, C. L.; BUSHELL, G. R. Rapid purification of EGFP, EYFP, and ECFP with high
yield and purity. Protein Expression and Purification, v. 41, n. 1, p. 121–127, 2005. Disponível em:
<https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/15802229/>. Acesso em: 19 abr. 2023.

MIDDELBERG, A. P.J. et al. Process-scale disruption of microorganisms. Biotechnology Advances, [S.L.], v.

13, n. 3, p. 491-551, jan. 1995. Elsevier BV. Disponível em:
<http://dx.doi.org/10.1016/0734-9750(95)02007-p>. Acesso em: 24 abr. 2023.

MORAES, C. S. et al. Métodos experimentais no estudo de proteínas. (Série em biologia celular e

molecular). Rio de Janeiro: Instituto Oswaldo Cruz, 2013.

24
NOBLE, J. E.; BAILEY, M. J. A. Quantitation of protein. Methods in enzymology, v. 463, p. 73–95, 2009.
Disponível em: <10.1016/S0076-6879(09)63008-1>. Acesso em: 21 abr. 2023.

OLIVEIRA, E. et al. ELETROFORESE: CONCEITOS E APLICAÇÕES. Enciclopédia Biosfera, p.

1129–1149, 3 dez. 2015. Disponível em:
<https://repositorio.bc.ufg.br/bitstream/ri/12385/5/Artigo%20-%20Evelyn%20de%20Oliveira%20-%202015.pd
f>. Acesso em: 24 abr. 2023.

PATEL, Rajan et al. Recent Advances in the Applications of Ionic Liquids in Protein Stability and Activity: A
Review. Applied Biochemistry and Biotechnology, [s. l.], p. 3701–3720, 2014. Disponível em:
<https://link.springer.com/article/10.1007/s12010-014-0813-6>. Acesso em: 19 abr. 2023.

PECKHAM GD, Bugos RC, Su WW. Purification of GFP fusion proteins from transgenic plant cell
cultures. Protein Expr Purif. 2006 Oct;49(2):183-9. doi: 10.1016/j.pep.2006.03.011. Epub 2006 Mar 30. PMID:
16682226. Disponível em: <https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/16682226/>. Acesso em: 24 abr. 2023.

PRIVATO, M. B.; MARTINEZ, L. L.; SCHMIDT, C. Biofármacos no Brasil: uma revisão do processo de
regulamentação. Arq Med Hosp Fac Cienc Med Santa Casa São Paulo. 2020. Disponível em:
<https://arquivosmedicos.fcmsantacasasp.edu.br/index.php/AMSCSP/article/view/602>. Acesso em: 25 abr.
2023.

SALA, Luisa. Purificação de Queratinase por sistema aquoso bifásico integrado a Ultrafiltração. 2013. 102
f. Dissertação (Mestrado) - Curso de Engenharia e Ciência de Alimentos, Universidade Federal do Rio Grande,
Rio Grande, Rs, 2013. Disponível em: https://sistemas.furg.br/sistemas/sab/arquivos/bdtd/0000010351.pdf.
Acesso em: 25 abr. 2023.

ROBERTS, T. M. et al. Identification and Characterisation of a pH-stable GFP. Sci Rep, v. 6, 2016. Disponível
em: <https://www.nature.com/articles/srep28166>. Acesso em: 30 abr. 2023.

SAMARKINA ON, Popova AG, Gvozdik EY, Chkalina AV, Zvyagin IV, Rylova YV, Rudenko NV, Lusta KA,
Kelmanson IV, Gorokhovatsky AY, Vinokurov LM. Universal and rapid method for purification of GFP-like
proteins by the ethanol extraction. Protein Expr Purif. 2009 May;65(1):108-13. doi:
10.1016/j.pep.2008.11.008. Epub 2008 Dec 3. PMID: 19084068. Disponível em:
<https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19084068/>. Acesso em: 24 abr. 2023.

SKOSYREV VS, Rudenko NV, Yakhnin AV, Zagranichny VE, Popova LI, Zakharov MV, Gorokhovatsky AY,
Vinokurov LM. EGFP as a fusion partner for the expression and organic extraction of small polypeptides.
Protein Expr Purif. 2003 Jan;27(1):55-62. doi: 10.1016/s1046-5928(02)00595-8. PMID: 12509985. Disponível
em: <https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/12509985/>. Acesso em: 24 abr. 2023.

VESSONI Penna TC, Ishii M. Selective permeation and organic extraction of recombinant green fluorescent
protein (gfpuv) from Escherichia coli. BMC Biotechnol. 2002 Apr 24;2:7. doi: 10.1186/1472-6750-2-7. PMID:
11972900; PMCID: PMC115201. Disponível em: <https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/11972900/>. Acesso em:
24 abr. 2023.

WESSEL, D.; FLÜGGE, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the
presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry, v. 138, n. 1, p. 141–143, 1 abr. 1984.

X. Zhou, Q. Shi, X. Xing, Y. Sun, Rapid purification of enhanced green fluorescent protein from
Escherichia coli, Chin. J. Chem. Eng. 14 (2) (2006) 229–234, https://doi.org/ 10.1016/S1004-9541(06)60063-3.
Disponível em:
<https://reader.elsevier.com/reader/sd/pii/S1004954106600633?token=FECFF141FCF495294C730B0A1F267B
B31C642D850411D0163BB079EE5F19F38B02A1813BD8A23E2F1E083DA2F641DDFB&originRegion=us-e
ast-1&originCreation=20230424200835>. Acesso em: 24 abr. 2023.

YAKHNIN, Alexander V. et al. Green Fluorescent Protein Purification by Organic Extraction. Protein
Expression And Purification, [S.L.], v. 14, n. 3, p. 382-386, dez. 1998. Elsevier BV. Disponível em:
<http://dx.doi.org/10.1006/prep.1998.0981>. Acesso em: 24 abr. 2023.

25
YANG, F.; MOSS, L. G.; PHILLIPS, G. N. The molecular structure of green fluorescent protein. Nature
Biotechnology, v. 14, n. 10, 1246–1251. Disponível em: <doi:10.1038/nbt1096-1246>. Acesso em: 30 abr.
2023.

YOSHIKAWA, Hiroki et al. Mechanistic insights into protein precipitation by alcohol. International Journal
Of Biological Macromolecules, [S.L.], v. 50, n. 3, p. 865-871, abr. 2012. Elsevier BV.
http://dx.doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2011.11.005.

26
Apêndice A - Fluxograma detalhado do processo de extração proposto

27
28