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Caxias do Sul
2010
I
Caxias do Sul
2010
II
_______________________________________________
Orientadora: Profa. Dra. Ana Paula Longaray Delamare
_______________________________________________
Co-orientadora: Profa. Dra. Mirian Salvador
_______________________________________________
Co-orientador: Prof. Dr. Sergio Echeverrigaray
Comisso examinadora:
________________________________
Profa. Dra. Lessandra Michelin
________________________________
Prof. Dr. Anderson Miyoshi
________________________________
Prof. Dr. Diego Bonatto
III
Dedico este trabalho ao meu pai, minha me, ao meu irmo e ao Alfredo.
Amo muito vocs!
IV
AGRADECIMENTOS
VI
NDICE
LISTA DE TABELAS ............................................................................................................. IX
LISTA DE QUADROS ............................................................................................................. X
LISTA DE FIGURAS .............................................................................................................. XI
RESUMO .............................................................................................................................. XIV
ABSTRACT ........................................................................................................................... XV
1.
INTRODUO ................................................................................................................. 1
2.
3.
4.
4.7 Morte celular microbiana, lise celular e perda de componentes celulares causadas por
terpenoides. .......................................................................................................................... 46
4.8 Atividade antioxidante de terpenoides ........................................................................... 52
5.
CONCLUSES ................................................................................................................ 55
6.
VIII
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Estudos mostrando a ao de diferentes compostos sobre microrganismos. ........... 11
Tabela 2. Dose Inibitria 50% (DI50) dos terpenoides (mdias desvio padro) (L/mL). .. 26
Tabela 3. Concentrao Inibitria Mnima (CIM) dos terpenoides (mdias desvio padro)
(L/mL)...................................................................................................................... 27
Tabela 4. Percentual de reduo do radical DPPH e valor de IC50** para os terpenoides. .... 53
Tabela 5. Percentual de sobrevivncia de Saccharomyces cerevisiae diante de citral e
citronelal..................................................................................................................... 54
IX
LISTA DE QUADROS
Quadro 1. Leveduras utilizadas para avaliao da atividade antimicrobiana. ......................... 14
Quadro 2. Bactrias Gram-positivas e Gram-negativas utilizadas para avaliao da atividade
antimicrobiana. ........................................................................................................... 15
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Ciclo biossinttico dos metablitos secundrios (adaptado de Simes et al. 2001). .. 4
Figura 2. Estrutura qumica de citronelal, citronelol, 1,8-cineol, -tperpineol, citral, geraniol e
-cariofileno. ................................................................................................................ 7
Figura 3. Esquema representativo do teste de diluies seriadas realizado para a determinao
da dose inibitria 50% (DI50) e da concentrao inibitria mnima (CIM). ............. 16
Figura 4. Concentrao inibitria mnima de citral (1), geraniol (2), citronelal (3), citronelol
(4), 1,8-cineol (5), -terpineol (6) e - cariofileno (7) de bactrias Gram-positivas.
Letras diferentes indicam diferena significativa pelo teste de Tukey (p 0,05). ..... 31
Figura 5. Concentrao inibitria mnima de citral (1), geraniol (2), citronelal (3), citronelol
(4), 1,8-cineol (5), -terpineol (6) e - cariofileno (7) de bactrias Gram-negativas.
Letras diferentes indicam diferena significativa pelo teste de Tukey (p 0,05). ..... 31
Figura 6. Concentrao inibitria mnima de citral (1), geraniol (2), citronelal (3), citronelol
(4), 1,8-cineol (5), -terpineol (6) e - cariofileno (7) diante de leveduras. Letras
diferentes indicam diferena significativa pelo teste de Tukey (p 0,05). ................ 35
Figura 7. Inibio do crescimento das bactrias Gram-positivas Lactococcus lactis,
Lactobacillus casei, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis e Listeria
monocytogenes por citral () e geraniol (). Controle sem adio de terpenide (o) 37
Figura 8. Inibio do crescimento de Escherichia coli, Acinetobacter sp., Klebsiella sp.,
Serratia sp., Shigella sp. e Proteus mirabilis por citral () e geraniol ().Controle
sem adio de terpenide (o) ..................................................................................... 38
Figura 9. Inibio do crescimento de Salmonella typhimurium, Salmonella sp., Enterobacter
aerogenes, Enterobacter cloacae e Pseudomonas fluorescens por citral () e geraniol
().Controle sem adio de terpenide (o) ................................................................ 39
Figura 10. Inibio do crescimento de Aeromonas hydrophila, Aeromonas ichtiosmia,
Aeromonas media e Aeromonas sobria por citral () e geraniol (). Controle sem
adio de terpenide (o) ............................................................................................. 40
XI
, citronelal
, citronelol
e geraniol
, nas concentraes
, citronelal
, citronelol
e geraniol
, nas concentraes
e citronelal
(sem adio de tepenoides), 0,1, 0,5 e 1 CIM. Ao controle foi adicionado triton X100 0,1%. Mdias seguidas por letras distintas na mesma coluna so
significativamente diferentes pelo teste de Tukey (p 0,05). .................................... 45
Figura 15. ndice relativo de respirao (%) de Staphylococcus aureus, na presena dos
terpenoides citral
e citronelal
(sem adio de tepenoides), 0,1, 0,5 e 1 CIM. Ao controle foi adicionado triton X100 0,1%. Mdias seguidas por letras distintas na mesma coluna so
significativamente diferentes pelo teste de Tukey (p 0,05). .................................... 46
Figura 16. Percentual de clulas viveis de Candida albicans (A) e Saccharomyces
cerevisisae (B), tratadas com o valor correspondente a concentrao inibitria
mnima de citral
, citronelal
, geraniol
e citronelol
. As mdias desvio
padro para triplicata so ilustradas. Mdias seguidas por letras distintas na mesma
coluna so significativamente diferentes pelo teste de Tukey (p 0,05). .................. 48
XII
Figura 17. Avaliao de lise celular de Candida albicans (A) e Saccharomyces cerevisisae
(B), induzida por citral
, citronelal
, geraniol
citronelol
, em funo
, citronelal
, geraniol
e citronelol
. As mdias desvio
padro para triplicata so ilustradas. Mdias seguidas por letas distinstas na mesma
coluna so significativamente diferentes pelo teste de Tukey (p 0,05). .................. 52
Figura 19. Percentual de sobrevivncia da levedura Saccharomyces cerevisiae tratada com
perxido de hidrognio 50 mM, citral 0,0025L/mL+ H2O2 50 mM e citronelal 0,015
L/mL + perxido de hidrognio 50 mM. Letras diferentes indicam diferena
significativa pelo teste de Tukey (p 0,05). ............................................................... 54
XIII
RESUMO
Terpenos so compostos que fazem parte da constituio de leos essenciais. Estes compostos
so formados pela condensao de unidades de isopreno e quando contm oxignio so
denominados terpenoides. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a atividade
antimicrobiana e antioxidante dos terpenoides citral, citronelal, citronelol, 1,8-cineol,
geraniol, -terpineol e do sesquiterpeno -cariofileno. Para tanto, as concentraes inibitrias
mnimas (CIM) e as doses inibitrias 50% (DI50) foram determinadas atravs do mtodo de
diluio seriada (0 a 10 L/mL v/v) em microplacas. A viabilidade celular, na concentrao
inibitria mnima, foi avaliada por plaqueamento e contagem. Foi avaliado tambm o efeito
dos terpenoides sobre a respirao de bactrias e leveduras. Alm disso, testes especficos
envolvendo citral, citronelal, citronelol e geraniol foram realizados com as leveduras
Saccharomyces cerevisiae e Candida albicans, sendo eles: avaliao da sobrevivncia, lise
celular e perda de componentes celulares. A atividade antioxidante in vitro dos terpenoides foi
determinada pelo mtodo DPPH(1,1-difenil 2-picrilhidrazil)A atividade antioxidante in
vivo de citral e citronelal foi realizada utilizando S. cerevisiae como organismo modelo. Os
resultados mostraram que os seis terpenoides e sesquiterpeno tm atividade antimicrobiana,
com variao entre as concentraes destes isolados e o tipo de microrganismo avaliado. De
um modo geral, o citral foi o terpenoide que exibiu ao antimicrobiana mais expressiva,
enquanto o -cariofileno afetou um nmero restrito de microganismos. A presena de citral e
citronelal, nas concentraes inibitrias mnimas correspondentes, reduziu a respirao de
Salmonella typhinmurium e Staphylococcus aureus. C. albicans e S. cerevisiae, quando
tratadas com CIM de citral, citronelal, citronelol e geraniol, tiveram a respirao inibida.
Geraniol foi o terpenoide com maior atividade microcida sobre C. albicans. Citral, citronelol,
citronelal e geraniol induziram a perda de componentes celulares tanto em C. albicans quanto
em S. cerevisiae. Todos os compostos mostraram atividade antioxidante in vitro,
particularmente o citral. Por outro lado, citronelal foi o nico terpenoide que apresentou
atividade antioxidante in vivo, sobre clulas eucariticas. De uma maneira geral, o presente
trabalho mostrou que o citral apresenta importante atividade antioxidante e antimicrobiana,
induzindo a perda de componentes celulares e inibindo a respirao. Estas informaes so
importantes para aplicaes farmacolgicas deste composto ou leos essenciais com elevada
concentrao de citral.
XIV
ABSTRACT
Terpenes are the main constituents of plant essential oils. These compounds are formed by the
condensation of isoprene units, and when contain oxygen are named terpenoids. The present
work aimed to evaluate the antimicrobial and antioxidant activity of terpenoids citral,
citronellal, citronellol, 1,8-cineole, geraniol, - terpineole and sesquiterpene -caryophyllene.
Thus for, the minimal inhibitory concentrations (MIC), and the inhibitory dosage 50% (ID50)
were determined using the microplate serial dilution method (0 to 10 L/mL v/v). Cell
viability at the MIC concentration was evaluated by plating and counting. The effect of
terpenoids on bacterial and yeast respiration was evaluated. Moreover, the following specific
tests were developed on Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans using citral,
citronellal, citronellol and geraniol: cell viability, cellular lysis, and loss of cellular
components. The in vitro antioxidant activity of the terpenoids was determined by the DPPH
(1,1-difenil 2-picrilhidrazil) assay. In vivo antioxidant activity of citral and citronellal was
evaluated using S. cerevisiae as model organism. The results showed that all the six
terpenoids and one sesquiterpene have antimicrobial activity, with variation among terpenoids
and microrganisms. In general, citral exhibited the highest antimicrobial activity, where cariophyllene affects a restricted number of organisms. The presence of citral and citronellal
at their MICs reduced respiration of Salmonella typhimurium and Staphylococcus aureus.
Respiration inhibitory activity of citral, citronellol, citronellal and geraniol was also
evidenced on C. albicans and S. cerevisiae. Geraniol was the terpenoid with the highest
microcide activity on C. albicans and S. cerevisiae, as determined by the methylene blue
staining method. Citronellal and citronellol exhibited low lytic activity on S. cerevisiae, but
not on C. albicans. Citral, citronellol, citronellal and geraniol induced the loss of cellular
components in both C. albicans and S. cerevisiae. All the compounds showed in vitro
antioxidant activity, particularly citral. Conversely, citronellal was the only terpenoid with in
vivo antioxidant activity on eukaryotic cells. In general, the present work showed that citral
has an important antioxidant and antimicrobial activity, inducing the loss of cellular
components and inhibiting cell respiration. These informations are important for the
pharmacological application of this compound or essential oils with high concentration of
citral.
XV
1. INTRODUO
terpineno), Cunila microcephala (mentofurano), Salvia officinallis (-thujona, 1,8cineol, cnfora, borneol e -pinene), Salvia triloba (-thujone, 1,8-cineol, cnfora e cariofileno), sendo que a resposta leo versus microrganismos dependente da
composio do leo e do tipo de microrganismos.
Assim sendo, o presente trabalho teve como objetivo compreender os
mecanismos de ao individuais de seis terpenoides e de um sesquiterpeno e
consequentemente predizer os leos essenciais com atividades biolgicas especficas
para posterior utilizao em produtos comerciais. Para tanto, foram utilizados os
terpenoides citral, citronelal, citronelol, 1,8-cineol, geraniol, -terpineol e o
sesquiterpeno -cariofileno, para os quais foram determinadas as concentraes
inibitrias mnimas (CIM), dose inibitria 50% (DI50) e a mortalidade de bactrias
Gram-positivas, Gram-negativas e leveduras, alm da viabilidade celular. Alm disso,
foram avaliados os efeitos de um conjunto de terpenoides sobre a respirao, morte
celular, lise e perda de componentes celulares em leveduras. Para aumentar a
aplicabilidade em produtos biotecnolgicos, os terpenoides foram avaliados quanto a
sua atividade antioxidante.
2. REVISO BIBLIOGRFICA
(Bakkali et al. 2008). Isso quer dizer que as plantas so capazes de sintetizar substncias
aromticas, sendo que a maior parte delas so estruturas fenlicas e terpenoides, das
quais pelo menos 12.000 foram isoladas. Este nmero, segundo estimativas, deve
representar somente 10% do total existente. Segundo Cowan (1999), os terpenoides so
os compostos responsveis pelo aroma das plantas.
Figura 1. Ciclo biossinttico dos metablitos secundrios (adaptado de Simes et al. 2001).
Glowniak, 2001; Delamare et al. 2007, Sandri et al. 2007). Entre as plantas desta
famlia com atividade antimicrobiana conhecida, esto Thymus vulgaris (tomilho),
vrias espcies de Salvia, Rosmarinus officinalis (alecrim), Origanum vulgare
(organo), Mentha piperita (menta) e Cunila sp. (poejo), entre outras.
Alguns estudos mostram que monoterpenos apresentam efeitos prejudiciais
membrana celular bacteriana (Tabela 1). Estudos de microscopia eletrnica de
Escherichia coli revelaram perda de material celular e coagulao de constituintes
citoplasmticos aps exposio ao leo de Melaleuca alternifolia (Gustafson et al.
1998). O leo de Melaleuca alternifolia tambm estimula a perda de ons de potssio e
a inibio da respirao em E. coli, sugerindo ao letal relacionada a dano de
membrana citoplsmica (Cox et al. 2000). A principal atividade antimicrobiana do leo
de Melaleuca alternifolia pode ser atribuda presena de 4-terpineol (Southwell et al.,
1999; Carson et al. 2002).
Os componentes de diferentes leos essenciais tambm tm sido estudados por
possurem atividades biolgicas. Por exemplo, os compostos carbonlicos controlam
eficientemente Staphylococcus, Listeria, Salmonella e Escherichia coli. Os compostos
presentes em extratos etanlicos de aspargos, cenoura e cebolinha, entre outros vegetais
isoladamente ou em combinao, tambm so eficientes no controle de microrganismos
(Bowles & Juneja, 1998). Por serem altamente hidrofbicos, os monoterpenos
interagem com a membrana celular dos microrganismos causando danos importantes na
membrana a acabam provocando a lise celular (Turina et al. 2006)
Vrios compostos tm sido testados para interromper o crescimento de Listeria
monocytogenes em meios de cultivo permitindo a identificao daqueles com atividade
antibacteriana, como eugenol (Blaszyk & Holley, 1998; Hao et al. 1998 a, b), carvacrol
(Kim & Nair, 1995) e 1,8-cineol (Lis-Balchim & Deans, 1997). Mondello et al. (2006)
mostraram que 1,8-cineol apresenta ao antifngica contra Candida albicans, que um
importante patgeno humano. Da Silva et al. (2008) mostraram que o citral apresenta
atividade antifngica diante de Candida sp., especialmente espcies de C. albicans.
10
Escherichia coli
coagulao de constituintes
citoplasmticos
4-terpineol
Escherichia coli
Compostos
Staphylococcus, Listeria,
carbonlicos
Eugenol
Listeria monocytogenes
Carvacrol
Listeria monocytogenes
1,8-cineol
Listeria Monocytogenes
1,8-cineol
Citral
Interrupo do crescimento
microbiano
Interrupo do crescimento
microbiano
Interrupo do crescimento
microbiano
1997
Candida albicans
Ao antif ngica
Candida sp.
13
3. MATERIAL E MTODOS
3.2.
Linhagens
microbianas
utilizadas
para
avaliao
da
atividade
antimicrobiana de terpenoides
Para
avaliao
da
atividade
antimicrobiana,
foram
utilizados
os
Cdigo de
identificao
Origem
L106
IZ 1239
IOC 2697
L06
IZ 300
L08
XV185-14C
14
Cdigo de
identificao
Origem
ATCC 10876
IBBac 103
IBBac 101
CCT 0360
CCT 0667
ATCC 19117
ATCC 25923
ATCC 12228
ATCC 1870
ATCC 7966
ATCC 43979
ATCC 49904
ATCC 33907
ATCC 8739
IBEnt101
ATCC 15048
IBKle101
L68
IBPseudo 103
IBPseudo 102
ATCC 4973
IBPseudo 101
ATCC 14028
ATCC 6539
IBSer101
IBShi101
mtodo descrito por Elsom & Hide (1999). Conforme pode ser observado na Figura 3,
foram colocados 180 l de caldo Mueller Hinton (Himedia) nos orifcios da primeira
linha da placa de cultura de clula e 100l nas seguintes. Em seguida, foram
adicionados 20l de terpenoide ou terpeno (Soluo Base- 100 L/mL em Triton-X-100
0,1% (v/v)) nos orifcios da primeira linha e realizada diluio seriada de base dois nas
linhas subsequentes atravs da transferncia de 100 L. Estas diluies corresponderam
a concentraes finais de 10; 5; 2,5; 1,25; 0,625; 0,3125; 0,1562 e 0 L/mL de
terpenoide ou terpeno. continuao, foram semeados 5l da bactria em fase
estacionria de crescimento (aproximadamente 106 UFC). Controles positivos (sem
terpenoide ou terpeno) e negativos (no inoculados) foram includos em cada placa. Aos
controles tambm foi adicionado triton X-100 na mesma concentrao encontrada na
soluo base. As microplacas foram incubadas a 37C com agitao por
aproximadamente 24 horas.
7 8
9 10 11 12
0
0,150
0,312
0,650
1,25
2,5
5
10 L/mL
incubadas a 30C por 48 horas, no caso de leveduras e bactrias lcticas, e a 37C por 24
horas, no caso de outras bactrias. Passado o perodo, foram feitas contagens de
unidades formadoras de colnia e os resultados foram expressos em reduo do log10 de
UFC.
18
Para a avaliao da morte celular pelo mtodo de azul de metileno, foi adotada a
metodologia de Hammer et al. (2004), com algumas adaptaes. Primeiramente, as
leveduras S. cerevisiae (XV185-14c) e C. albicans (L106) foram crescidas em meio
YEPD lquido, por 24 horas, a 28C, sob agitao. Aps este perodo, as clulas foram
recuperadas por centrifugao 12000 xg, por 10 minutos, a 20C, lavadas duas vezes e
ressuspensas em gua destilada esterilizada na concentrao de aproximadamente 107
leveduras/mL, determinada por contagem em cmara de Neubauer, no microscpio,
com aumento de 400x. Em seguida, os terpenoides foram adicionados suspenso de
leveduras na concentrao inibitria mnima (CIM) de cada terpenoide avaliado. Os
tubos foram incubados a 30C, em repouso, retirando-se amostras nos tempos 30, 60,
90, 120 e 180 minutos. Para avaliao da morte celular, as amostras (80L) de cada
tempo foram acrescidas de 20L de soluo de azul de metileno 0,05% (v/v), agitadas e
mantidas em repouso por 5 minutos. As clulas foram colocadas em cmara de
Neubauer e examinadas microscopicamente utilizando um aumento de 400x. O nmero
de clulas coradas (mortas) e no coradas (vivas) foi determinado. Um mnimo de 400
clulas foram avaliadas para cada tratamento. Os resultados foram expressos em
percentual de clulas vivas em relao ao controle positivo (clulas sem tratamento).
Para determinao da eficincia do mtodo, foi tambm includo, em cada experimento,
um controle com clulas mortas por fervura (5 minutos).
21
4. RESULTADOS E DISCUSSO
L/mL) e A. sobria (0,85 L/mL). Por outro lado, P. aeruginosa M mostrou DI50
muito superior s outras bactrias Gram-negativas (33,26 L/mL).
A DI50 mdia do 1,8-cineol sobre as bactrias Gram-positivas foi 9,86 4,13
L/mL, com variao entre 5,21 L/mL (L. lactis) e 15,86 L/mL (L. monocytogenes).
A DI50 mdia das bactrias Gram-negativas foi 9,47 7,78 L/mL com variao entre
1,13 L/mL (Acinetobater sp.) e 30,89 L/mL (P. aeruginosa M). Shigella sp. e P.
aeruginosa NM no apresentaram qualquer tipo de reduo de crescimento em meio
contendo 1,8-cineol.
As bactrias Gram-positivas, em presena de -terpineol, exibiram DI50 mdio
igual a 6,20 3,30 L/mL, com variao entre 4,21 L/mL (L. monocytogenes) e 13,42
L/mL (L. lactis). Duas espcies apresentaram elevada tolerncia ao -terpineol, sendo
elas L. lactis e B. megaterium. Para esta ltima, a DI50 foi superior concentrao
mxima utilizada nos experimentos. A DI50 mdia sobre as bactrias Gram-negativas
foi 3,25 3,23 L/mL. P. aeruginosa NM e Salmonella typhimurium apresentaram
valores de DI50 consideravelmente superiores s demais (11,21 L/mL e 11,25 L/mL,
respectivamente).
J o composto -cariofileno, um sesquiterpeno, mostrou uma DI50 mdia de
7,08 3,58 L/mL sobre bactrias Gram-positivas, variando entre 2,75 L/mL (B.
megaterium) e 11,44 L/mL (L. monocytogenes). A DI50 mdia sobre as bactrias
Gram-negativas foi 18,72 11,71 L/mL, variando entre 7,03 L/mL para Aeromonas
media e 43,24 L/mL para Salmonella sp.. A bactria Gram positiva Bacillus cereus, as
bactrias Gram-negativas Enterobacter cloacae, Pseudomonas fluorescens, P.
aeuruginosa NM, Klebsiella sp., S. typhimurium e Aeromonas hydrophila no
apresentaram reduo de crescimento nas concentraes avaliadas.
23
24
4.3. Concentrao inibitria mnima (CIM) de terpenoides sobre bactrias Grampositivas e Gram-negativas
De acordo com a Tabela 3, o citral apresenta CIM de 3,59 1,94 L/mL sobre
bactrias Gram-positivas. Trs representantes deste grupo mostraram comportamentos
diferentes das demais, exibindo CIM significativamente superior (L. monocytogenes,
6,76 L/mL) ou inferior (B. cereus e B. megaterium, 1,28 e 0,68 L/mL,
respectivamante) mdia. Para bactrias Gram-negativas, o valor de CIM mdio foi de
5,22 4,12 L/mL. Neste caso a bactria mais tolerante ao citral foi P. aeuruginosa M
com uma CIM de 13,77 L/mL, seguida por Pseudomonas sp. (13,32 L/mL) e P.
aeruginosa NM (10,59 L/mL). J a Gram negativa mais sensvel ao citral foi A.
ichthiosmia, cuja CIM foi 0,86 L/mL.
Os valores individuais de CIM obtidos no presente trabalho so contrastantes
com os apresentados por Onawunmi (1989) e Hayes et al. (2002). No caso de S. aureus,
a CIM obtida (4,92 0,22 L/mL) foi superior determinada por Onawunmi (1989) e
Hayes et al. (2002), 0,3 a 2 L/mL e 0,5 L/mL, respectivamente. Por outro lado, a
CIM do citral sobre P. aeruginosa variou entre 10,59 L/mL e 13,77 L/mL, enquanto
Hayes et al. (2002) obtiveram um valor de 20 L/mL. As diferenas entre os distintos
estudos podem ser atribudas variao de resposta dependendo da linhagem
microbiana utilizada. Esta hiptese apoiada pela grande diferena de resposta das trs
linhagens de P. aeruginosa avaliadas no presente trabalho, assim como as diferenas
encontradas por Hayes et al. (2002) em S. aureus (0,3 a 2 L/mL).
25
Tabela 2. Dose Inibitria 50% (DI50) dos terpenoides (mdias desvio padro) (L/mL).
Microrganismos
Citral
Geraniol
Citronelal
Citronelol
1,8-Cineol
-terpineol
Bacillus cereus
0,81 0,02 MN
6,43 0,29 CD
6,62 0,30 EF
7,25 0,26 CD
3,64 0,20 GH
5,65 0,05 DE
6,33 0,13 DE
4,89 0,04
2,24 0,22
2,41 0,13
EFG
2,00 0,15
GHIJ
2,23 0,20
FGH
Listeria monocytogenes
2,28 0,22
EFGH
Enterobacter cloacae
2,69 0,14 IJ
2,50 0,22 JK
NC
Enterobacter aerogenes
1,58 0,19 JK
9,26 0,00 C
4,84 0,86 FG
17,79 1,62 B
19,15 0,54 BC
Shigella sp.
3,48 0,46 HI
3,62 0,29 JK
2,82 0,05 IJ
Pseudomonas sp.
11,19 0,62 A
10,39 0,18 A
10,81 0,58 B
10,48 0,16 B
NC
5,89 0,09 CD
Pseudomonas fluorescens
2,85 0,122 E
8,61 0,31 C
17,89 5,88 B
NC
4,47 0,33 CD
7,52 0,01 D
33,26 0,34 A
NC
11,21 0,69 B
NC
8,34 0,34 B
6,83 0,11 BC
6,36 0,08 FG
8,10 0,29 C
30,89 0,30 A
5,24 0,07 DE
23,96 5,60 B
Acinetobacter
1,26 0,20 Q
0,81 0,13 KL
1,13 0,01 K
0,46 0,14 OP
Serratia sp.
4,72 0,13 CD
7,25 0,22 CD
13,09 0,17 CD
Klebsiella sp.
2,77 0,05 EF
7,50 0,27 D
5,49 0,11 EF
NC
3,19 0,07
HIJK
8,69 0,20
3,01 0,07
HIJK
6,89 0,18
DEF
2,88 0,06
HIJK
7,51 0,13
2,78 0,12
IJK
Lactococcus lactis
3,78 0,24
GH
5,37 0,12
EF
7,36 0,00
DE
6,23 0,24
FGH
5,36 0,06
HI
5,08 0,97
6,24 0,05
5,59 0,37
EF
7,38 0,03
CD
1,39 0,22
1,84 0,18
JK
7,78 0,04
10,30 1,29
14,56 2,09
BC
12,38 0,56
CDE
5,29 0,02
GHIJ
5,21 0,65
GHIJ
BC
15,86 1,50
4,69 0,00 DE
4,28 0,00 DE
13,42 0,95
4,21 0,13
FG
Salmonella typhimurium
1,31 0,11
KLM
Aeromonas hydrophila
NC
Aeromonas sobria
0,74 0,00 MN
1,59 0,13 M
1,66 0,14 OP
0,85 0,00 KL
0,51 0,14
NO
0,93 0,00
LMN
0,53 0,06
NO
0,04 0,02
0,96 0,09
LMN
Candida sake
1,68 0,04
HIJK
Candida guilliermondii
Aeromonas ichthiosmia
Aeromonas media
Candida albicans
Candida pseudotropicalis
Candida utilis
Pichia guilliermondii
Sacharomyces cerevisiae
1,50 0,33
JKL
0,43 0,06
NO
2,72 0,02
IJK
1,62 0,15
LM
2,76 0,06
IJK
0,00 0,00
1,67 0,21
LM
4,50 0,22
FG
2,48 0,30
JKLM
7,60 0,10
3,86 0,33
3,59 0,04
JKL
2,64 0,34
MN
0,08 0,00
2,20 0,14
NO
2,82 0,23
KLMN
5,46 0,18
9,72 0,41
6,30 0,28
DE
3,42 0,16
HI
3,49 0,08
HI
0,09 0,00
1,43 0,13
2,68 0,08
IJ
2,59 0,14 MN
1,71 0,25 JK
5,21 0,09
EF
1,34 0,25
27,34 0,00
0,65 0,00
QR
6,11 0,00
5,49 0,27
1,62 0,00
Salmonella sp.
EF
GHI
CDE
IJK
6,38 0,12
6,45 0,35
6,19 0,52
4,12 0,05
FGH
DE
6,15 0,06
5,50 0,24
CDE
5,04 0,08
10,55 1,67
GHI
2,75 0,19 DE
NC
Proteus mirabilis
Leveduras
4,47 0,15
FG
4,89 0,04
DEF
5,48 0,37 DE
FGH
Lactococcus casei
6,77 0,20
BC
1,72 0,06
DE
NC
0,41 0,03
Staphylococcus epidermidis
5,78 0,07
DE
OP
EF
NO
Staphylococcus aureus
4,63 0,17
FG
-cariofileno
15,76 1,37
BC
1,41 0,32
JK
4,38 0,20
HIJK
7,56 0,17
FGH
1,08 0,00
6,43 0,03
FGH
8,74 0,14
EFG
IJK
5,88 0,10
GHI
1,33 0,21
LMN
40,17 15,79 A
3,44 0,16
GHI
2,77 0,16
HIJ
43,24 13,92 A
11,25 0,05
NC
0,99 0,12
MNO
0,80 0,13
NOP
GHI
0,56 0,19 E
0,02 0,02
0,44 0,04 E
2,53 0,23
JK
19,26 0,10 BC
2,99 0,15
HIJ
NC
3,5 0,10
IJ
Mdias seguidas por letras distintas na mesma coluna so significativamente diferentes pelo teste de Tukey (p 0,05)
NC- no calculado devido ausncia de decaimento dentro das concentraes experimentais utilizadas.
*
26
Tabela 3. Concentrao Inibitria Mnima (CIM) dos terpenoides (mdias desvio padro) (L/mL).
Microrganismos
Citral
Geraniol
Citronelal
Citronelol
1,8-Cineol
-terpineol
-cariofileno
Bacillus cereus
9,71 0,25 BC
NC
9,19 0,32 C
NC
4,29 0,22
8,49 0,30
CD
9,66 0,16
BC
9,46 0,33
2,22 0,03
NO
9,18 0,01
DEFGI
8,45 0,00
EFGHI
8,38 0,22
DEFG
9,31 0,10
DEF
8,49 0,06
DEFG
3,28 0,26
HI
4,15 0,01
GHI
13,20 1,17
EFGH
29,06 0,63
CD
14,86 0,75
14,48 1,04
EF
13,88 0,71
EFG
25,29 1,27
DE
4,92 0,22
4,36 0,29
FG
3,38 0,25
GHIJK
3,79 0,26
FGHI
Listeria monocytogenes
6,76 0,02
Enterobacter cloacae
NC
Enterobacter aerogenes
14,47 0,25 B
26,91 3,16 CD
28,92 0,58 BC
DEF
GIJ
DEFGH
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
Lactococcus casei
Lactococcus lactis
Shigella sp.
Pseudomonas sp.
4,03 0,06
9,72 0,17
BC
12,22 0,35
13,32 1,39
10,66 0,41
6,16 0,21
A
FGH
12,27 0,23
3,84 1,24
BC
AB
AB
FGH
11,16 0,91
CD
13,31 0,14
BC
9,63 2,23
7,22 0,17
DEFG
13,00 0,61
BC
10,60 0,11
DE
11,71 0,07
7,86 0,07
12,36 0,21
CD
DEFG
8,80 0,46
7,80 0,30
10,70 0,04
DE
44,50 0,41
12,54 0,00
CDE
23,21 0,10
BCDE
6,72 0,14
HIJ
EF
9,73 0,10
FG
IKJLMN
3,07 0,04
NC
10,21 0,11
B
10,59 1,06 B
13,43 3,39 A
14,17 1,29 B
49,27 8,62 A
NC
18,61 0,74 C
NC
13,77 0,12 A
14,48 2,41 A
11,44 0,08 CD
12,46 0,68 CD
53,55 3,30 A
10,24 0,19 D
39,58 10,10 B
16,93 2,90 BCDEF
2,26 0,01
KLMN
4,34 0,07
GHIJK
NC
8,31 0,18
CD
Klebsiella sp.
4,34 0,04
FG
Proteus mirabilis
8,68 0,13 C
7,29 0,27
4,46 0,12
FGH
3,30 0,18
GHIJKL
4,65 0,07
FGH
Salmonella typhimurium
3,14 0,31
HIJKL
4,95 0,21
FGH
Aeromonas hydrophila
NC
Aeromonas sobria
2,50 0,13 HI
1,20 0,04 I
25,63 1,57
BCD
Aeromonas ichthiosmia
0,86 0,20 PQ
4,43 0,20
10,11 0,02 D
1,93 0,02 L
26,79 3,83
BCD
Aeromonas media
2,74 0,10 HI
5,90 0,04 JL
Candida albicans
0,80 0,04 PQ
4,78 0,23 JL
4,86 0,86 DE
Salmonella sp.
0,42 0,09
1,59 0,30
MNOPQ
Candida sake
2,47 0,28
JKLMN
Candida guilliermondii
Candida pseudotropicalis
Candida utilis
Pichia guilliermondii
Sacharomyces cerevisiae
2,30 0,35
KLMNO
0,66 0,02
PQ
4,71 0,06
FGH
0,94 0,19
1,74 0,03
4,78 0,03
FGH
FGH
0,60 0,05
2,59 0,41
HI
8,14 0,55
CDE
CD
3,36 1,11
GH
2,38 0,13
10,11 0,58
DEF
15,28 1,36
14,15 0,20 B
10,04 0,64
DEF
13,29 0,09
BC
22,71 2,15
0,30 0,00
3,43 0,31
LMN
4,67 0,45
K LM
KLM
0,93 0,01
1,47 0,40
11,29 0,08
9,73 0,10
2,58 0,56
CD
DE
15,45 1,48 BC
8,87 0,10
DEFG
9,24 0,17
DEF
18,52 0,53
0,33 0,01
3,13 0,12
HI
4,56 0,59
FGHI
DEFGH
2,44 0,34
NC
MNOP
Serratia sp.
5,72 0,36
2,24 0,16
KLMN
4,28 0,27
MNO
34,51 3,21
DE
Pseudomonas aeruginosa NM
EFG
8,51 0,29
CD
DE
Pseudomonas fluorescens
Bacterias Gram
Pseudomonas aureuginosa M
Negativas
Acinetobacter
Leveduras
0,68 0,04
PQ
CD
28,49 1,18
7,56 0,19
IJK
GHI
9,43 0,22
GHI
BC
31,31 5,87
4,10 0,08
JKL
10,34 0,011
10,37 0,35
EFGHI
EFGHI
KL
EFGHI
70,24 27,27 A
5,20 0,32
GHI
4,43 0,15
GHIJK
70,84 23,50 A
22,47 4,03
NC
1,17 0,09
MN
2,36 0,30 F
4,33 0,18
GHIJK
29,52 1,54 BC
4,82 0,10
GHIJ
NC
9,47 0,17
DE
4,61 0,39 DE
4,46 0,02
GHIJK
Mdias seguidas por letras distintas na mesma coluna so significativamente diferentes pelo teste de Tukey (p 0,05)
NC- no calculado devido ausncia de decaimento dentro das concentraes experimentais utilizadas.
*
27
28
29
30
Outtara et al. (1997) e Mangena & Muyima (1999) avaliando o efeito de leos
essenciais sobre bactrias concluram que bactrias Gram-positivas so mais sensveis
do que as Gran-negativas. Esta aparente discrepncia est associada ao pequeno nmero
de bactrias avaliadas por parte destes autores e a utilizao de misturas de terpenos
(leos essenciais) que levam reduo das variaes entre indivduos.
a
ab
ab
ab
a
ab
Figura 4. Concentrao inibitria mnima de citral (1), geraniol (2), citronelal (3), citronelol
(4), 1,8-cineol (5), -terpineol (6) e - cariofileno (7) de bactrias Gram-positivas. Letras
diferentes indicam diferena significativa pelo teste de Tukey (p 0,05).
b
bc
c
bc
c
Figura 5. Concentrao inibitria mnima de citral (1), geraniol (2), citronelal (3), citronelol
(4), 1,8-cineol (5), -terpineol (6) e - cariofileno (7) de bactrias Gram-negativas. Letras
diferentes indicam diferena significativa pelo teste de Tukey (p 0,05).
diferentes entre si, gerando assim valores de CIM variados. De acordo com Sikkema et
al. (1993, 1995), a membrana celular pode ser significativamente diferente entre um
organismo e outro, afetando a permeabilidade e, consequentemente, a resposta dos
mesmos a compostos inibitrios. Por outro lado, no se pode descartar que diversos
mecanismos, como bombas de efluxo, modificao de stios alvo e modificao
enzimtica da molcula inibitria, bem conhecidos no caso de antibiticos, podem atuar
de forma a tornar o microrganismo resistente a terpenos ou grupos de terpenoides. Cabe
ressaltar que alguns dos microrganismos avaliados no presente trabalho como, por
exemplo, representantes do gnero Pseudomonas so capazes de transformar ou utilizar
terpenoides, no caso citral e citronelal, como fonte de carbono, nitrognio, entre outros
(Tozoni et al, 2010).
Comparando-se o efeito dos terpenoides utilizados sobre o crescimento
microbiano, foi possvel constatar, de um modo geral, que o citral apresenta maior
espectro de ao, sendo capaz de inibir o crescimento de 69,2% (18/26) das bactrias
avaliadas quando em concentraes inferiores a 5 L/mL (Tabela 3). J o geraniol e o
-terpineol, em concentrao inferior a 5 L/mL, foram capazes de inibir o crescimento
de apenas 50% das bactrias avaliadas, enquanto o citronelal e o citronelol, em
concentrao <5 L/mL, inibiram apenas o crescimento de 15,4% e 26,9% das
bactrias, respectivamente. Os terpenoides com menor espectro de ao antibacteriana
foram o 1,8-cineol e o -cariofileno.
Analisando-se a susceptibilidade bacteriana aos terpenoides de estrutura
molecular semelhante (Figura 2), constatou-se que no h diferenas consistentes na
comparao entre as respostas ao citronelal e citronelol (Tabela 3). Para o citral, com
exceo de Pseudomonas e um grupo de enterobactrias, os valores de CIM foram
muito inferiores queles apresentados pelo geraniol. Este resultado indica que o tipo de
radical, por si s, no afeta de forma importante a atividade antibacteriana dos terpenos
oxigenados. Por outro lado, a elevada atividade antimicrobiana do citral em comparao
com o citronelal mostra que a presena de duplas ligaes entre carbonos prximos ao
32
33
34
a
ab
b
Figura 6. Concentrao inibitria mnima de citral (1), geraniol (2), citronelal (3), citronelol
(4), 1,8-cineol (5), -terpineol (6) e - cariofileno (7) diante de leveduras. Letras diferentes
indicam diferena significativa pelo teste de Tukey (p 0,05).
36
Lactobacillus casei
9
8
7
6
5
4
3
2
Staphylococcus aureus
10
Reduo de viabilidade
(log10)
Contagem microbiana
(log10)
Reduo de viabilidade
(log10)
Lactococcus lactis
10
9
8
7
6
5
4
3
30
60
90
120
150
180
30
60
Tempo (minutos)
90
120
150
8
7
6
5
4
3
0
180
30
Reduo de viabilidade
(log10)
9
8
7
6
5
4
3
2
30
60
90
120
150
90
120
150
180
Listeria monocytogenes
10
60
Tempo (minutos)
Tempo (minutos)
Staphylococcus epidermidis
Reduo de viabilidade
(log10)
2
0
10
180
Tempo (minutos)
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0
30
60
90
120
150
180
Tempo (minutos)
casei,
Staphylococcus
aureus,
Staphylococcus
epidermidis
Listeria
monocytogenes por citral () e geraniol (). Controle sem adio de terpenide (o)
37
Serratia sp. tratada com geraniol teve sua viabilidade reduzida em 7 log10,
enquanto com citral a reduo foi de 6 log10. J com Shigella sp., o geraniol mostrou
maior eficincia, j que reduziu em torno de 8 log10 em 30 minutos, enquanto que citral
reduziu 7 log10 no mesmo perodo de tempo.
Os resultados obtidos para Salmonella sp. indicam que citral menos efetivo que
geraniol, dado que o primeiro composto reduziu cerca de 6 log10 e o segundo
aproximadamente 7 log10.
Em presena de citral, a viabilidade celular de E. cloacae apresentou uma
reduo de 8 log10 em 30 minutos, j geraniol apresentou a mesma reduo em 60
minutos. Sendo assim, os resultados indicam que para este microrganismo o citral
mais eficiente.
Klebsiella sp.
9
8
7
6
5
4
3
2
9
8
7
6
5
4
3
2
30
60
90
120
150
180
30
Serratia sp.
60
90
120
150
7
6
5
4
3
2
120
Tempo (minutos)
6
5
4
3
0
30
150
180
60
90
120
150
180
150
180
Tempo (minutos)
Proteus mirabilis
10
9
8
7
6
5
4
3
2
90
180
Reduo de viabilidade
(log10)
Reduo de viabilidade
(log10)
60
Shigella sp.
30
Tempo (minutos)
10
10
2
0
Tempo (minutos)
Reduo de viabilidade
(log10)
Acinetobacter sp.
10
Reduo de viabilidade
(log10)
Reduo de viabilidade
(log10)
Reduo de viabilidade
(log10)
10
9
8
7
6
5
4
3
2
30
60
90
120
Tempo (minutos)
150
180
30
60
90
120
Tempo (minutos)
38
Salmonella sp.
9
8
7
6
5
4
3
9
8
7
6
5
4
3
2
30
60
90
120
150
180
9
8
7
6
5
4
3
2
30
Tempo (minutos)
60
90
120
150
180
Enterobacter cloacae
Pseudomonas fluorescens
Reduo de viabilidade
(log 10)
Reduo de
crescimento (log 10)
90
120
150
180
60
90
120
150
180
Pseudomonas fluorescens
9
8
7
6
5
4
3
2
60
30
Tempo (minutos)
10
30
Tempo (minutos)
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0
10
2
0
Reduo de viabilidade
(log10)
Enterobacter aerogenes
10
Reduo de viabilidade
(log10)
Reduo de viabilidade
(log10)
Reduo de viabilidade
(log10)
Salmonella typhimurium
10
10
9
8
7
6
5
4
3
2
30
Tempo (minutos)
60
90
120
Tempo (minutos)
150
180
30
60
90
120
150
180
Tempo (minutos)
39
Aeromonas ichthiosmia
9
8
7
6
5
4
3
Aeromonas media
10
Reduo de viabilidade
(log10)
Reduo de viabilidade
(log10)
Reduo de viabilidade
(log10)
Aeromonas hydrophila
10
9
8
7
6
5
4
3
2
2
0
30
60
90
120
150
180
10
9
8
7
6
5
4
3
2
30
60
90
120
150
180
Tempo (minutos)
Tempo (minutos)
30
60
90
120
150
180
Tempo (minutos)
Reduo de viabilidade
(log10)
Aeromonas sobria
10
9
8
7
6
5
4
3
2
0
30
60
90
120
150
180
Tempo (minutos)
sake, 4 log10
de C.
40
Candida albicans
Reduo de viabilidade
(log10)
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
9
8
7
6
5
4
3
2
30
60
90
120
150
30
60
90
120
150
8
7
6
5
4
3
120
6
5
4
3
0
30
150
180
60
90
120
150
180
Tempo (minutos)
Pichia guilliermondii
10
9
8
7
6
5
4
3
2
2
90
180
Reduo de viabilidade
(log10)
Reduo de viabilidade
(log10)
60
Pichia guilliermondii
Candida pseudotropicalis
30
Tempo (minutos)
10
10
180
Tempo (minutos)
Reduo de viabilidade
(log10)
Candida sake
10
Reduo de viabilidade
(log10)
Reduo de viabilidade
(log10)
Sacharomyces cereviasae
10
9
8
7
6
5
4
3
2
Tempo (minutos)
30
60
90
120
Tempo (minutos)
150
180
30
60
90
120
150
180
Tempo (minutos)
42
a
a
a a a
b
b
bc
b
b
c
c c
Figura 12. ndice relativo de respirao (%) de Candida albicans, na presena dos terpenoides
citral
, citronelal
, citronelol
e geraniol
controle (sem adio de tepenoides), 0,1, 0,5 e 1 CIM. Ao controle foi adicionado triton X-100
0,1%. Mdias seguidas por letras distintas na mesma coluna so significativamente diferentes
pelo teste de Tukey (p 0,05).
43
pH e da bomba de prtons e com isto a gerao de ATP (Richter & Schlegel, 1993,
Novgorodov & Gudz, 1996, Vercesi et al. 1997, Bakkali et al. 2008).
a a
a a
a
a
b
b
b c
b
c
Figura 13. ndice relativo de respirao (%) de Saccharomyces cerevisiae, na presena dos
terpenoides citral
, citronelal
, citronelol
e geraniol
a controle (sem adio de tepenoides), 0,1, 0,5 e 1 CIM. Ao controle foi adicionado triton X-100
0,1%.Mdias seguidas por letras distintas na mesma coluna so significativamente diferentes
pelo teste de Tukey (p 0,05).
44
b
b
b
b
Figura 14. ndice relativo de respirao (%) de Salmonella typhimurium na presena dos
terpenoides citral
e citronelal
de tepenoides), 0,1, 0,5 e 1 CIM. Ao controle foi adicionado triton X-100 0,1%. Mdias
seguidas por letras distintas na mesma coluna so significativamente diferentes pelo teste de
Tukey (p 0,05).
45
a
b
b
bc
c
Figura 15. ndice relativo de respirao (%) de Staphylococcus aureus, na presena dos
terpenoides citral
e citronelal
de tepenoides), 0,1, 0,5 e 1 CIM. Ao controle foi adicionado triton X-100 0,1%. Mdias
seguidas por letras distintas na mesma coluna so significativamente diferentes pelo teste de
Tukey (p 0,05).
47
100
a a
b
b
bc
50
c
c
c c
c c
60
90
120
0
0
30
e c c
180
Tempo (minutos)
100
a a
a
b
bc ab
abc ab
ab
b
bcd
cd
d b
50
c
c
cd
d
d
90
120
180
0
0
30
60
Tempo (minutos)
Figura 16. Percentual de clulas viveis de Candida albicans (A) e Saccharomyces cerevisisae
(B), tratadas com o valor correspondente a concentrao inibitria mnima de citral
citronelal
, geraniol
e citronelol
48
resultados (Figura 17) indicam que a maioria dos compostos no provoca a lise celular
destes microrganismos.
Com base na Figura 17 fica evidente que citronelol no induz a lise celular de C.
albicans. Lise celular pode ser observada com citral, citronelal e geraniol.
Pode ser observado que para citral e geraniol a lise de clulas de S. cerevisiae
aconteceu de forma no siginificativa (Figura 17). J citronelal e citronelol provocaram
a lise celular deste microrganismo. Isso quer dizer que estes compostos no s matam as
clulas desta levedura, mas tambm provocam a lise celular de aproximadamente 20%
delas.
Estes resultados indicam que a reduo da viabilidade (Figura 16) no
necessariamente acompanhada pela lise celular de C. albicans e S. cerevisiae. A morte
celular pode ser atribuda a outro mecanismo de ao e no ruptura celular.
Como j foi mencionado, a membrana celular pode ser significativamente
diferente entre um organismo e outro, afetando a permeabilidade e, consquentemente, a
sua resposta a compostos inibitrios (Sikkema et al. 1995). Isso parece explicar as
diferenas encontradas entre C. albicans e S. cerevisiae.
Os resultados obtidos podem ser justificados por constataes feitas em estudos
previamente realizados. Ensaio conduzido por Hammer et al. (2004) mostrou que
terpenoides aumentam a permeabilidade celular e fluidez da membrana de leveduras e
inibem a acidificao do meio. Segundo Sikkema et al. (1995), os terpenos so os
responsveis por induzir alteraes na permeabilidade celular pela sua insero entre os
cidos graxos da bicamada lipdica, desestruturando assim o empacotamento lipdico e
causando desta forma modificaes nas funes e propriedades da membrana. Tais
modificaes da membrana celular alteram as interaes com solutos (Marquese & Dill,
1986). Alm disso, alguns agentes antimicrobianos causam danos importantes na
membrana e provocam a lise celular (Carson et al. 2002).
49
100
ab
ab
ab
ab
ab
b
b
b
b
75
50
25
0
tempo (horas)
100
a
b
a
b
75
50
25
0
0
Tempo (horas)
Figura 17. Avaliao de lise celular de Candida albicans (A) e Saccharomyces cerevisisae (B),
induzida por citral
, citronelal
, geraniol
citronelol
, em funo do tempo.
51
0.07
a
ab
0.06
a
0.05
a
a
0.04
a
0.03
0.02
d
b
0.01
c c
b e
0.00
0
Tempo (horas)
0.60
Absorbncia (DO260nm)
a
0.45
b
0.30
0.15
0.00
c b d b
0
ab c b
ab d b
1
b a
ab
4
Tempo (horas)
, citronelal
, geraniol
e citronelol
terpenoide que exibiu maior atividade antioxidante foi o citral (IC50 25,32 0,56
L/mL). O segundo terpenoide com maior atividade foi o citronelal (IC50 69,92 0,08
L/mL). Por outro lado, o composto com menor atividade antioxidante foi -terpineol
(IC50 de 98,27 0,74 L/mL).
J foi demosntrado (Rabbani et al. 2006) que o citral capaz de varrer radicais
livres, o que pode explicar os resultados obtidos neste ensaio. No presente trabalho,
geraniol mostrou baixa capacidade antioxidante in vitro (IC50 91,27 0,43 L/mL)
quando comparado com os demais terpenoides analisados. Este resultado est de acordo
com o encontrado por Perry et al. (2001), que apesar de ter utilizado mtodo de inibio
da peroxidao em crebro de bovino, tambm mostrou que o geraniol apresenta baixo
efeito antioxidante.
O terpenoide 1,8-cineol (IC50 de 86,07 6,27 L/mL) apresentou baixa
atividade antioxidante, quando comparado com os demais terpenoides por Mustafa &
Bektas (2008) e Burits et al. (2001), que analisaram este terpenoide pelo mesmo
mtodo de varredura do radical livre DPPHe Perry et al. (2001) que ensaiou o 1,8cienol utilizando o mtodo de inibio da peroxidao de lipdios em crebro de bovino.
Conc.
L/mL
1,8 cineol
Citronelal
-terpineol
Citronelol
Citral
Geraniol
10
0,00 0,00
5,98 0,18
0,00 0,00
0,00 0,00
26,16 0,53
2,23 0,09
25
5,93 1,20
11,26 0,45
0,00 0,00
5,35 2,40
49,30 2,15
8,34 0,86
50
10,23 0,42
28,49 0,36
1,49 0,19
6,71 0,09
89,32 0,81
8,75 0,28
75
11,74 1,88
47,09 0,27
3,11 1,73
26,45 0,77
91,78 0,35
9,43 0,10
IC50**
86,07 6,27a
69,92 0,08b
98,27 0,74c
85,12 1,13a
25,32 0,56d
91,27 0,43a
Valores seguidos por letras distintas so significativamente diferentes pelo teste de Tukey (p0,05).
**
IC50: concentrao de terpenoide (L/mL) necessria para reduzir 50% do radical livre DPPH
53
Tabela 5.
citronelal.
Sobrevivncia (%)
Terpenoides
**
0,0025L/mL
0,005 L/mL
0,01 L/mL
0,015 L/mL
0,05 L/mL
Citral
100
86,3
NC**
NC
NC
Citronelal
100
100
100
100
70
NC no calculado.
54
5. CONCLUSES
56
6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
Amaral, J.A.; Ekins, A.; Richards, S.R.; Knowles, R. (1998). Effect of selected
monoterpenes on methane oxidation, denitrification, and aerobic metabolism
by bacteria in pure culture. Applied and Environmental Microbiology.64:
520-525.
Amoroso, M.C.M. (2002). Uso e diversidade de plantas medicinais em Santo Antnio
de Leverger, MT, Brasil. Acta Botanica Brasilica. 16:189-203.
Aureli, P.; Costantini, A.; Zolca, S. (1992). Antimicrobial activity of some plant
essential oils against Listeria monocytogenes. Journal of Food Protection. 55:
344-348.
Bajpai, V.K.; Al-Reza, S.M.; Choi, U.K.; Lee, J.H.; Kang, S.C. (2009). Chemical
composition, antibacterial and antioxidant activities of leaf essential oil and
extracts of Metasequioa glyptostroboides Miki ex Xu. Food and Chemical
Toxicology. doi: 10.1016/j.fct.2009.04.043
Bakkali, F., Averbeck, S., Averbeck, D., Idaomar, M. (2008). Biological effects of
essential oils a review. Food and Chemical Toxicology. 46: 446-475.
Baratta, M.T.; Dorman, H.J.D.; Deans, S.G.; Biondi, D.M.; Ruberto, G. (1998a).
Chemical composition, antimicrobial and antioxidative activity of laurel, sage,
rosemary, oregano and coriander essential oils. Journal of Essential Oils
Research. 10: 618-627.
Baratta, M.T.; Dorman, H.J.D.; Deans, S.G.; Figueiredo, C.; Barroso, J.G.; Ruberto, G.
(1998b). Antimicrobial and antioxidant properties of some commercial
essential oils. Flavor and Fragrance Journal. 13: 235-244.
Belletti, N.; Kamdem, S.S.; Patrignani, F.; Lanciotti, R.; Covelli, A.; Gardini, F. (2007).
Antimicrobial Activity of Aroma Compounds against Saccharomyces
cerevisiae and Improvement of Microbiological Stability of Soft Drinks as
57
58
and
Saccharomyces
cerevisiae.
Journal
of
Antimicrobial
60
Pichersky, E. (2004).
Mesa-Arango, A.C.; Montiel-Ramos, J.; Zapata, B.; Durn, C.; Betancur-Galvis, L.;
Stashenko, E. (2009). Citral and carvone chemotypes from the essential oils PF
Colombian Lippia Alba (Mill.) N.E. Brown: composition, cytotoxicity and
antifungal activity. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz. 104 (6): 878-884.
Mondello, F.; De Bernardis, F.; Girolamo, A.; Cassone, A.; Salvatores, G. (2006). In
vivo activity of terpinen-4-ol, the main bioactive component of Melaleuca
alternifolia Cheel (tea tree) oil against azole-susceptible and resistent human
pathogenic Candida species. BMC Infectious Diseases. 6:158
Moreira, M. R.; Cruz, G. M. P.; Lopes, M. S.; Albuquerque, A. A. C.; Leal-Cardoso, J.
H. (2001). Effects of terpineol on the compound action potential of the rat
sciatic nerve. Brazillian Journal of Medicinal and Biological Research. 34:
1337-1340.
Morita, M.; Shibuya, M.; Kushiro, T.; Masuda, K.; Yutuka, E. (2000). Molecular
cloning and functional expression of triterpene synthases from pea (Pisum
sativum). European Journal of Biochemistry. 267: 3453v-3460.
Mustafa, K.; Bektas, T. (2008). Chemical composition, antioxidant and antimicrobial
properties of the essential oils of three Salvia species from Turkish flora.
Bioresource Technology. 99: 40964104
Nascimento, G.G.F.; Locatelli, J; Freitas, P.C. (2000). Antibacterial activity of plant
extracts and phytochemicals on antibiotic-resistent bacteria. Brazilian Journal
of Microbiology. 31: 247 256.
Novgorodov, S.A.; Gudz, T.I. (1996). Permeability transition pore of the inner
mitochondrial membrane can operate in two open states with different
selectivities. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 28:139146.
Onawunmi, G.O. (1989). Evaluation of the antimicrobial activity of citral. Letters in
Applied Microbiology. 9: 105-108.
63
Outtara, B.; Sirmad, R.E.; Piette, G.J.P.; Begin, A. (1997). Antimicrobial activity of
selected fatty acids and essencial oils against six meat spoilage organisms.
International Journal of Food Microbiology. 37, 155-162.
Pauli, A. (2001). Antimicrobial properties of essential oil constituints. International
Journal of Aromatherapy. 11: 126-133.
Perry, N. S.; Houghton, P. L.; Sampson, J.; Theobald, A. E.; Hart, S.; Lis-Balchin, M.;
Hoult, J. R.; Evans, P.; Jenner, P.; Milligan, S.; Perry, E. K. (2001). In-vitro
activity of S. lavandulaeofolia (Spanish sage) relevant to treatment of
Alzheimer's disease. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 53(10): 134756.
Rabbani, S. I.; Devi, K.; Khanam, S.; Zahra, N. (2006). Citral, a component of
lemongrass oil inhibits the clastogenic effect of nickel cchloride in mouse
micronucleus test system. Pakistan Journal of Pharmaceutical Sciences. 19
(2): 108-13.
Rabello-Gay. (1991). Mutagnese, carcinognese e teratognese: mtodos e
critrios de avaliao. In: Nazareth, A.; Rabello-Gay, la Regina
Rodrigues, M. A. (Ed) Sociedade Brasileira de Gentica. p241.
Ramos, M.F.S. (2006). Desenvolvimento de microcosulas contendo frao voltil
de copaba por spray-drying: estudo de estabilidade e avaliao
farmacolgica. Tese de doutorado. Faculdade de Cincias Farmacuticas
de Ribeiro Preto, Universidade de So Paulo. Ribeiro Preto, SP
Ramzi, A.A.M.; Salah A.A.A.; Sidgi, H.; Faisal, M.N.A.; Sama, A.Z.A.; Ulrike, L.
(2008).
Antimicrobial,
antioxidant
and
cytotoxic
activities
and
against
foodborne
pathogens
and
spoiling
bacteria.
Food
Chemistry.103: 823-828.
Santos, F.A.; Rao, V.S.N. (2001). 1,8- Cineol, a food flavoring agent, prevents ethanolinduced gastric injury in rats. Digestive Diseases and Sciences . 46: 331-337.
Santos, F. A.; Silva, R. M.; Campos, A. R.; de Arajo, R. P.; Lima Jnior, R. C. P.; Rao,
V. S. N. (2004). 1,8-cineole (eucalyptol), a monoterpene oxide attenuates the
colonic damage in rats on acute TNBS-colitis. Food and Chemical
Toxicology. 42: 579-584.
Scola, G.; Conte, D.; Spada, P.W.D.S.; Dani, C.; Vanderlinde, R.; Funchal, C.;
Salvador, M. (2010). Flavan-3-ol compounds from wine wastes with in vitro
and in vivo antioxidant activity. Nutrients. 2: 1048-1059
Seo, K.A.; Kim, H.; Ku, H.Y.; Ahn, H.J.; Park, S.J.; Bae, S.K.; Shin, J.G.; Liu, K.H.
(2008). The monoterpenoids citral and geraniol are moderate inhibitors of
CYP2B6 hydroxylase activity. Chemico-Biological Interactions. 174: 141146.
65
66
Southwell, I. A.; Hayes, A.J.; Markaham, J.L.; Leach, D.N. (1999). The search for
optimally bioactive Australian tea tree oil. Acta Horticulaturae. 334:265-275
Soares, D. G.; Andreazza, A. C.; Salvador, M. (2003). Sequestering ability of butylated
hydroxytoluene, propyl gallate, resveratrol, and vitamins C and E against
ABTS, DPPH, and hidroxil free radicals in chemical and biological systems.
Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51(4): 1077-1080.
Spada, P.K.W.D.S.; Salvador M. (2005) Antioxidant activity of the flavonoid hesperidin
in chemical and biological systems. Journal of Agricultural and Food
Chemistry. 53(12):4757- 4761.
Spada, P.W.D.S.; Souza, G.G.N.; Bertolini, G.V.; Henriques, J.A.P.; Salvador, M.
(2008). Antioxidant, mutagenic, and antimutagenic activity of frozen fruits.
Journal of Medicinal Food. 11(1): 144-51.
Svoboda, K.P.; Deans, S.G. (1995). Biological activities of essential oils from selected
aromatic plants. Acta Horticulturae. 390: 203-209.
Tassau, C.; Koutsoumanis, K.; Nychas, G.J.E. (2000). Inhibition of Salmonella
enteriditis and Staphylococcus aureus in nutrient broth by mint essential oil.
Food Research International. 33: 273-280.
Tepe, B.; Donmez, E.; Mehmet, U.; Candan, F.; Daferera, D.; Vardar-Unlu, G.;
Polissiou M.; Sokmen A. (2004). Antimicrobial and antioxidative activities of
the essential oils and methanol extracts of Salvia cryptantha (Montbret et
Aucher ex Benth.) and Salvia multicaulis (Vahl). Food Chemistry. 84:519-525
Teplitski, M.; Robinson, J.B.; Bauer, W.D. (2000). Plants secrete substance that momic
bacterial N-acyl homoserine lactone signal activities and affect population
density-dependent behaviors in associated bacteria. Molecular Plant-Microbe
Interactions. 13, 637-648.
Tiwari, M. & Kakkar, P. (2009). Plant derivaded antioxidants Geraniol and camphene
protect rat alveolar macrophages against t-BHP induced oxidative stress.
Toxicology In Vitro. 23(2): 295-301.
67
Tozoni, D.; Zacaria, J.; Vanderlinde, R.; Delamare, A.P.L.; Echeverrigaray, S. (2010).
Degradation of citronellol, citronellal and citronellyl acetate by Pseudomonas
mendocina IBPse 105. Eletronic Journal of Biotechnology. 13: 1-7.
Trombeta, D.; Castelli, F.; Sarpietro, M.G.; Venuti, V.; Cristani, M.; Daniele, C.; Saija,
A.; Mazzanti, G.; Bisignano, G. (2005). Mechanisms of antibacterial action of
three monoterpenes. Antimicrobial Agents and Chemoterapy. 49(6): 24742478.
Turina, A. Del V.; Nolan, M.V.; Zygadlo, J.A.; Perillo, M.A. (2006). Natural terpenes:
Self-assembly and membrane partitioning. Biophysical Chemistry. 122: 101113.
Valant-Vetschera, M. K.; Roitman, N. J.; Wollenweber, E. (2003). Chemodiversity of
exudate flavoids in some members of the Lamiaceae. Biochemical
Systematics and Ecology. 31:1279-1289
Vercesi, A. E.; Kowaltowski, A.J.; Grijalba, M.T.; Meinicke, A.R.; Castilho, R.F.
(1997). The role of reactive oxugen species in mitocondrial permeability
transition. Bioscience Reports. 17: 43-52.
Yamaguchi, T.; Takamura, H.; Matoba, T.C.; Terao, J. (1998). HPLC method for
evaluation of the free radical-scavenging activity of foos by using 1,1diphenyl-2-picrylhydrazil. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 62:
1201-1204.
Zgrka, G.; Glowniak, K. (2001). Variation of free phenolic acids in medicinal plants
belonging to the Lamiaceae family. Journal of Pharmaceutical and
Biomedical Analysis.26:79-87.
Zhang, L.H. (2003). Quorum sensing and proactive host defense. Trends in Plant
Science. 8: 238-244.
Zwenger, S.; Basu, C. (2008). Plant terpenoids: applications and future potentials.
Biotechnology and Molecular Biology Reviews. 3 (1): 001-007.
68
69