Universidade Federal do ABC

Transformaes Bioqumicas

RELATRIO 03 Desnaturao e Precipitao de Protenas

Caroline Delcole Borsolari Diego Rodrigo Massa Monteiro Henrique de Abreu Piccolo Jucilaine dos Santos Pereira Lidia Furukawa Prof Jiri Borecky

Santo Andr 2009 1

SUMRIO

PGINA 1 INTRODUO ....................................................................................................... 2 OBJETIVO .............................................................................................................. 3 MATERIAIS E MTODOS ................................................................................... 3.1 Materiais ........................................................................................................... 3.2 Mtodos ......................................................................................................... 6 3.2.1 Extrao do suco de abacaxi ......................................................................... 3.2.2 Preparao da gelatina ................................................................................ 3.2.3 Ensaio 1 ........................................................................................................ 3.2.3 Ensaio 2 ......................................................................................................... 3 5 6 6 6 7 7 7

4 RESULTADOS ........................................................................................................ 8 4.1 Tabelas e fotos dos resultados ............................................................................. 8 4.2 O efeito do suco de abacaxi no colgeno ............................................................. 12 4.3 O efeito da temperatura sobre as enzimas do suco de abacaxi ............................. 13 4.4 O efeito do etanol e do sulfato de amnio sobre as protenas em soluo ........... 13 4.5 Dificuldades tcnicas ............................................................................................ 14 5 DISCUSSO ............................................................................................................. 14 5.1 As proteoses do suco de abacaxi .......................................................................... 14 5.2 Purificao de protenas ........................................................................................14 5.3 A otimizao da atividade das proteases .............................................................. 14 5.4 O efeito da temperatura na desnaturao de protenas no processo de cozimento dos alimentos .............................................................................................................. 15 5.5 A utilizao do abacaxi para amaciar carne ..........................................................15 6 CONCLUSO.............................................................................................................15 7 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ....................................................................16

1 INTRODUO Proteases (ou enzimas proteolticas) um grupo de enzimas que catalisam a quebra das ligaes peptdicas entre os aminocidos das protenas. A Unio Internacional de Bioqumica e Biologia Molecular (IUBMB, 1984) sugeriram o uso do termo peptidase para um subconjunto de peptdeo-hidrolases (subclasse E.C 3.4). O termo protease usado como sinnimo de peptidase. As peptidases compreendem dois grupos: endopeptidases (EC 3.4. 21-99) e exopeptidases (EC 3.4.11-19), de acordo com a posio da ligao peptdica a ser clivada na cadeia peptdica e a eliminao do aminocido seqencial do terminal N ou C. A Figura 1 mostra o esquema de nomenclatura das proteases. O termo proteinase tambm pode ser usado para endopeptidase [SALLEH, RAHMAN & BASRI, 2006].

FIGURA 1: Esquema de nomenclatura moderna de proteases [SALLEH, RAHMAN & BASRI, 2006]. Endopeptidases Endopeptidases atuam preferencialmente nas regies internas da cadeia polipeptdica, entre as regies N e C terminal. A presena de grupos a-amino ou acarboxila tem um efeito negativo na atividade da enzima. As endopeptidases podem ser subdivididas de acordo com o grupo reativo no stio ativo envolvido com a catlise em serina- (EC 3.4.21), cistena- (EC 3.4.22), asprtico-proteinases ou endopeptidases (EC 3.4.23) e metalloproteinases ou metalloendopeptidases (EC 3.4.24). 3

Exopeptidases As exopeptidases atuam somente nos finais das cadeias polipeptdicas na regio N ou C terminal. Aquelas que atuam na regio amino terminal livre liberam um nico resduo de aminocido (aminopeptidases), um dipeptdeo (dipeptidil-peptidases) ou um tripeptdeo (tripeptidil-peptidases). As exopeptidases que atuam na regio carboxi terminal livre liberam um nico aminocido (carboxipeptidases) ou um dipeptdeo (peptidil-dipeptidases). Algumas exopeptidases so especficas para dipeptdeos (dipeptidases) ou removem resduos terminais que so substitudos, ciclizados ou ligados por ligaes isopeptdicas. Ligaes isopeptdicas so ligaes peptdicas diferentes daquelas entre uma a-carboxila e um a-amino grupo, e estes tipos de enzimas so denominados omega peptidases. Fontes Proteases podem ser obtidas das plantas, animais e microorganismos. Proteases produzidas das plantas incluem a papana, bromelina, queratinase e ficina. A papaina extrada do mamo (Carica papaya). A bromelina extrada do caule e frutos do abacaxi e a ficina obtida do ltex da figueira (Ficus glabrata). Essas trs proteases tm especificidades similares, apesar de serem obtidas em diferentes fontes. Alguns grupos de plantas botnicas produzem queratinase, que pode degradar o cabelo. Alguns exemplos de proteases produzidas por animais so protaminase, tripsina, quimotripsina, pepsina e renina. A protaminase isolada de pncreas bovino, lees marinhos e porcos, enquanto a tripsina e a quimotripsina so sintetizadas no pncreas e secretadas na forma de zimognio (tripsinognio e quimotripsinognio, respectivamente). A pepsina pode ser obtida a partir de clulas da mucosa gstrica de porcos, e a renina, do estomago de carneiros [SALLEH, RAHMAN & BASRI, 2006]. Aplicao das Proteases Proteases tm grandes aplicaes industriais, principalmente nas indstrias de comida, detergentes, medicina e biotecnologia. Muitas proteases bacterianas foram purificadas, classificadas e comercializadas. Na indstria alimentcia, por exemplo, a aplicao das proteases inclui a produo de queijos, solubilizao de pasta de peixe e amaciamento de carnes. Alm disso, as proteases tambm so muito utilizadas no tratamento do couro em substituio aos compostos txicos e poluentes at ento 4

utilizados. Pelos aspectos econmicos e tecnolgicos, as proteases bacterianas so as enzimas industriais mais utilizadas, com grandes aplicaes em vrias indstrias, como detergente, couro, seda, po, carnes e cervejarias. As proteases englobam 60% da venda internacional de enzimas, sendo a enzima de detergente a maior usuria de proteases [SALLEH, RAHMAN & BASRI, 2006]. As proteases tambm esto envolvidas em processos biolgicos essenciais, como a coagulao sangunea, morte celular e diferenciao de tecidos. Vrias etapas proteolticas importantes ocorrem no mecanismo invasivo de tumores, assim como no ciclo de infeco de um grande nmero de vrus e microrganismos patognicos. Estes fatos tornam as proteases um alvo quimioterpico valioso para o desenvolvimento de novos compostos farmacuticos. As enzimas proteolticas tambm participam no catabolismo de protenas, tanto nas vias degradativas como nas biossintticas, e na liberao de hormnios peptdeos farmaceuticamente ativos a partir de protenas precursoras. Certas modificaes especficas e seletivas de protenas durante a ativao de enzimas ocorrem via protelise, que tambm colabora no transporte de protenas secretrias na membrana. Na indstria farmacutica, as proteases so usadas em pomadas cicatrizantes e tm um uso potencial para outros medicamentos. Proteases hidrolisam as protenas em peptdeos e aminocidos, facilitando a sua absoro pelas clulas; devido a seu papel despolimerizante, as enzimas extracelulares tm um papel importante na nutrio. 2 OBJETIVO Mostrar a atividade proteoltica presente no suco de abacaxi, o efeito da desnaturao protica por temperatura e o efeito da alterao de solubilidade protica e conseqente precipitao provocados pela adio de lcool ou sal de amnio em soluo de gelatina (colgeno).

3 MATERIAIS E MTODOS 3.1 Materiais 8 tubos de ensaio de 20 mL 1 tubo de ensaio de 30 mL Pegador de tubo de ensaio Estande para tubo de ensaio Bquer de 100mL da Laborgls Bquer de 400mL da Laborgls Bquer de 20mL da Laborgls Funil de vidro Papel de filtro Gelo Almofariz e pistilo 2 pipetas graduadas de 5mL Basto de vidro Pera Balana Estufa H2O destilada Soluo de Sulfato de Amnio 3mol/L Etanol Abacaxi Gelatina incolor sem sabor

3.2 Mtodos 3.2.1 Parte 1 Extrao do suco de abacaxi Macerou-se os pedaos de abacaxi com o auxlio do almofariz e do pistilo, at que uma boa quantidade de suco fosse produzida. O suco foi filtrado em funil de vidro

com papel de filtro dentro de um tubo de ensaio de 20mL que se encontrava em um bquer com gelo para que fosse mantida as propriedades do suco de abacaxi.

3.2.2 Parte 2 Preparao da gelatina Pesou-se 2g de gelatina incolor sem sabor e dissolveu em 20mL de gua destilada em um bquer com a ajuda do basto de vidro. Aps total solubilizao a gelatina derretida foi transferida para um tubo de 20mL e levada estufa de banho maria 60C. A gelatina ficou na estufa at o momento da sua utilizao. 3.2.3 Parte 3 Ensaio 1 Com a pipeta colocou-se 2mL do suco de abacaxi obtido na parte 1 do experimento em trs tubos de ensaio de 20mL. Colocou-se 2mL de gua em um tubo de ensaio de 20mL. Um tubo com abacaxi e o de gua foram mantidos temperatura ambiente, os outros dois foram aquecidos, ao mesmo tempo, um 60C e o outro 100C durante 5 minutos. Aps esse tempo os dois tubos foram resfriados imediatamente no bquer com gelo. Retirou-se o tubo com a gelatina da estufa e adicionou-se 2mL em cada um dos quatro tubos. Armazenou-se os 4 tubos 37C por 10 minutos. Aps o tempo resfriou-se as amostras no bquer com gelo por 15 minutos. As amostras foram observadas e os resultados anotados. 3.2.4 Parte 4 Ensaio 2 Com a pipeta colocou-se 2mL de gua, sulfato de amnio e etanol, um em cada tubo de ensaio. Adicionou-se 2mL de gelatina em cada um dos trs tubos. As amostras foram observadas e os resultados anotados.

4 RESULTADOS 4.1 Tabelas e fotos dos resultados Os resultados obtidos na Parte 1 podem ser observados na Tabela 1: TABELA 1: A ao das proteases do abacaxi sobre o colgeno gua Amostra Gelatina Resultado Branco 2 mL 2 mL Slido e sem partculas. Abacaxi 2 mL 2 mL Lquido e sem partculas. Abacaxi 60 C 2 mL 2 mL Lquido e com pequenas partculas. Abacaxi fervido 2 mL 2 mL Slido e com muitas partculas.

As respectivas fotos dos resultados da Tabela 1 esto nas Figuras 2, 3, 4 e 5:

FIGURA 2: Resultado Branco Parte 1

FIGURA 3: Resultado Abacaxi

FIGURA 4: Resultado Abacaxi 60C

FIGURA 5: Resultado Abacaxi Fervido

Os resultados obtidos na Parte 2 podem ser observados na Tabela 2: TABELA 1: A ao do etanol e do sulfato de amnio sobre o colgeno Branco gua Gelatina Sulfato de Amnio Etanol Absoluto 2 mL 2 mL Solubilizou, a Resultado soluo adquiriu colorao amarelada. Ensaio 1 2 mL 2 mL Solubilizou parcialmente, com formao de placas slidas. 2 mL 2 mL Solubilizou parcialmente, com formao de precipitado gelatinoso. Ensaio 2

As respectivas fotos dos resultados da Tabela 2 esto nas Figuras 6, 7 e 8:

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FIGURA 6: Resultado Branco Parte 2

FIGURA 7: Resultado Ensaio 1

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FIGURA 8: Resultado Ensaio 2 4.2 O efeito do suco de abacaxi no colgeno A desnaturao de protenas acarreta perda de sua estrutura original (Figura 9). A protena assume sua conformao nativa, ocorrendo alterao na conformao tridimensional das protenas (estrutura secundria, terciria e quaternria) sem romper as ligaes peptdicas (estrutura primria). A protena dita desnaturada quando sua conformao nativa destruda devido a quebra de ligaes no-covalentes e o resultado uma cadeia polipeptdica distendida.

FIGURA 9: Desnaturao de Protenas

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Um dos agentes de desnaturao de protenas ao de cidos ou base fortes. Quando adicionamos o suco de abacaxi ao colgeno ocorrem modificaes no pH que resultam em alteraes no estado inico de cadeias laterais das protenas, modificando as pontes de hidrognio e as pontes salinas (associao de grupos inicos de protenas de carga oposta). Como afeta a ionizao da protena, conferem a molcula uma elevada carga positiva, ou negativa, ocasionando repulso intramolecular, com exposio do ncleo hidrofbico. 4.3 O efeito da temperatura sobre as enzimas do suco de abacaxi Quando elevamos a temperatura do suco de abacaxi, as enzimas presentes no suco de abacaxi so tambm desnaturadas, e a capacidade de quebra do colgeno corrompida. Como a estrutura tridimensional especfica das protenas fundamental para o exerccio de suas funes, alteraes estruturais provocadas pela desnaturao ocasionam a perda parcial ou completa das suas funes. Com o aumento da temperatura, a velocidade de vibrao molecular aumenta. Eventualmente, interaes fracas como as pontes de hidrognio so rompidas promovendo alteraes na conformao das enzimas presentes no abacaxi. 4.4 O efeito do etanol e do sulfato de amnio sobre as protenas em soluo A adio de solvente orgnicos solveis em gua, como o etanol, ao colgeno presente na gelatina diminuem a constante dieltrica do meio, interferem com as interaes hidrofbicas por sua interao com os grupos R nopolares e forma pontes de hidrognio com a gua e grupos proticos polares. Os solventes no-polares tambm rompem interaes hidrofbicas. A adio de sais, como o sulfato de amnio a grupos ionizveis do colgeno, enfraquecem as interaes entre grupos de cargas opostas da molcula protica. As molculas de gua solvatam os grupos proticos, havendo a formao de um precipitado gelatinoso. As molculas de gua competem pelo sal adicionado tornando a quantidade de solvente muito pequena e, com isso, promovendo a agregao de molculas proticas e a sua precipitao. Esse efeito chamado salting out.

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4.5 Dificuldades tcnicas O suco de abacaxi poderia ter sido coado em antes de ser filtrado, para que os maiores pedaos fossem tirados primeiro e no interferissem na filtragem de carter to delicado. 5 DISCUSSO 5.1 As proteases do suco de abacaxi O abacaxi possui uma potente enzima, a bromelina, que leva esse nome pelo fato de o abacaxi pertencer famlia das bromeliceas. A bromelina foi detectada pela primeira vez em 1892 por Chittenden. Ela est presente em todas as partes do abacaxi, porm no caule que se encontra maiores quantidades, por isso que se diz que a bromelina no fornecida em grandes quantidades se apenas for degustado o abacaxi. A enzima no est presente nos primeiros estgios de desenvolvimento do fruto, porm, seu nvel aumenta rapidamente, mantendo-se elevado at o amadurecimento, onde tem um pequeno decrscimo. Essa uma das vantagens da utilizao das proteases do abacaxi em comparao com outras proteases vegetais. Apesar da diminuio da atividade proteoltica durante a maturao, o abacaxi o nico fruto que possui concentraes relativamente altas de proteases no estado maduro. 5.2 Purificao de protenas A purificao da bromelina pode ser realizada atravs de um mtodo conhecido por ALE (Adsoro em Leito Expandido). Esta uma tcnica cromatogrfica para separao e purificao de produtos biolgicos diretamente de seu extrato bruto, sem o uso de centrifugao, microfiltrao e outros passos primrios de clarificao. Esta tcnica permite que o extrato bruto seja alimentado na coluna cromatogrfica sem tratamento inicial, e enquanto o leito expande, a superfcie de contato do adsorvente aumenta, fazendo que a interao com a molcula alvo seja mais efetiva. 5.3 A otimizao da atividade das proteases A atividade das proteases pode ser otimizada com o aumento da temperatura e com a proximidade do pH neutro. Esta temperatura no pode ser muito elevada, seno ir ocorrer a desnaturao da protease.

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5.4 O efeito da temperatura na desnaturao de protenas no processo de cozimento dos alimentos A desnaturao de protenas no tem grande influncia na utilidade nutricional dos alimentos, mas tem grande efeito em outras propriedades como sabor, cor, estabilidade e solubilidade, ou seja, a desnaturao de protenas pelo fornecimento de calor til, pois facilita a digesto dos alimentos. Por exemplo, quando cozinhamos um ovo, as protenas desnaturadas tornam-se insolveis e se solidificam, separando-se da gua, o que torna-se melhor para o consumo. 5.5 A utilizao do abacaxi para amaciar carne Esta propriedade deve-se bromelina, que capaz de desdobrar protenas em substncias mais simples como proteoses e peptonas. Ela quebra as protenas das fibras musculares e do tecido conjuntivo, que d liga ao msculo e um dos principais responsveis pela eventual dureza da carne. A relao do suco de abacaxi e os amaciantes de carne comerciais so de que a bromelina pode ser utilizada na frmula do amaciante. Os amaciantes comerciais juntam temperos, fazendo com que no fique gosto de abacaxi na carne. Um exemplo que temos, um amaciante de carne da Nestl, que utiliza a protease do mamo, a chamada papana. 6 CONCLUSO Durante o experimento, verificamos que as proteases (enzimas catalticas biolgicas) atuam nas ligaes peptdicas, neste caso, foram s ligaes do colgeno e as quebram. A prova disso que quando a protease envolvida (bromelina) foi desnaturada, portanto perdendo sua funo, o colgeno reagiu naturalmente, ou seja, enrijeceu a soluo, como mostrado nos experimentos. Observamos tambm que uma das vias para o desnaturamento o aumento da temperatura, pois a 100 C a bromelina perdeu totalmente seu poder de reao com o colgeno. Isto pode ser visto com as fases presentes nos tubos de ensaio. Alm da temperatura, tm-se tambm a solvatao que foi realizada na segunda parte do experimento e que demonstrou mesmo com a temperatura sendo ambiente como as foras nas ligaes peptdicas podem modificar-se de acordo com o reagente colocado para atuar na protena. Dessa maneira, acrescentamos mais um grau de complexidade aos organismos vivos, pois para eles existirem, para que suas protenas exeram suas devidas funes e 15

no saiam de controle, deve haver intrincados sistemas de controle de temperatura e de reaes bioqumicas. 7 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS - SALLEH, Abuh B., RAHMAN, Rajah A., BASRI, Mahiran: New Lipases and Proteases. 1 Ed. Nova Science Publishers: New York, 2006, p. 23-34. URL 01: Proteases de Microorganismos. Disponvel em:

http://acd.ufrj.br/proteases/ProteaseApres.htm. Acesso em 08/11/2009. URL 02: Bromelina. Disponvel em: Acesso

http://www.todafruta.com.br/todafruta/mostra_conteudo.asp?conteudo=19499. em 08/11/2009. -URL 03: Bromelina como amaciante natural de

carnes.

http://www.sbpcnet.org.br/livro/57ra/programas/senior/RESUMOS/resumo_1398.html. Acesso em 08/11/2009. - URL 04: Abacaxi. http://supermundo.abril.com.br/busca/?qu=abacaxi. Acesso em 08/11/2009.

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