Universidade Federal de São Carlos

Centro de Ciências Biológicas e de Saúde

Departamento de Genética e Evolução
Rodovia Washington Luís (SP-310), Km 235
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Relatório Aula 9 - 26/01/2024

Transformação, clonagem e recombinação “in vivo” no organismo modelo

Saccharomyces cerevisiae

DISCIPLINA: Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular

Prof° Iran Malavazi

Grupo1:

Adriele Rocha - 743440

Clara de Jesus Prado - 791042

Gabriela Toquini Cardoso Oliveira - 801512

Letícia Fernandes Teixeira - 800849

Maria de Fatima Bueno - 726471

SÃO CARLOS
2024
 Sumário

1. INTRODUÇÃO..................................................................................................................... 2
1.1 Saccharomyces cerevisiae........................................................................................2
2. MATERIAIS E MÉTODOS................................................................................................... 4
3.1 Materiais utilizados:................................................................................................... 4
3.2 Métodos utilizados:....................................................................................................4
3. OBJETIVO........................................................................................................................... 4
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................................................... 4
4. 1. Transformação, clonagem e recombinação em Saccharomyces cerevisiae:... 4
4. 2. Abordagens para a produção de cassetes gênicos:............................................ 6
4. 3. Saccharomyces cerevisiae para a produção de cassetes gênicos:................... 7
4. 4. Vetor e cassete de Cyp51A fusionada a mRFp em célula de mamífero:........... 8
4. 5. Técnica de Gibson Assembly (New England Biolabs):........................................ 9
5. CONCLUSÃO.................................................................................................................... 11
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................................. 12

1
 1. INTRODUÇÃO

1.1 Saccharomyces cerevisiae

A saccharomyces cerevisiae é uma espécie de levedura eucariota unicelular

pertencente ao reino dos fungos. Sendo amplamente utilizada, seja em produção de
pães, bebidas alcoólicas e até mesmo para produção de álcool combustível com
aplicações em indústrias de nutrição animal e biocombustíveis.

Podendo realizar até dois tipos de metabolismo oxidativo como a respiração e

a fermentação, em condições de aerobiose realizando a respiração aeróbica e em
condições de anaerobiose realiza fermentação alcoólica. Capaz de usar açúcares
diferentes, como a glicose, também sendo anaeróbico facultativo, ou seja, é
desenvolvimento em condições na ausência de oxigênio onde a glicose é convertida
em diferentes intermediários, como etanol, CO2 e glicerol.

Sua característica baseada no efeito Crabtree ou “fazer; acumular e consumir”,

evoluindo em saccharomyces cerevisiae, envolvendo a perda de sequências
específicas de regulação de vários promotores de genes envolvidos na respiração,
estando presentes em outros gêneros de leveduras, como Cândida, e ausente em
leveduras como Dekkera. Sua característica de “fazer, acumular e consumir” faz
com que mesmo em condições aeróbicas não seja utilizada respiração para
metabolizar sacarídeos promovendo o crescimento de biomassa, ao invés disso,
ocorre a produção de etanol e outros dois carbonos, via piruvato. Com a produção
de etanol confere uma vantagem competitiva promovendo seu próprio crescimento.

1.2 Técnica de cassetes

A técnica de cassetes de deleção e/ou substituição gênica são obtidas pela

amplificação por PCR sobre determinados plasmídeos, encontrado no módulo
central das cassetes. Sendo utilizadas para estudar funções para determinados
genes em uma célula.

Normalmente, as células de Saccharomyces cerevisiae são usadas para

inserir um cassete, que é um fragmento de DNA projetado para deletar ou substituir

2
um gene de interesse em organismos alvo. Isso é feito para criar mutantes que são
usados para estudar as funções biológicas do produto desse gene. No
procedimento, começa-se com um gene de interesse, chamado gene alvo (open
reading frame, ORF), e as regiões 5' e 3' deste gene são amplificadas por PCR. O
gene cyp51A de Aspergillus fumigatus é usado como marcador auxotrófico ou
dominante e é amplificado a partir de plasmídeos que o contêm. Os fragmentos 5',
3' e o marcador de seleção formam o cassete de deleção, que é inserido no
plasmídeo usando as regiões homólogas presentes nas extremidades do cassete e
o sítio múltiplo de clonagem do gene que será inserido.

Para a montagem da técnica cassete foi utilizada in vivo pela levedura

Saccharomyces cerevisiae, através de recombinação homóloga sendo um processo
celular, onde enzimas específicas e reguladas são utilizadas para misturar e
rearranjar cromossomos homólogos sendo pareados antes da primeira divisão no
processo de meiose. Quando o pareamento ocorre, acontecem as permutações
genéticas conhecidas como crossing-over. Além de ser utilizado método de acetato
de lítio usado para introduzir DNA exógeno, sendo de carga positiva assim
neutralizando a carga negativa da membrana celular facilitando a entrada de DNA
exógeno na célula também possuindo carga negativa. Também foi utilizado o DNA
de esperma de salmão empregado como um vetor ou um “transportador” por ser
grande e puro, facilitando a entrada na célula do DNA de interesse, ou seja, o
plasmídeo.

3
 Figura 01: Adaptação do primer

Fonte: Adaptada pelo grupo

1.3 Auxotrofia e prototrofia

Um organismo auxotrófico é um microrganismo com capacidade de sintetizar

um determinado tipo de nutriente ou compostos orgânicos para seu crescimento.
Através de sais minerais, fonte de carbono, aminoácidos, vitaminas, peptona,
extrato de levedura, caseína hidrolisada e extrato de carne, sendo que
microrganismos que não crescem em meios mínimo, são denominados de
prototrófica. A exigência nutricional surge através de uma mutação presente no
material genético do organismo, se aplicando para condições específicas, a
auxotrofia ocorre devido a uma mutação específica que resulta na perda da
capacidade de sintetizar um determinado elemento, como um aminoácido.

De modo geral, os microrganismos necessitam de uma variedade de nutrientes

essenciais para seu crescimento, como fonte de carbono, fonte de energia e
diversos íons, que demandam nutrientes adicionais além dos básicos considerados
auxotróficos resultando em mutações de DNA.

4
 Em prototrofia é a capacidade do microrganismo de crescer em meio,
composto apenas por sais minerais e açúcares simples, sem a necessidade de
adição de nutrientes específicos. Com várias marcas de seleção são empregados
para a expressão heteróloga em Saccharomyces cerevisiae. Sendo que os genes
marcadores usados para marcas auxotróficas são alelos do tipo selvagem que
codificam enzimas essenciais em vias metabólicas as quais estão relacionadas.

Entre as marcas auxotróficas estão LEU2, TRP1, URA3, HIS3 e HIS4,

aplicadas em linhagens que não conseguem sintetizar leucina, triptofano, uracila e
histidina. Sendo que a linhagem SC 9421 utilizada, é uma linhagem laboratorial,
apresentada na marca auxotrófica URA3.

5
 2. OBJETIVOS

Este relatório tem objetivo de elucidar o processo de transformação, clonagem

e recombinação “in vivo” no organismo modelo Saccharomyces cerevisiae, seguindo
um protocolo detalhado. O experimento abrange diversas etapas, desde a
preparação do pré-inóculo até a análise das colônias resultantes. Através desta
atividade, os alunos tiveram a oportunidade de aplicar e compreender técnicas
essenciais em biologia molecular, incluindo cultivo celular, preparação de soluções,
manipulação de DNA e seleção de células transformadas. Além disso, foram
introduzidos aos princípios subjacentes da recombinação genética e à utilização de
plasmídeos como vetores para a inserção de genes exógenos em células
hospedeiras. Essa experiência prática promoveu uma compreensão mais
aprofundada dos processos biológicos envolvidos na manipulação genética e
preparou os participantes para investigações científicas futuras nesta área.

6
3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Materiais utilizados:

1. Tubo tipo Falcon de 50 mL

2. Colônias rejuvenescidas da linhagem de S. cerevisiae SC9721 (URA-);
3. Meio de cultura YPD;
4. Incubadora a 30°C;
5. Erlenmeyer;
6. Espectrofotômetro;
7. Solução de TE estéril 1x;
8. Solução recém-preparada de TE 1x/LiAc 1x;
9. Shaker;
10. Solução de acetato de lítio 1x/PEG 40% (polietilenoglicol 3350);
11. Termociclador;
12. Gelo;
13. Microcentrífuga;
14. Solução de TE 1x estéril;
15. Placas de Petri;
16. Meio SC URA- sólido;
17. Alças de Drigalski;
18. Lamparina;
19. Células SC9721 (µL);
20. pRS426 circular (200 ng/µL);
21. pRS426 linear EcoRI/BamHI (200 ng/µL);
22. Promotor gpdA PCR, primers1 + 2, 1.514 pb (200 ng/µL);
23. Gene cyp51A PCR, primers 3 + 4, (1.665 pb (200 ng/µL);
24. mRFP PCR, primers 5 + 6, 690 pb (200 ng/µL);

7
 25. Terminador trpC + gene de resistência ptrA PCR, primers 7 + 8, 2.889 pb
(200 ng/µL);
26. DNA de esperma de salmão (10 mg/mL);

3.2 Métodos utilizados:

3.2.1 Crescimento da cultura

O processo de preparo do pré-inóculo de Saccharomyces cerevisiae para a

transformação genética foi realizado pelos técnicos anteriormente a aula, neste
processo basicamente foi necessário que no primeiro dia uma colônia rejuvenescida
da linhagem SC9721 (URA-) fosse inoculada em meio YPD sólido e incubada
durante a noite a 30°C. Assim o pré-inóculo foi transferido para um erlenmeyer
contendo YPD líquido e incubado a 30°C sob agitação até atingir uma densidade
óptica (DO600) de 0,4 a 0,6 (pontoque indica a fase exponencial de crescimento
celular, fundamental para o sucesso da transformação), por fim, o meio YPD líquido
foi usado como branco para zerar o espectrofotômetro antes da leitura da densidade
óptica das células.

3.2.2 Separação e lavagem das células obtidas

Inicialmente, a cultura de células foi transferida para um tubo estéril e

centrifugada por 6 minutos a 2.500 rpm para separar as células do meio de cultura.
Após descartar o sobrenadante resultante dessa centrifugação foi possível
ressuspender as células em uma solução de TE estéril para lavagem. Em seguida
foi realizada uma segunda centrifugação (5 minutos a 2.500 rpm) e novamente
realizou-se o descarte do sobrenadante, as células são novamente ressuspendidas
em uma solução contendo TE e LiAc, preparando-as para o próximo estágio do
processo de transformação genética.

3.2.3 Preparo das reações de transformação

Os tubos contendo as células foram incubados em uma solução de TE e LiAc

por uma hora a uma temperatura de 30°C, com agitação constante (200 rpm no

8
shaker). Após a incubação, as alíquotas da suspensão celular foram dispensadas
em tubos estéreis numerados de 1 a 4 para as reações de transformação, conforme
especificado na tabela 01. A desnaturação do DNA do esperma de salmão foi
realizada previamente, ele foi aquecido no termociclador a 98°C por 5 minutos e, em

seguida, colocando-o no gelo para evitar a renaturação. Esse processo foi realizado
pelos técnicos, e o DNA desnaturado foi fornecido para as reações de
transformação. É crucial realizar as reações rapidamente, evitando deixar os tubos
abertos, e montá-las com assertividade e eficiência.

Tabela 01: Reações de transformação de S. cerevisiae e seus componentes

Fonte: Fornecido em relatório pelo docente.

Após a incubação dos tubos a 30°C por 30 minutos no shaker (agitação

constante de 250 rpm), os mesmos foram retirados e então uma solução de acetato
de lítio 1x/PEG 40% é adicionada a cada um, seguida todos foram invertidos 5
vezes para realizar a homogeneização da solução. Os tubos foram então incubados
a 42°C por 30 minutos para o choque térmico, tal procedimento permitiu a entrada
do DNA exógeno na célula de S. cerevisiae permeabilizada pelo acetato de lítio.
Após a incubação, as células são centrifugadas a 4.000 rpm por 2 minutos em uma
microcentrífuga. O pellet resultante foi lavado com TE 1x estéril e pH 7,5, seguido
por nova centrifugação e descarte do sobrenadante. Finalmente, o pellet é
ressuspenso em 100 µL de TE 1x estéril.

3.2.4 Inoculação das células em meio seletivo

9
 Para prosseguir com a análise, quatro placas de meio SC URA- sólido foram
preparadas, permitindo o crescimento seletivo das células que incorporaram o
plasmídeo pRS426 circularizado. As placas foram então identificadas conforme
instruído, foi necessário ter um cuidado especial para evitar a contaminação cruzada
durante a inoculação das células. Após a incubação a 30°C por 3 a 4 dias, as
colônias de levedura recombinantes foram fotografasse enviadas aos alunos para
assim serem analisadas para verificar o sucesso da recombinação e isolamento do
plasmídeo desejado. Embora a etapa de PCR não seja realizada neste protocolo,
estudos anteriores sugerem que a maioria das leveduras que crescem no meio SC
URA- são positivas para o cassete de interesse, com uma eficiência estimada em
cerca de 80%. Isso indica que a presença do inserto pode ser inferida com alto grau
de confiança, eliminando a necessidade de testes adicionais.

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 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4. 1. Transformação, clonagem e recombinação em Saccharomyces

cerevisiae:

Após a realização do experimento pode ser observado que não houve

crescimento de colônias na placa de controle negativo, indicando que as células não
foram capazes de crescer no meio seletivo SC URA- na ausência do plasmídeo
contendo o gene de interesse. Isso confirma a necessidade do gene URA3 funcional
presente no plasmídeo para o crescimento das células em meio seletivo SC URA-.
Da mesma forma, foi observado o crescimento de colônias no controle positivo,
indicando a viabilidade e competência das células de Saccharomyces cerevisiae
para crescer em meio seletivo SC URA- o que confirma que as células foram
capazes de se desenvolver nas condições experimentais utilizadas.

Figura 01. Placas inoculadas com S. cerevisiae transformadas para a produção de cassetes de
DNA contendo genes de interesse.

Fonte: Modificado pelo autor (Malavazi, 2024.)

No controle da digestão do vetor com as enzimas EcoRI/BamHI não houve

crescimento de colônias, sugerindo que a digestão do vetor com as enzimas

11
EcoRI/BamHI foi eficiente, ou seja, a ausência de crescimento confirma que não
houve contaminação do plasmídeo não digerido nas reações de transformação.
Após a transformação das células de Saccharomyces cerevisiae com o plasmídeo
linearizado contendo o cassete de interesse, observamos que as células cresceram
no meio seletivo SC URA- (“synthetic complete” sem uracila), indicando que foram
capazes de incorporar o plasmídeo e complementar a mutação no gene URA3.

A ausência de uracila no meio permite que o gene URA3 presente no

plasmídeo pRS426 permita o crescimento das células que incorporaram o
plasmídeo e que foi circularizado (recombinado) "in vivo". Esse resultado sugere
que o processo de transformação foi bem-sucedido e que as células recombinantes
foram geradas, como mostrado na figura 1 pelas placas.

4. 2. Abordagens para a produção de cassetes gênicos:

A partir da transformação de células de Saccharomyces cerevisiae e a

confirmação da expressão do gene URA3, é possível sugerir três abordagens
factíveis para a produção de casetes gênicas com diferentes aplicações.

Cassete de Expressão de Proteína Específica: contendo um promotor forte, o

gene de interesse para expressar uma proteína específica, e um marcador de
seleção, como o gene URA3. Esse cassete poderia ser utilizado para induzir a
expressão de uma proteína desejada em células de levedura sob condições
específicas. O gene URA3 serviria como marcador de seleção, permitindo o
crescimento das células em meio seletivo SC URA-. Isso seria útil, por exemplo, na
produção de proteínas recombinantes para aplicações industriais ou de pesquisa.

Cassete para Estudo de Regulação Gênica: contendo regiões regulatórias,

como promotor e regiões de controle, ligadas a um gene repórter, como o gene
URA3. Sendo útil para o estudo da regulação gênica em células de levedura. A
expressão do gene URA3 seria controlada pelas regiões regulatórias, permitindo a
análise da resposta das células a diferentes estímulos ou condições ambientais.
Isso poderia ser aplicado no estudo de vias de sinalização celular ou na
identificação de elementos regulatórios importantes.

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 Cassete para Engenharia Genômica: contendo sequências homólogas ao
genoma alvo, juntamente com o gene de interesse e um marcador de seleção, como
URA3. Podendo ser aplicado para a integração dirigida do gene de interesse no
genoma de células de levedura. As sequências homólogas facilitariam a
recombinação homóloga, permitindo a inserção específica do cassete no local
desejado do genoma. Isso seria aplicável em projetos de engenharia genômica para
melhorar características específicas das células de levedura, como aumentar a
produção de metabólitos desejados.

4. 3. Saccharomyces cerevisiae para a produção de cassetes gênicos:

A Saccharomyces cerevisiae, utilizada para a construção do experimento

discutido no presente relatório, e comumente usada em aulas de fermentação, seria
uma escolha viável como recipiente para a construção dos cassetes gênicos
descritos anteriormente. A levedura apresenta diversas características que a tornam
uma escolha altamente apropriada para a construção de cassetes gênicos. Em
destaque a sua notável facilidade de manipulação genética, disponibilidade de uma
ampla variedade de ferramentas moleculares que, facilitam significativamente a
modificação genética dessa levedura, incluindo técnicas eficientes de
transformação.

Para além disso, a eficiência na expressão gênica da S. cerevisiae é um fator

determinante. A capacidade desta levedura em expressar genes exógenos de
maneira eficaz permite a implementação bem-sucedida de cassetes gênicos,
conforme descrito anteriormente. Isso abre possibilidades para alcançar diversos
objetivos, desde a produção de proteínas recombinantes até o estudo detalhado da
regulação gênica. Se destacando também, por sua segurança comprovada em
laboratórios e em várias aplicações industriais. Com um longo histórico de uso
seguro na produção de alimentos e bebidas, essa levedura se torna uma candidata
interessante para uma ampla gama de aplicações.

A adaptabilidade ao meio de cultivo é mais uma vantagem crucial, tendo a

capacidade de crescer em diferentes meios, incluindo os sintéticos como o SC URA-
mencionado anteriormente, simplificando a seleção e o crescimento das células
transformadas em meios seletivos específicos. Dessa forma, esse organismo se

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coloca como uma excelente opção para a construção de cassetes gênicos,
proporcionando facilidade de manipulação genética, eficiência na expressão gênica
e adequação para diversas aplicações.

4. 4. Vetor e cassete de Cyp51A fusionada a mRFp em célula de

mamífero:

Para expressar esta construção em uma célula de mamífero, várias

modificações precisariam ser feitas no esqueleto do vetor e na construção do
cassete gênico. Algumas considerações importantes são:

Alterações no Vetor:
1. Marca de Seleção: a marca de seleção de droga pode ser diferente, já
que a maioria dos marcadores de seleção para células de mamífero
difere daqueles usados em microrganismos como fungos. Um exemplo
comum é o gene de resistência a neomicina/kanamicina (Neor/Kanr).
Esse gene codifica uma enzima que confere resistência a esses
antibióticos.

2. Promotor: deve ser substituído por um promotor adequado para

células de mamíferos. Promotores CMV (Cytomegalovirus), SV40
(Simian Virus 40), e EF1α (Elongation Factor 1 alpha) são promotores
fortes frequentemente utilizados em expressão gênica em células de
mamíferos.
3. Terminador: o terminador gênico também deve ser substituído por um
terminador adequado para células de mamíferos. O terminador de
poliadenilação bovina (bGH polyA) é uma escolha comum nesse
contexto.

Cassete Gênico:
1. Gene de Interesse: o gene Cyp51A fusionado a mRFP deve
permanecer no cassete gênico.
2. Promotor: o promotor original do fungo deve ser substituído pelo
promotor apropriado para células de mamíferos, como CMV, SV40, ou
EF1α.

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 3. Terminador: o original deve ser substituído por um terminador
apropriado para células de mamífero, como bGH polyA.

Mapa do Novo Vetor:

----Promotor CMV----Gene Cyp51A-mRFP----Terminador bGH polyA----Marcador

Neor/Kanr----

Sendo o CMV um promotor forte e amplamente utilizado em vetores para

expressão em células de mamíferos iniciando a transcrição do gene de interesse. O
Gene Cyp51A-mRFP, mantém-se o gene de interesse, mas agora adaptado para
ser expresso em células de mamíferos. O Terminador bGH polyA atua como um
sinal de terminação de transcrição, essencial para a correta expressão do gene em
células de mamíferos. E o Marcador Neor/Kanr confere resistência a
neomicina/kanamicina adequando a seleção de células de mamíferos transfectadas.
Essas modificações garantem a expressão eficiente do gene Cyp51A fusionado a
mRFP em células de mamífero, utilizando elementos regulatórios compatíveis com o
ambiente celular hospedeiro.

4. 5. Técnica de Gibson Assembly (New England Biolabs):

A técnica de Gibson Assembly, desenvolvida pela New England Biolabs, é

uma abordagem eficiente para a montagem de DNA que permite a concatenação de
fragmentos sobrepostos, facilitando a construção de sequências genéticas mais
extensas. O processo se baseia em enzimas específicas, incluindo exonuclease 3',
DNA polimerase de alta fidelidade e ligase DNA, para realizar as etapas de
preparação e ligação dos fragmentos.

No fundamento da Gibson Assembly, os fragmentos de DNA a serem

montados devem possuir sequências de sobreposição complementares nas
extremidades, geralmente com 20-40 nucleotídeos. A reação ocorre em um único
tubo, reunindo todos os componentes necessários, como os fragmentos de DNA, e
as enzimas envolvidas. A exonuclease 3' remove nucleotídeos das extremidades 5'
dos fragmentos, criando sobreposições de 3', enquanto a DNA polimerase preenche
essas lacunas. A ligase DNA, por sua vez, sela as extremidades sobrepostas,
finalizando a montagem.

15
 Em comparação com a estratégia utilizada em aula, a Gibson Assembly
destaca-se pela eficiência na montagem de fragmentos maiores e pela capacidade
de conduzir a reação em um único passo, simplificando o processo. Contudo,
ambas as estratégias compartilham conceitos fundamentais. Elas dependem do uso
de enzimas específicas para realizar as reações de ligação e replicação do DNA.
Além disso, ambas requerem que os fragmentos de DNA tenham sequências de
sobreposição para permitir a montagem eficiente. A escolha entre as estratégias
dependerá das necessidades específicas do experimento e das preferências do
pesquisador. Em suma, tanto a técnica de Gibson Assembly quanto outras
estratégias tradicionais compartilham o objetivo comum de facilitar a montagem in
vitro de sequências genéticas.

16
 4. CONCLUSÃO

A análise dos resultados do experimento revelou que a transformação das

células de Saccharomyces cerevisiae com o plasmídeo contendo o gene de
interesse foi bem-sucedida. O crescimento observado nas placas de controle
positivo atestou a capacidade das células de crescer em meio seletivo SC URA-,
confirmando sua viabilidade e competência nas condições experimentais.

Por outro lado, a ausência de crescimento nas placas de controle negativo

evidenciou a necessidade do gene URA3 funcional presente no plasmídeo para o
crescimento das células em meio seletivo SC URA-. Além disso, o controle da
digestão do vetor com as enzimas EcoRI/BamHI validou a eficácia dessa etapa,
uma vez que não houve crescimento de colônias, sugerindo a ausência de
contaminação do plasmídeo não digerido nas reações de transformação.

A análise das colônias amplificadas permitiu identificar aquelas aptas para

inoculação em meio de cultura LB e extração subsequente do DNA plasmidial.

Com base nesses resultados, foram sugeridas três abordagens para a

produção de cassetes gênicos com diferentes aplicações: expressão de proteína
específica, estudo de regulação gênica e engenharia genômica. A escolha da
Saccharomyces cerevisiae como organismo hospedeiro para a construção dos
cassetes gênicos foi respaldada por suas características favoráveis, como facilidade
de manipulação genética, eficiência na expressão gênica e segurança comprovada
em diversas aplicações.

Por fim, ressaltou-se que, para expressar a construção em uma célula de

mamífero, seriam necessárias diversas modificações no vetor e na construção do
cassete gênico, incluindo alterações na marca de seleção, promotor e terminador.
Essas modificações seriam cruciais para garantir a expressão eficiente do gene de
interesse em células de mamíferos, utilizando elementos regulatórios compatíveis
com o ambiente celular hospedeiro.

Essa abordagem pode ser amplamente aplicada em estudos de biologia

sintética e manipulação genética de microrganismos para diversos fins
biotecnológicos.

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 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. SOUSA, T. M. M. DE. Produção de proteínas de interesse terapêutico em

células de mamíferos em cultura. [s.l.] Universidade de Brasília, 2006.

2. BARROS, T. B. Expressão e caracterização da glicoproteína D do HSV-1

geneticamente fusionada às oncoproteínas E6 e E7 do HPV-16 e HPV-18
(gDE7E6) em células de mamíferos. 2019. Dissertação (Mestrado) - Universidade
de São Paulo, [S. l.], 2019.

3. POSTMA. Eline D. DASHKO, Sofia, et al. A supernumerary designer

chromosome for modular in vivo pathway assembly in Saccharomyces
cerevisiae. Disponível em: A supernumerary designer chromosome for modular in
vivo pathway assembly in Saccharomyces cerevisiae - PMC (nih.gov). Acesso em:
07 fev.2024.

4. Saccharomyces cerevisiae: características, morfologia, ciclo de vida.

Disponível em: Saccharomyces cerevisiae: características, morfologia, ciclo de vida
- Maestrovirtuale.com. Acesso em: 07 fev. 2024

5. Saccharomyces cerevisiae - O modelo. Disponível em: Saccharomyces

cerevisiae - O Modelo - Departamento de Microbiologia (usp.br). Acesso em: 07 fev. 2024.

6. Construções da cassete de eliminação do gene FLR1. Disponível em:

https://web.tecnico.ulisboa.pt/ana.freitas/bioinformatics.ath.cx/bioinformatics.ath.cx/i
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7. MANUCCI, Antonio .Construções de casetes de deleção e/ou substiruição

gênica utilizando estratégias baseadas em PCR e recombinação in vivo no
organismo modelo Saccharomyces cerevisiae. Disponível em:
https://pt.scribd.com/document/74130803/Relatorio-Contrucao-de-Cassetes-de-Dele
cao. Acesso em: 7 fev. 2024.

18
8. Auxotroph: origem, exemplo e aplicações. Disponível em:
https://maestrovirtuale.com/auxotroph-origem-exemplo-e-aplicacoes/. Acesso em:
07. fev. 2024.

19