Licenciatura em Engenharia Química e Biológica

Cinética de Crescimento de Saccharomyces cerevisiae

Laboratórios de Bioprocessos
Ano letivo 2022/2023

Grupo 3
Ana Catarina Torres - a95765
Bárbara Martins - a97723
Joana Lopes – a95391
Raquel Laranjo – a97296

Docente:
Ângela França
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Sumário

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Índice

Sumário..................................................................................................................................................................2
Índice......................................................................................................................................................................4
Introdução:............................................................................................................................................................5
Materiais e Métodos:.............................................................................................................................................9
Resultados e Discussão de Resultados:..............................................................................................................12
Conclusão:............................................................................................................................................................20
Bibliografia:.........................................................................................................................................................21
Anexos:.................................................................................................................................................................22

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Introdução:
Este trabalho experimental teve como objetivo determinar as curvas de crescimento, de consumo de
substrato e registar a variação do pH do meio, de uma cultura de Saccharomyces cerevisiae, operando em modo
descontínuo, utilizando meios de cultura com diferentes concentrações de glucose. Além disso, pretendeu-se
também determinar os parâmetros cinéticos de crescimento de Saccharomyces cerevisiae (µmax, td e ks), os
rendimentos em biomassa e em etanol e a produtividade em etanol. Posteriormente, foi calculada a taxa de
consumo de oxigénio (TCO) e o coeficiente de transferência de oxigénio (kLa) pelo método dinâmico.
A Saccharomyces cerevisiae é uma espécie de levedura unicelular eucariótica, pertencente ao reino dos
fungos. É uma das espécies mais utilizadas na indústria de alimentos e bebidas devido à sua capacidade de
fermentar açúcares para produzir álcool e dióxido de carbono, processo conhecido como fermentação alcoólica.
Além disso, é usada como um modelo de organismo para estudos de genética, biologia molecular e bioquímica,
devido à sua facilidade de cultivo e manipulação em laboratório. Entre as leveduras mais utilizadas na
fermentação alcoólica, Saccharomyces cerevisiae merece destaque principalmente pelo seu vasto uso em
diversos processos dentre os quais panificação, cervejaria, destilaria, entre outros e seu uso foi possível desde
então, devido à sua capacidade de converter rapidamente açúcares em etanol, ácidos orgânicos e gás carbônico
[1].
A levedura alcoólica, Saccharomyces cerevisiae, é um fungo unicelular, heterotrófico e
quimiorganotrófico. Esta levedura é anaeróbia facultativa, isto é, cresce tanto em meios aeróbios como em
anaeróbios. Apresenta metabolismo respiratório e/ou fermentativo em aerobiose e fermentativo em anaerobiose
[2]. O catabolismo da glicose pela Saccharomyces cerevisiae, com o objetivo de produzir ATP, pode se dar pela
via aeróbia ou anaeróbia [3].

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Figura 1. Diagrama do catabolismo da glicose em células de S.cerevisiae.

As equações químicas simplificadas do catabolismo da glicose, pelas vias aeróbia (respiratória) e

anaeróbia (fermentativa), encontram-se a seguir:

C6H12O6 + 6 O2 → 6 CO2 + 6 H2O (I) (respiração)

C6H12O6 → 2 HO-CH2CH3 + 2 CO2 (II) (fermentação)

O crescimento microbiano é o aumento no número de células microbianas num ambiente adequado para
a sua reprodução e sobrevivência. Esse processo envolve a duplicação das células microbianas através de
divisão celular, resultando num aumento exponencial do número de células. O crescimento microbiano está
diretamente associado ao crescimento de uma população de células. Durante este crescimento, as células
microbianas consomem nutrientes do ambiente e utilizam esses nutrientes para produzir energia e biomassa. À
medida que o número de células aumenta, a necessidade por nutrientes e espaço também aumenta. O estudo do
crescimento microbiano é importante em vários campis, uma vez que as condições de crescimento das células
podem afetar a produção de produtos microbiológicos, como alimentos, medicamentos e biocombustíveis.
Além disso, o controlo do crescimento microbiano é crucial na prevenção de doenças infeciosas causadas por
bactérias, fungos e outros organismos. Portanto, o conhecimento da cinética de um processo ou cinética de
crescimento microbiano é importante industrialmente, pois permite a análise dos pontos críticos do processo,
previsão de eventos fora do processo, determinação de vida de prateleira e análise de risco [4].

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As células microbianas que estão a crescer numa cultura descontínua, normalmente passam por quatro
etapas bem definidas: a fase de latência ou lag (fase inicial de inatividade), a fase exponencial (fase de
crescimento rápido e progressivo), a fase estacionária (fase em que o crescimento abranda e se torna mais
estável) e a fase de morte ou declínio (final em que o número de células diminui).

Figura 2. Fases de crescimento microbiano em cultura descontínua ao longo do tempo de

incubação, t (X – concentração celular viável; N – número de células viáveis).

A fase de latência ou lag é a fase inicial de crescimento em que as células ajustam o seu metabolismo ao
novo ambiente de cultivo, produzindo grandes moléculas, como os componentes dos ribossomas necessários
para a síntese de proteínas e enzimas necessárias durante a divisão celular. As células também aumentam em
tamanho e começam a se dividir. A duração dessa fase depende das condições do microrganismo e da natureza
do meio em que se encontram [5]. Esta fase pode durar cerca de 3h para células de S. cerevisiae a crescer em
meio YEPD (Yeast Extract Peptone Dextrose) a 30 ºC.
Após a fase lag, passamos para a fase exponencial, onde as células estão totalmente adaptadas ao
ambiente, absorvendo os nutrientes e produzindo seus constituintes, tornando-se mais suscetíveis às alterações
do ambiente ao seu redor. A fase exponencial é aquela em que as bactérias se reproduzem a uma taxa máxima e
constante, com um tempo de geração também constante. A velocidade de multiplicação de uma bactéria
específica depende das condições ideais para cada organismo, como fatores nutricionais, pH, temperatura e
composição do meio [5]. Nesta fase, a taxa de crescimento está diretamente relacionada com a concentração de
células (X) em cada momento, sendo que a constante de proporcionalidade é igual à taxa específica máxima de
crescimento (µ):

ⅆX
=μX (1)
ⅆt

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Integrando esta equação, obtém-se a equação do tipo exponencial que descreve a variação da
concentração de células com o tempo:

μt
X =X 0 e ( 2)

X0 é a concentração de células no tempo inicial.

O tempo de duplicação necessário para uma cultura duplicar depende de vários fatores, como o
arejamento e a composição do meio de cultivo (por exemplo, o tempo de duplicação para o crescimento de S.
cerevisae em meio mínimo é o dobro do valor observado em meio YEPD). A partir desta equação define-se o
tempo de duplicação celular (td) como:

ln 2
t d= (3)
μ

Quando se altera a concentração de substrato (S) no meio de cultura, mantendo-se a concentração dos
outros componentes, a taxa específica de crescimento geralmente varia de forma hiperbólica, seguindo a
equação de Monod:

μ max S
μ= (4)
K s+ S

onde ks é o valor da concentração de reagente limitante para a qual a taxa específica de crescimento é
igual a metade do seu valor máximo.

Conforme os nutrientes no meio de cultura são esgotados e produtos inibitórios de crescimento se

acumulam, a taxa de crescimento diminui gradualmente até parar, e a cultura entra na fase estacionária de
crescimento. A fase estacionária é a fase em que o crescimento populacional bacteriano se estabiliza, não
havendo mais aumento no número de células. Nesta fase, a quantidade de células que morrem é igual à
quantidade de células resultantes da multiplicação, o que leva à manutenção do tamanho da população
bacteriana. A falta de um composto ou elemento essencial ao metabolismo bacteriano é uma das principais
razões para a fase estacionária, pois limita a capacidade de reprodução das células e pode levar à morte de
algumas delas [5]. Nesta fase, existem células ainda a dividir-se e a crescer enquanto outras já estão em fase de
morte.
A fase de morte ou declínio é quando o número total de células viáveis diminui, aumentando o número
de células que morrem, e eventualmente ocorre a lise celular [5].

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O aumento e desenvolvimento de produtos por microrganismos são processos de bioconversão nos quais
os nutrientes químicos adicionados à fermentação são transformados em massa celular e metabólitos. Cada uma
dessas transformações pode ser medida por um coeficiente de eficiência, indicando a quantidade de biomassa
Y
ou produto formado por unidade de substrato consumido, denominado ( XS ) e Y ( P ), para células e produtos,
S

respetivamente.
∆X
Y = (5)
( )
X
S
∆S

Y P ∆P
( )=¿= (6)¿
S ∆S

Também é possível quantificar a produtividade de um processo em relação à produção de um produto

específico, utilizando a seguinte equação:

ΔP
Produtividade= (7)
Δt

Existem diversos métodos para determinar o número de células e/ou a concentração de biomassa ao
longo do tempo como a determinação por contagem de células. A câmara de Neubauer, inicialmente
desenvolvida para contagem de glóbulos vermelhos, é frequentemente usada em microbiologia para determinar
a concentração de células microbianas. Ela possui nove retículos, sendo oito laterais e um central interno
(Figura 3), com os retículos laterais dos extremos divididos em dezasseis quadrados pequenos de 0,25 mm de
lado. O retículo central interno é dividido em 25 quadrados menores de 0,2 mm de lado, que por sua vez são
subdivididos em 16 quadrados ainda menores de 0,05 mm de lado. Como a altura da câmara é de 0,1 mm, o
volume de cada quadrado é de 0,25x10-3 mm3.

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Figura 3. Câmara de Neubauer.

Introduz-se a suspensão de células a contar, com o auxílio da câmara, numa cavidade entre a lâmina e a
lamela. Posteriormente, com o auxílio do microscópio, foi possível estimar o número de células de forma
rápida.
A observação direta sob um microscópio possibilita uma avaliação rápida e simples do número total de
células presentes numa população microbiana.

Outro método utilizado foi pela determinação por peso seco. Para estudar o crescimento de leveduras e
bactérias em ambientes industriais ou laboratoriais, é necessário utilizar métodos rápidos de avaliação
quantitativa das populações microbianas. Um dos métodos mais comuns é a turbidimetria, que se baseia na Lei
de Lambert-Beer. Segundo esta lei, quando um feixe de luz atravessa uma suspensão de microrganismos, a
quantidade de luz que é absorvida é diretamente proporcional à concentração de células presentes na suspensão,
desde que esteja dentro de limites específicos. A lei é expressa da seguinte forma:

A= kC (8)

Na equação apresentada, onde A representa a absorvência da suspensão e C a sua concentração celular,

a relação entre ambas é linear e depende de uma constante k. Contudo, essa linearidade só é válida para valores
de absorvência inferiores a aproximadamente 0,70. Nesses casos, os fenômenos de reflexão e dispersão da luz
pela suspensão são pouco relevantes e a quantidade de luz que atinge o detetor é afetada apenas pela absorção
da luz incidente pela suspensão celular. Neste método, as células microbianas e as suas membranas são pesadas
para determinar o peso seco das células presentes num determinado volume de cultura. As células são filtradas
ou centrifugadas, lavadas e secas numa estufa a uma temperatura de 80°C, até que o peso se torne constante.
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Esse processo é bastante demorado e é usado em circunstâncias específicas, como por exemplo, quando se
pretende obter o rendimento em biomassa do crescimento.
Um dos objetivos deste trabalho prático foi construir as curvas que mostram a variação da concentração
de substrato e produtos ao longo do tempo de incubação, calculando os rendimentos em biomassa e produto,
assim como a produtividade em etanol. Para obter as concentrações de substrato e produto, foram usados dois
métodos na atividade laboratorial, sendo o método DNS e o método HPLC.
No que toca ao método DNS, este é utilizado para medir a quantidade de açúcares com poder redutor e
funciona por meio da redução do ácido 3,5-dinitrossalicílico (DNS) a ácido 3-amino-5-nitrossalicílico em
solução alcalina. Nesse processo, os grupos carbonilo dos açúcares são oxidados a carboxilo. O sal de La
Rochelle é adicionado à solução para proteger o reagente da ação do oxigênio dissolvido. Entretanto, há
indícios de que reações secundárias podem ocorrer durante o teste, envolvendo a decomposição do açúcar em
solução alcalina, o que pode competir com a redução do DNS pelo açúcar. No método DNS ocorre a reação de
redução representada na Figura 4.

Figura 4. Reação de redução do DNS.

Em relação ao método HPLC, a cromatografia líquida de elevada eficiência, HPLC –High Performance
Liquid Chromatography–, é um processo de separação que consiste na separação dos componentes da amostra
através de uma coluna preenchida com um adsorvente líquido (fase estacionária), que é revestido num suporte
sólido inerte e dividido em pequenas partículas. A amostra é transportada por um líquido eluente (fase móvel) e

durante a passagem pela coluna, os componentes são separados de acordo com suas propriedades físico-
químicas, como solubilidade, tamanho, carga, afinidade e polaridade, o que faz com que migrem em
velocidades diferentes.
Geralmente, um sistema de HPLC é composto pelos seguintes módulos: reservatórios de fase móvel,
bomba cromatográfica, sistema de injeção da amostra, coluna cromatográfica, forno termostático,
desgaseificador e detetor [6]. A Figura 5 ilustra um sistema de HPLC com deteção UV/Vis, sistemas
geralmente encontrados comercialmente [6]. Enquanto, a Figura 6 ilustra um diagrama de blocos de um
cromatógrafo líquido.
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Figura 5. Sistema típico de um Cromatógrafo a Líquido de Alta Eficiência (HPLC).

Figura 6. Diagrama de blocos de um cromatógrafo líquido.

A fase móvel (eluente) é retirada do depósito através de uma bomba e percorre todo o sistema a uma pressão
relativamente alta. A bomba possui medidores de pressão e fluxo e um mecanismo de segurança para evitar a pressão
excessiva. Geralmente, é colocado um filtro antes da bomba para evitar a entrada de pequenas partículas no sistema. A
amostra é inserida no sistema de injeção por meio de uma seringa e levada pelo líquido eluente através da coluna
cromatográfica, que contém a fase estacionária. A coluna é normalmente posicionada após uma pré-coluna, que serve

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como filtro para as amostras injetadas. Em muitos casos, as separações ocorrem em temperaturas superiores à ambiente, o
que requer o uso de um forno para aquecer a coluna.

No que diz respeito à determinação de k La em meio de cultura, na produção de biomassa em fermentações

aeróbias, a quantidade de oxigénio fornecida aos microrganismos é um fator extremamente importante. Além das
necessidades dos microrganismos, outros fatores igualmente importantes incluem o grau de dissolução do oxigénio no
meio líquido e a transferência de oxigénio pela camada líquida até às células. Quanto menor o tamanho das bolhas de gás,
menor a camada líquida retida na superfície das bolhas e maior a velocidade com que são projetadas, mais favorecido será
o último fator. Já o segundo fator depende da diferença de concentrações entre a saturação e o meio de cultura. Essas
influências podem ser expressas na equação a seguir, que é ilustrada no gráfico da Figura 7:

∂ CL μX
=k L a ( C L−C L )−
¿
(9)
∂t Y O2

O aumento da agitação beneficia a primeira parte desta taxa, uma vez que aumenta o coeficiente de transferência
de massa (kL) e a área interfacial (a ). Contudo, a formação de espuma resultante exige o uso de antiespumantes, os quais
possuem um efeito contrário. Portanto, é necessário adotar uma situação de equilíbrio entre esses fatores.

Figura 7. Evolução da concentração de O2 dissolvido (CL) ao longo do tempo (t).

Existem diversos elementos que influenciam o valor do k La, sendo os principais: o nível de agitação, a quantidade
de oxigénio fornecida, as propriedades físicas do meio utilizado na fermentação e a utilização de substâncias
antiespumantes.

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[1] - LOPES, A. C. A.; PINTO, I. de O.; SOUZA, C. M. de; CANGUSSU, A. S. R.; OLIVEIRA, M. E.
S. de. Cinética de crescimento de levedura em mosto de cagaita para produção de bebida fermentada. Revista
Verde de Agroecologia e Desenvolvimento Sustentável, [S. l.], v. 10, n. 3, p. 06–10, 2015.

[2] - Venturini Filho, W. G., Figueira, R., Sartori, M. M. P., Auer, S., & Andrade, T. L. L.;
Quantificação do metabolismo aeróbio e anaeróbio de levedura alcoólica sob diferentes condições; B.CEPPA,
Curitiba, v. 35, n. 2, p.1, jul./dez, 2017.

[3] - Rettori, D., & Volpe, P. L. O.; Eletroquímica na análise de fármacos e alimentos; Química Nova,
23(2), p.258, 2002.

[4] - Homem, C. L. G.; Costa, J. R. C.; Pinheiro, I. R.; Estudo da Fermentação Alcoólica do Hidrolisado
de Bagaço de Laranja por Saccharomyces cerevisia, In: . São Paulo: Blucher, p. 2, 2017.

[5] - Nicolau, Paula Bacelar; Microrganismos e crescimento microbiano; Material didático para
utilização em cursos de área da microbiologia; p. 12-13; Fev-2014.

[6] – Silva, Lilian da;, Desenvolvimento de método (HPLC-ICP-MS) para os estudos de certificação de
selenometionina em material de referência de levedura (Saccharomyces cerevisiae); Duque de Caxias; p.42;
2015.

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Materiais e Métodos:

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Resultados e Discussão de Resultados:

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Conclusão:

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Bibliografia:

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Anexos:
ANEXO A – CURVA DE CALIBRAÇÃO

ANEXO B – CÁLCULO DA

ANEXO C – DETERMINAÇÃO

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