Resumo Biotecnologia Industrial II: P2

Estudo Cinético de um dado fenômeno ou processo é o estudo da evolução no

tempo deste processo através da quantificação de certas grandezas que definam
adequadamente esta evolução.
Estudo Cinético de um processo fermentativo e microbiano é o estudo das
alterações que ocorrem neste processo, ao longo do tempo, efetuando-se a
medida das seguintes grandezas:
X, S e P são variáveis de estado. Os parâmetros são para processos
descontínuos.
X → concentração de microrganismo, celular ou biomassa (células)
[quanto de célula/volume]
S → concentração de substrato limitante [na maior parte das vezes é a
fonte de carbono: carboidrato, proteína, etc]
P → concentração de produto de interesse (produto do metabolismo)
[metabolito ou produto do metabolismo]

A análise cinética é fundamental para:

• Calcular a velocidade das transformações devido à ação dos
microrganismos;
• Estudar a influência de fatores nestas velocidades;
• Correlacionar velocidades e fatores por meio de equações ajustadas;
• Aplicar equações cinéticas e modelos em otimização do controle do
processo; projeto de biorreatores, etc.
Não tem como fazer a otimização de um processo sem avaliar a cinética do
processo.

➢ X: Medida da Concentração Celular

Essa medida representa o crescimento microbiano que representa o aumento do
material celular em termos de massa ou número de células, ou seja, representa
a duplicação celular: uma célula dando origem a duas células por mitose
[divisão celular simples].
Inúmeros fatores podem interferir na geração ser rápida ou lenta. Depende de
inúmeros fatores como: Transporte de nutrientes para a superfície da célula,
parâmetros como pH e temperatura.
A determinação celular pode ser por:
1. Métodos Diretos
• Contagem ao microscópio (Câmera de Neubauer);
A1 = 1X1 = 1 mm²
Profundidade = 0,1 mm
Volume = 0,1 mm³
Com esses dados consegue-se calcular a concentração contando os
quadradinhos.

As limitações que são: um método demorado, exige habilidade e não se aplica a

microrganismos filamentosos.
• Contagens em placas;
Isolamento de cultura pura, diluições sucessivas e conta-se quantas colônias
foram formadas.
É um método demorado;
Esse método e o primeiro são métodos ótimos, pois mostram as células vivas.
Muito útil para contagem, mas não para cinética.
 • Contagem eletrônica.

2. Métodos Indiretos
• Massa Seca (Biomassa);
Determinado por filtração (á vácuo) de uma amostra de produto conhecido
através de uma membrana para que os microorganismos não passem. As
membranas são produzidas por polímeros.
Muito utilizada;
• Turbidez – Densidade óptica (600 nm);
Uma amostra com suspensão de microorganismos, a lâmpada do equipamento
emite um comprimento de onda [aproximadamente 600 nm] que vibra num único
plano. Assim as bactérias vão causar uma dispersão e através de uma foto
célula/detector você mede essa dispersão.
Quanta mais células você tiver menor vai ser a quantidade de luz emitida, fica
mais opaca. A leitura pode ser feita em tempo real;
A turbidez é o único método que se retorna o microorganismos;
• Constituintes celulares (ATP, DNA, NADH);
• Volume celular por centrifugação;
• Dosagem de elementos do meio de cultura (substrato, consumo de
O2, propriedades reológicas do meio de cultura, entre outros.
Massa Seca e Turbidez são as grandezas mais importantes;

➢ S: Substrato Limitante

O microorganismo precisa de Meio de Cultura [Associação de componentes

qualitativos e quantitativos]. Mas um componente é diretamente ligado com a
produção de energia (ATP) que é útil para o crescimento celular e esse é o
substrato limitante e a maior parte das vezes é uma fonte de carbono (utilizado
para microorganismo heterotróficos) e essa fonte de carbono o mais utilizado é
o carboidrato [exemplo: glicose].
• Para escolher o substrato limitante vamos analisar:
• Influência diretamente na taxa de crescimento
• Sua escassez / término – limita o crescimento celular
• Normalmente é a principal fonte de carbono – energia (ATP)
• Carboidratos – glicose (universal)
• Aminoácidos / ácidos graxos / glicerol/ outros
• Normalmente as fermentações são dimensionadas para ao final do
processo sua concentração ser próxima a zero, ou seja, quanto mais
consumir maior o rendimento [rendimento bom]
 ➢ P: Produtos – Metabólitos

Podem ser classificados em:

Metabólico Primário: substância produto direto do metabolismo e vital da
célula, geralmente ligado ao crescimento e/ou reprodução da célula. Ex: etanol,
ácido acético.
Entra na célula glicose, ela vai gerar 2ATPs + Piruvatos e vira o Etanol. O Etanol
não é importante para a célula, ele é um produto primário, produção direta e
diretamente relacionada a célula.

Metabólico Secundário: Substâncias não vitais para a sobrevivência da célula,

geralmente produzida em situação de estresse da célula (carência de nutrientes)
e ligada à defesa celular. Ex: penicilina entre outros antibióticos.
Ocorre o consumo do açúcar curva azul e o crescimento celular e a produção do
produto só se dá inicio quando se tem uma boa quantidade de célula. Não está
diretamente ligada ao crescimento celular, pois houve todo o crescimento, mas
não havia produto, somente quando teve a diminuição do crescimento que se
formou o produto.
Velocidade é definida como uma taxa em função do tempo em relação as
grandezas (X, S e P)

O rx não representa o sistema. Por conta disso têm-se que calcular a velocidade
específica que é a velocidade instantânea dividida pelo crescimento celular X.
rx = dX/dt. Como X [g/L] então rx [g/L.h], assim μ [h-1]. A Velocidade específica
não tem a ver com a ordem da reação, sempre será tempo-1.

Curvas Típicas dos Processos Descontínuos

PONTO 1: Fase LAG ou LATÊNCIA é onde não tem crescimento celular.

X = cte e dX/dt = 0
Fase 1 → Fase lag ou de latência: período onde ocorre uma adaptação celular
em que a célula sintetiza as enzimas necessárias ao metabolismo dos
componentes presentes no meio. Nessa fase não ocorre reprodução celular, X
= constante = X0 e velocidade dX/dt = 0;
PONTO 2 Fase INICIAL, ACELERAÇÃO ou TRANSIÇÃO obtém algum
crescimento.
dX/dt > 0
Fase 2 → Fase de transição: têm-se início a reprodução microbiana e ocorre um
aumento gradual na velocidade de reprodução;
PONTO 3: Fase EXPONENCIAL onde se tem máxima capacidade de
crescimento das células, crescimento exponencial.
dX/dt = máximo, ou seja, tem o maior consumo de substrato
Fase 3 → Fase exponencial: a velocidade de reprodução nessa fase é constante
e é igual a máxima, dX/dt = constante = máxima, é o período mais importante na
reprodução microbiana;
PONTO 4: Fase DESACELERAÇÃO ou REDUTORA se obtém um decréscimo
da velocidade de crescimento.
dx/dt < máximo
Fase 4 → Fase redutora: esgotam-se um ou mais componentes que formam o
meio de cultura, portanto a velocidade de reprodução diminui;
PONTO 5: Fase ESTACIONÁRIA
X = cte e dx/dt = 0
Fase 5 → Fase estacionária: a velocidade de reprodução se iguala a velocidade
da morte celular, mantendo a concentração de microorganismos constante, X =
constante = Xf (máximo);
PONTO 6: Fase DECLÍNIO
X decrescente dx/dt < 0.
Fase 6 → Fase de declínio: período no qual a taxa de mortalidade é maior que
a de crescimento. dX/dt < 0.

Velocidade Específica
Curva  = f(t) permite a identificação dos diferentes estados fisiológicos em que
a célula se encontra durante o crescimento.
PONTO 1: Fase LAG:  = 0 (dX/dt = 0)
PONTO 2: Fase ACELERAÇÃO: 0 <  <  máx
PONTO 3: Fase EXPONENCIAL:  =  máx = cte
PONTO 4: Fase REDUTORA:  máx <  < 0
PONTO 5: Fase ESTACIONÁRIA:  = 0 (dX/dt = 0)

Identificação das fases de crescimento celular

Em um gráfico de Tempo versus X, nesse gráfico você consegue analisar as

fases Lag e Estacionária (onde o X é constante). E com isso, na fase
exponencial, você calcula.
Na fase exponencial, a velocidade específica de crescimento celular é máxima
e constante (μ = μMÁX = constante).

Com os pontos que conseguirmos obter a melhor reta, temos os pontos que
determinamos a fase exponencial. Ao perceber quais são as fases Lag e
Estacionária, nós não testamos, ou seja, não colocamos no gráfico para obter a
equação acima. Ao fazer o gráfico, percebe-se que alguns pontos também
estarão fora da reta e eles são eliminados (eles também fazem alteração de
concavidade, concavidade indo para baixo [situação redutora] ou para cima).
O R² desejável sempre vai ser 0,99 mais do que dois noves decimais significa
que eliminamos muitos pontos e não se pode fazer isso.
E tirando esses pontos, você consegue achar as demais fases: aceleração e
redutora. Nem sempre você verá todas as seis fases, precisa-se observar.

➢ Tempo de Geração

No menor tempo possível nós temos uma célula se dividindo em duas.

Exemplos:
Levedura em aerobiose a velocidade específica é 4 vezes maior do que em
anaerobiose.
Bactérias tem velocidade específica muito baixas
DIAUXIA: o fenômeno é caracterizado por dois ciclos de crescimento e, portanto,
duas fases exponenciais;
Cada ciclo corresponde ao uso de um dos substratos, e remente à formação de
enzimas específicas para o consumo de cada um dos substratos.
Normalmente a célula esgota o primeiro substrato, se adapta novamente e inicia-
se o consumo do outro substrato.

➢ Produtividade em Células (PX)

Pode ser referida como global ou parcial de acordo com o tempo de fermentação
definido (tempo total – produtividade global)
 ➢ Fator de Conversão (Y)

São os coeficientes metabólicos – rendimento

Fator de conversão não é constante, ele muda de acordo com a fase. A figura
acima demonstra o fator de conversão global.

Por analogia, YP/S é a mesma coisa. Sua unidade é [g célula/g substrato].

O teórico, quando o gráfico passa por zero. Mas não é verdade, pois o
crescimento não começa por zero.
Esse mS é o coeficiente de manutenção celular. Energia para manutenção das
atividades do microrganismo não relacionadas à reprodução celular – energia
para manutenção (mS)
O fator de conversão global YX/S leva em conta o consumo total do substrato

0
SOMENTE PARA
CRESCIMENTO CELULAR

ΔSG é referente ao crescimento, ΔSM é referente a manutenção e ΔSP é referente

ao produto. Sendo: ΔS total o substrato consumido observado, ΔS G o substrato
gasto para o crescimento, ΔS P o substrato consumido para o produto e ΔS M o
substrato gasto para a manutenção celular.
Se o cultivo for aeróbico
O observado é referente ao experimental.
INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DE NUTRIENTES NA VELOCIDADE
ESPECÍFICA DE CRESCIMENTO
A velocidade de crescimento de microrganismos, como uma velocidade de
reação química, é uma função da concentração de compostos químicos. Os
compostos químicos nesse caso são os nutrientes essenciais para o
crescimento;
Em condições de limitação do nutriente a velocidade de crescimento reduz até
cessar completamente, em condições de exaustão do nutriente. Ou seja, o
modelo serve para esse crescimento com limitação.

Modelos de Crescimento Celular

Monod: O crescimento está sempre em fase exponencial. Modelo não segregado

e não estruturado.
Estruturados (S) versus Não Estruturados (U)
S: o modelo divide a massa celular em seus componentes
U: assume composição celular fixa - crescimento em fase exponencial
(descontínuo) ou contínuo
Segregado (S) versus Não-segregado (N)
S: podem existir diferentes tipos de células
N: todas as células são do mesmo tipo.

Modelo Cinético de Monod

Não estruturado
Não-segregado
Hipóteses (Monod, 1949):
• Um único substrato limitante
• Relação semi-empírica
• Cinética de Michaelis-Menten é responsável pelo sistema
enzimático
• A quantidade de enzima não é limitante ao crescimento
• Baixa concentração de células

Essa é a expressão mais usada para crescimento celular

• μM ou μMÁX: velocidade específica máxima de crescimento celular [h-1]
• KS: constante de saturação ou constante de Monod [g/L] ou [mol/L]
KS e μMÁX são parâmetros cinéticos.
• S: concentração do substrato limitante [g/L] ou [mol/L]
• μM quando S >>>> Ks
• KS concentração do substrato limitante quando μ = 1/2μm
• Em geral para S << Ks 1° ordem
Quando o Ks for menor, têm-se maior afinidade com o substrato. Ou seja,
menor Ks significa maior parte do cultivo em velocidade máxima de crescimento
e por isso melhor aproveitamento do substrato – maior afinidade por este
substrato.
A equação de Monod representa uma simplificação de várias situações reais:
• Não prevê fase LAG (μX=0)
• Não prevê fase estacionária
• Não prevê nenhum tipo de inibição
• Não se aplica a cultivos com limitação de outros nutrientes (apenas 1 S
limitante)
• Deve ser aplicado somente na fase exponencial

Linearização Lineweaver-Burk

Para linearizar para Monod, usa-se essa linearização.

O modelo de Monod não leva em conta efeitos inibitórios.

Modelos de Inibição: muito parecido com os modelos de enzimas. E
subdivide-se em:
1. Inibição por substrato: Alta concentração de substrato inibe o
crescimento

2. Inibição pelo produto: Altas concentrações de produtos são inibitórias.

Classificação dos processos fermentativos quanto à cinética de formação

de produto:
A relação cinética entre crescimento celular e formação de produto depende do
papel do produto no metabolismo celular.
A análise das velocidades específicas de crescimento celular e de formação de
produto para verificar a correlação entre a formação de produto e o crescimento
celular foi proposta inicialmente por GADEN em 1955.
As duas cinéticas mais comuns são aquelas que descrevem a síntese do produto
durante o crescimento ou após o crescimento ter cessado.
Um exemplo menos comum aplica-se ao caso onde o crescimento inicialmente
ocorre sem formação de produto, mas após algum período de tempo o produto
começa a aparecer enquanto o crescimento celular continua.
A cinética de formação de produtos pode representar os seguintes casos:
I. Produção associada ao crescimento (α≠0; β=0) – o produto é formado
durante o crescimento celular / metabólito primário
II. Produção parcialmente associada ao crescimento (α≠0; β≠0) – o
produto é formado parte antes e parte depois do crescimento / cinética
mista
III. Produção não associada ao crescimento (α=0;β≠0) – o produto é
formado após o crescimento celular / metabólito secundário
 Biorreatores

Este tipo de equipamento, também chamado de fermentador (tanto para

anaeróbico/fermentação quanto aeróbio/microbiano), é utilizado na etapa de
transformação em bioprocessos que envolve cultivo celular ou fermentações.
Este tipo de equipamento pode ter dimensões variadas de escala industrial
(germinador ou incubador) a tanques de fermentação, dornas e fermentadores.
Sua principal função é fornecer um ambiente controlado (controle de pH,
temperatura, agitação, aeração, adição de substrato e anti-espumante) para que
o microrganismo cresça de forma a obter o máximo de produto desejado.

Estrutura do biorreator

Formato: cilíndrico, fundo cônico ou esférico, altura 2 a 3 vezes o diâmetro,

volume de líquido 70 a 80% do total
Design depende do: tipo de célula, reação metabólica, transferência de massa
e calo, viscosidade e homogeneização
Tamanho: frascos agitados/erlenmeyer (100 a 1000 mL); fermentadores de
bancada (1 a 30L); fermentadores piloto/germinadores (100 a 1000L);
fermentadores industriais (1000 a 1000000L); bandejas e garrafas para
fermentação semi-sólida; colunas (células ou enzimas imobilizadas)

Classificação de bioprocessos

Bioprocesso submerso
A célula produtora se desenvolve em meio líquido e geralmente sob agitação,
quando é processo aeróbico, o oxigênio é inserido por meio de borbulhamento.
A maioria das fermentações industriais importantes ocorrem desta forma.
Suas principais vantagens são: operação em grandes volumes; distribuição
uniforme dos nutrientes; facilidade no controle do meio, podendo ser ajustado
para valores ótimos.; baixa contaminação e alto rendimento. Em relação as
desvantagens: elevado custo inicial e de manutenção; baixa concentração de
biomoléculas atingidas
Fermentação semi-sólida
Neste processo, os microrganismos crescem sobre ou dentro de uma matriz
sólida, e a presença de líquido é em quantidade ideal para que garanta o
crescimento mas não exceda a capacidade máxima de ligação entre líquido e
matriz. É comum se obter deste processo: enzimas, ácidos orgânicos, aromas e
bioerbicidas.
Dentre suas vantagens: utilização de menor estrutura; matérias-primas mais
baratas; obtenção de produto concentrado.

Tipos de biorreator

Células imobilizadas
Consiste na retenção/ligação do microrganismo em uma matriz sólida insolúvel.
Pode ser utilizado de forma contínua ou em batelada repetidas, usando o
microrganismo diversas vezes.
Há facilidade da separação de sólido-líquido, porém há restrição de transferência
de massa.

Membrana
É uma barreira que restringe a passagem do sólido (enzima, célula ou organela),
pode reter o biocatalisador. Na construção da membrana, ela pode ser polar ou
apolar, plana ou na forma de um capilar.
As principais forças motrizes: campo elétrico, diferença de concentração,
gradiente de pressão ou temperatura.

Classificação em relação a configuração

Para utilização industrial: 90% são de tanque agitado (STR), 7% tipo air-lift
(escala pequena a média), 3% são outros tipos.
Reator STR (stirred tank reactor) – reator agitado mecanicamente: são feitos
de aço carbono, possuem sistemas de agitação e aeração. O fundo e a tampa
torriesféricos são esterilizáveis, tem entrada para adição de inóculo, coleta de
amostras, possuem antiespumante e descarga/saída dos gases formados
durante a fermentação.
Coluna de bolhas: há um movimento aleatório do líquido no reator.
Air-lift: a movimentação do líquido é cíclica, bem definida e ocorre através de
dispositivos construídos para este propósito.

Parâmetros controlados nos biorreatores

Os fatores mais importantes são: pH, temperatura, oxigênio dissolvido

Transferência de oxigênio

É um aspecto muito importante em processos aeróbios, que ocorre por agitação

e aeração.
Nos processos, a solubilidade de nutrientes é alta enquanto a de gases é baixa.
Portanto, o oxigênio dissolvido na saturação, é da ordem de 7 ppm se borbulhar
o ar atmosférico.
A transferência de oxigênio ocorre nas seguintes etapas: Difusão do gás do
interior da bolha até a interface gás-líquido > Passagem pela interface gás-
líquido > Difusão através da película estagnada de líquido, externa à bolha >
Transporte através do meio líquido > Difusão através da película estagnada
externa ao agregado celular > Passagem pela interface película estagnada-
agregado celular > Difusão no agregado celular > Passagem pela membrana
celular > Difusão interna na célula
Fatores que afetam na transferência de oxigênio: temperatura, pressão parcial
do gás, concentração de solutos dissolvidos e pressão total.
Métodos para aumentar a transferência de oxigênio: aumento da agitação,
aumento da aeração, aumento da concentração de oxigênio do ar inserido,
aumento da pressão, redução de espuma e remoção de bolhas da superfície.
Agitação
Em sistemas não aerados, a agitação favorece a transferência do oxigênio da
superfície para o interior por captação do ar superficial. Já em sistemas aerados,
a agitação quebra as bolhas, reduzindo o tamanho das bolhas, aumentando a
área superficial de transferência de oxigênio e dispersa o ar no meio do cultivo.
Favorece a homogeneização igualando a temperatura, pH e concentração de
nutrientes. Suspende os microrganismos e nutrientes sólidos; reduz a espessura
do filme estagnante na interface gás-líquido, favorecendo o transporte de massa.
O coeficiente de transferência de oxigênio aumenta com a agitação. Porém a
agitação excessiva pode romper as células e aumentar a temperatura,
ocasionando uma redução na viabilidade celular.
Agitação em fluxo axial: deficiente em quebrar bolhas e gerar turbulência,
indesejáveis para cultivos aeróbios
Agitação em fluxo radial: não é tão eficiente na homogeneização, demanda maior
energia do que axial, e eficiente para quebrar bolhas
Aeração
Injeta-se ar ou oxigênio esterilizado no reator com fluxo definido. Se a velocidade
de agitação é baixa, as bolhas não são quebradas e se acumulam em torno do
rotor, reduzindo a transferência de oxigênio. Se a velocidade é alta, as bolhas
ficam pequenas e seu tempo de residência é aumentado.

Processos fermentativos

Existem vários tipos de condução de cultivos de microrganismos que foram

desenvolvidos para diferentes aplicações.
São classificados em: descontínuo, descontínuo-alimentado, contínuo e semi-
contínuo.

Modo de operação de um processo fermentativo

Descontínuo – comum em indústria de alimentos, produção de etanol

- Com um único inóculo por fermentação;
- Com reaproveitamento de células;
Semicontínuo
- Com um inóculo por tanque
- Com recirculação de células
Descontínuo Alimentado (“fed-batch”) – microrganismos
recombinantes/proteínas intracelulares
Contínuo – comum em fermentação alcoolica, tratamento de resíduos, produção
de enzimas e antibióticos, ferramenta de estudo
- Executado em um reator (com ou sem recirculação de células)
- Executado em vários reatores (com ou sem recirculação de células)

Processo descontínuo sem recirculação de células

É um sistema fechado e de volume constante.

O processo: Inicia-se o processo esterilizando o mosto no reator e inocula-se o
microrganismo (1 inóculo por fermentador) > fixam-se parâmetros do cultivo (pH,
temperatura, agitação e aeração) > durante o cultivo adiciona-se ar,
antiespumante, e substancias para controle de pH > finaliza-se > descarrega o
reator > meio fermentado é tratado.
Vantagens: fácil operação; baixo risco de contaminação; construção simples;
versatilidade de uso; melhor manutenção da genética dos microrganismos
recombinantes.
Desvantagens: acúmulo de compostos tóxicos; esgotamento do meio de cultivo;
inibição pelo substrato; degradação do produto; limpeza e preparo entre uma
batelada e outra; aumenta custo; menor produtividade volumétrica; baixo
rendimento

Processo descontínuo com reaproveitamento de inóculo

É utilizado como inóculo as células da fermentação anterior, para isso pode-se

utilizar parte do meio de fermentação ainda homogêneo, esperar que o
microrganismo sedimente no fermentador ou ainda centrifugar o meio
fermentado. É uma técnica comum em destilaria de álcool.
Tendência de aumentar o número de contaminantes a cada nova batelada.

Processo contínuo

É sistema aberto com volume mantido fixo.

É caracterizado por ter uma alimentação constante de meio de cultura com uma
vazão (constante), sendo o volume de meio do reator, mantido inalterado pois
há retirada contínua de caldo fermentado.
Pode ser operado por longos períodos de tempo em estado estacionário
As formas de operação:
Vantagens: maior produtividade; manutenção das células no mesmo estado
fisiológico; maior uniformidade; possibilidade de associação com outras
operações contínuas; menor necessidade de mão-de-obra
Desvantagens: maior investimento inicial; possibilidade de mutação genética
espontânea; maior possibilidade de contaminação; dificuldade de manutenção
da homogeneidade; dificuldade de operação em estado estacionário em
determinados processos.

Processo semi-contínuo sem recirculação de células

O processo segue a seguinte ordem: adiciona-se no fermentador, o inóculo e o

meio > aguarda o fim da fermentação > retira-se parte do meio fermentado (o
meio fermentado que fica no equipamento, serve de inóculo para a próxima
fermentação) > adiciona-se ao fermentador um volume de mosto igual ao que foi
retirado > repete a sequência a partir da espera do fim da fermentação.

Processo descontínuo alimentado

O volume do reator é variável durante o processo.

A fermentação é continuamente alimentada com nutrientes a partir de um dado
instante pré-definido. Os nutrientes podem ser adicionados todos de uma vez ou
de forma gradual, ou seja, ocorrem em apenas uma etapa ou em pulsos/várias
etapas.
É possível controlar a concentração de substrato na fermentação (podendo
assim interferir no metabolismo microbiano, levando a diferentes perfis de
concentração não só de substrato, mas também de células e produto)
Vantagens: controle de oferta de substrato; prevenção da inibição por substrato
(evita que elevadas concentrações de substrato causem inibição da
fermentação); minimiza o efeito da repressão catabólica (presença de elevada
concentração de substrato inibe a síntese de bioprodutos ou crescimento
celular); obtenção de elevada concentração celular; mantém baixa a
concentração de inibidores tóxicos/ácidos orgânicos; supera problemas de
estabilidade; o problema da espuma pode ser resolvido com este processo
Desvantagens: maior risco de contaminação; maior necessidade de controle do
processo.

Esterilização em Bioprocessos

Definições:

Esterilização é um processo físico ou químico que destrói ou inativa todas as

formas de vida presentes em um determinado material, principalmente
microrganismos incluindo formas de vida vegetativa e esporulada, bactérias,
fungos e vírus.
→ A esterilização não ocorre de forma parcial.

Desinfecção é um processo menos rigoroso de eliminação de microrganismos,

envolve o uso de agentes químicos como os desinfetantes ou germicidas.
→ Desinfecção não elimina todos os microrganismos.

Germicidas são substâncias que destroem germes e microrganismos.

Agente microbiano é um produto químico que mata ou inibe o crescimento de

microrganismos. Os bioestáticos são capazes de impedir a reprodução de
microrganismos, sem necessariamente matá-los.
Antissépticos são substâncias que impedem a multiplicação de
microrganismos, sem necessariamente destruí-los, e que não são
demasiadamente tóxicos, podendo ser aplicado sobre tecidos vivos.
Assepsia é a remoção de microrganismos patogênicos ou indesejados.

Fatores que influenciam na desinfecção e esterilização:

Concentração do microrganismo, composição do meio, espécie do
microrganismo, formação de esporos e tempo de ação.
→ Uma mesma substância dependendo do tempo de ação e da
concentração pode ser desinfetante, bactericida, antisséptico ou até
esterilizante.

Tipo de Microrganismo e Resistência:

Nível de atividade baixo (N.A. Baixo):

→ Bactérias vegetativas

→ Bactérias Gram-negativas

→ Vírus lipídicos

Nível de Atividade Intermediário (N.A. Intermediário):

→ Fungos

Nível de Atividade Alto (N.A. Alto):

→ Bactérias esporulantes (esporos)
→ Micobactérias
→ Bactérias Gram-positivas
→ Vírus não lipídicos

Cápsula Bacteriana

É formada por polissacarídeos e poliproteínas, desempenham funções na

aderência, virulência, proteção, captura de nutrientes e reconhecimento
intercelular.
→ As cápsulas podem variar em espessura e chegam a atingir até 2 vezes
o volume do organismo.
→ Na coloração de cápsulas, o fundo é corado em azul-cinzento e as células
coradas em vermelho. As cápsulas permanecem não coradas e aparecem
como um halo envolvendo a célula.
Bactérias Esporulantes

São capazes de formar esporos.

Os esporos são formas dormentes de uma célula bacteriana e são
produzidos por certas espécies de bactérias em situações de escassez de
nutrientes. As formas ativas das células bacterianas são denominadas formas
vegetativas (podem se reproduzir). O esporo é resistente a condições adversas,
incluindo altas temperaturas e solventes orgânicos. O citoplasma do esporo é
desidratado e contem ácido dipicolínico que está envolvido na resistência ao
calor.
→ São comumente produzidos pelos gêneros Bacillus e Clostridium.

Modo de ação dos agentes esterilizantes ou desinfetantes:

Atuam causando uma lesão celular destruindo as proteínas essenciais por

desnaturação, reagem com componentes celulares, destroem a membrana
citoplasmática, parede celular e DNA.

Principais formas de esterilização:

Esterilização a Frio: radiação (Raios Gamas, Irradiação por luz ultravioleta,

Radiação Ionizantes)
Esterilização a Quente: calor seco e calor úmido.
A esterilização pelo calor depende: da espécie do microrganismo, idade da
célula, formação de esporos, formação de cápsula bacteriana, formação de
aglomerados, presença no meio de substâncias protetoras, pH do meio,
existência de ácido dipicolínico e aquecimento em ambiente seco ou úmido.

Agentes de esterilização e desinfecção: físicos.

Calor úmido é o agente de uso mais frequente, fornecido por vapor de água
saturado. A facilidade de obtenção, de manuseio, sua eficácia e custo
relativamente baixo explicam o uso frequente. O vapor é obtido em caldeiras e
distribuído por dutos de aço galvanizado ou aço inoxidável, isolados
termicamente. É melhor utilizado a pressão superior a atmosférica.
→ Tubulações e reatores (fermentadores), vazios ou carregados com meio
de cultura, são usualmente esterilizados por calor úmido.
→ O ambiente úmido encurta o tempo de esterilização na mesma
temperatura, ou até reduz o valor da T necessária para esterilização.
→ O ambiente úmido causa maior penetração do calor devido à maior
condutividade térmica do vapor em relação ao ar.
→ Dilui o citoplasma celular, facilitando a desnaturação de proteínas.

Efeito do teor de água na desnaturação da ovoalbumina:

Calor seco é destinado a vidrarias, metais e sólidos resistentes ao calor. É

levada a efeito em fornos ou estufas que atingem temperaturas superiores a
150°C.
Na ausência de umidades, a transferência de calor é mais lenta e os
microrganismo apresentam maior resistência à inativação. Dessa forma, o tempo
do processo deve ser elevado, para garantir a eficiência.
→ Comparação entre calor seco e calor úmido:
Filtração é muito utilizado para o ar.
Ondas supersônicas.
Raios ultravioletas são utilizados para esterilizar materiais sólidos, como
vidrarias, utensílios metálicos, embalagens, etc. Os raios ultravioletas agem
diretamente sobre o DNA e RNA, alterando a estrutura dessas moléculas e
provocando danos ao processo de manutenção e divisão celular. Em função do
tempo de exposição, esses danos normalmente levam os microrganismos à
morte. Como a capacidade de penetração da radiação ultravioleta é muito baixa,
apenas a superfície do material exposto e o ar ao redor são esterilizados.
→ A esterilização é feita simplesmente expondo os materiais à radiação em
ambiente fechado, pelo tempo adequado (várias horas).

Radiação Ionizante, possui um poder de penetração extremamente alto. O

bombardeio de microrganismos por gama gera grande quantidade de alterações
nas moléculas de DNA, danificando-as, em geral irreversivelmente.
Adicionalmente, inúmeras moléculas internas aos microrganismos são ionizadas
(a água, por exemplo), dando origem a espécies tóxicas altamente reativas,
como os peróxidos e vários radicais livres.4 Essas moléculas desestruturam o
equilíbrio bioquímico dos microrganismos, mesmo esporulados.
→ Os materiais expostos à radiação gama não guardam resquícios
radiativos, daí ser um método seguro de esterilização.

Agentes de esterilização e desinfecção: químicos.

Os principais são:
→ Sais quaternários de amônio
 → Fenol

→ Etanol 70%

→ Cloro 0,5 %

→ Formaldeído

→ Peróxido de Hidrogênio

Sal quartenário de amônio:

Os cátions quaternários de amônio são íons poliatômicos carregados
positivamente e com a estrutura NR4+, sendo R qualquer radical alquila.

→ Cloreto de benzalcônio (cloreto de alquil dimetil benzil amônio) é um

tensoativo pertencente ao grupo de compostos de amônio quaternário. É
um sal facilmente solúvel em água, álcool e acetona.
→ Lysoform: Tensoativo Catiônico, Sequestrante, Alcalinizante,
Conservante, Fragrância e Veículo. Componente Ativo: 0,45% de Cloreto
de Benzil Alquil Dimetil Amônio/ Cloreto de Didecil Dimetilamônio.
É mais utilizado em: detergentes, desinfetantes e antissépticos.
→ Atua para nível de atividade baixo.

Etanol 70%:

Álcool etílico (etanol) e álcool isopropílico têm características germicidas por

causar desnaturação da maioria das proteínas. O álcool 70% possui
concentração ótima para o efeito bactericida, porque a desnaturação das
proteínas do microrganismo faz-se mais eficientemente na presença da água e
também retarda a volatilização do álcool, permitindo maior tempo de contato.

Nesta concentração, o etanol destrói bactérias vegetativas, porém esporos

bacterianos podem ser resistentes. Fungos e vírus (envelopados, como o vírus
Influenza H1N1 ou lipídicos como o COVID) também são destruídos pelo álcool
70%.

→ O álcool destrói a membrana celular externa por desidratação.

→ As moléculas de álcool penetram no citoplasma e, como resultado,

desnaturam as proteínas responsáveis por atividades celulares
essenciais.

O etanol absoluto é menos eficiente para desinfecção, pois ocorre uma

coagulação extremamente rápida, não havendo penetração no interior da célula
e, portanto, não matando o microrganismo. Essa atuação ineficaz ocorre devido
à rápida volatilização do etanol nessa concentração. O grau de hidratação é um
fator importante para a atividade antimicrobiana. Uma boa atividade germicida
ocorre entre 50 a 70%, sendo a máxima a 70% de diluição.

Agentes Gasosos

É utilizado para esterilização e desinfecção de equipamentos hospitalares, salas

e laboratórios, itens plásticos e alimentos.
→ Não é o método de escolha em indústrias de fermentação.

Os mais utilizados são: óxido de etileno, óxido de propileno, formaldeído e

betapropiolactona.
 → Em um bioprocesso os pontos mais importantes de esterilização são:
equipamentos, meio de cultura e ar.

Formas de condução do processo de esterilização:

Descontínua: consegue-se esterilizar os meios de cultura e equipamentos todos

ao mesmo tempo, e o meio de cultura é esterilizado dentro do próprio reator.
Contínua: o meio esterilizado separadamente em esterilizador contínuo.

Passo a passo da esterilização descontínua:

1. Limpeza e lavagem do reator com surfactantes e germicidas químicos –
eliminação de qualquer residual de germicidas.

2. Preenchimento do reator com o meio de cultura.

3. Aquecimento com vapor indireto (camisas de aquecimento e/ou serpentinas)
até próximo da ebulição –usualmente 96 –97°C.
→ Esta etapa é crítica devido ao tempo necessário para o aquecimento do
meio de cultura, da temperatura ambiente até ebulição. Uma relação
adequada entre a área da serpentina ou camisa e o meio de cultura
favorece o rápido aquecimento.
4. Durante essa etapa a cabeça do tanque deve receber vapor fluente para
expulsão do ar do seu interior. Ao mesmo tempo, as válvulas, filtros e tubulações
de entrada e saída do reator também são esterilizadas por vapor fluente.

5. Aquecimento com vapor direto: Injeta-se vapor diretamente no meio de cultura

até que atinja 100°C.

6. A partir desse momento, o reator é completamente fechado e a injeção de

vapor continua até que a temperatura e pressão internas sejam adequadas
(121°C e 1 atm). Esta etapa é chamada de pressurização.
→ Obs.: A injeção direta de vapor aumenta em 10 a 15% o volume do meio
de cultura. Por isso deve ser preparado concentrado.
7. Atingidas as condições de esterilização, a injeção direta de vapor pode ser
cortada e o controle da temperatura e pressão mantidos através da serpentina
ou camisa pelo tempo necessário.

Pasteurização
É o tratamento térmico baseado na mudança de temperatura, causando um
choque térmico (geralmente 62°C por 30 min, seguido de resfriamento brusco)
para redução drástica do número de microrganismos viáveis.
→ Usado geralmente para alimentos, normalmente leite e derivados,
bebidas enlatadas e engarrafadas.

Processos térmicos de tratamento do leite:

O tratamento térmico visa eliminar as bactérias patogênicas contaminantes do

leite, aumentando o tempo de vida útil do produto e com mínima perda de teor
proteico e vitamínico. Porém na pasteurização sempre há sobrevivência de
alguma bactéria ou esporo termo-resistente.
Leite pasteurizado:
→ High Temperature Short Time (HTST):
→ Utiliza trocadores de calor de placas, a eficiência depende da
concentração inicial de contaminantes e o leite precisa de refrigeração.
→ Pasteurização lenta

Leite Longa Vida

→ Ultra High Temperature (UHT):
→ Alta eficiência, o leite fica comercialmente estéril pois elimina todas as
bactérias vegetativas, não precisa de refrigeração. Processo contínuo de
esterilização e envase. Entre 130 a 150°C, por 3 a 5 segundos.

Esterilização de Ar

As espécies microbianas suspensas no ar atmosférico, assim como sua

concentração, podem ser extremamente variáveis.
Esses microrganismos são provenientes do solo, água, esgoto, colheitas,
abaltedouros, criação de animais, depósitos de resíduos, perdigotos, etc.
Os principais tipos encontrados no ar são os esporos de fungos como
Cladosporium e Aspergillus e bactérias esporulantes.
Meios de Esterilização do ar:

Aquecimento:
→ Esterilização de ar por calor seco: é utilizada para pequenas instalações,
como em laboratórios e escala piloto.
→ Em biorreatores industriais: são necessárias grandes vazões de ar.
Apresenta a dificuldade no aquecimento de grande volume de ar e sua
permanência em T elevadas.

O processo consiste em forçar a passagem do ar através de resistores elétricos,

onde o ar é aquecido, e mantê-lo pelo tempo necessário a altas temperaturas. É
também possível esterilizar o ar que sai do biorreator, fazendo-o passar por um
segundo sistema, para o caso de fermentação com patógenos.

Radiação:
Podem ser utilizadas diversas radiações, mas a melhor é a ultravioleta.
As radiações ultravioletas são utilizadas no interior de salas ou câmaras para
esterilização do ar circundante e de mesas, uma vez que o ar introduzido nestes
locais é previamente esterilizado por filtração.
→ Por possuir baixo poder de penetração e longos períodos de exposição,
não é o método mais viável.

Filtração:
A esterilização do ar por filtração é a solução mais adequada para a obtenção
de altas vazões de ar esterilizado, em virtude dos baixos custos envolvidos e de
filtros bastante confiáveis. Por esses motivos a filtração é utilizada em
praticamente todas as instalações industriais.
Os materiais filtrantes são: carvão, algodão, papel; substituídos por lã de vidro
(final década de 70 Início década de 1970 filtros de materiais sinterizados vidro,
metais (aço inoxidável) e materiais cerâmicos, filtros de membranas ou placas
porosas de materiais poliméricos nailon teflon ou ésteres de celulose)
→ Filtro de materiais fibrosos: filtros de lã de vidro.
Poros ou interstícios entre as fibras (por onde passa o ar) são de dimensões
maiores do que o diâmetro das fibras – fibras com diâmetro de 3 μm a 19m.

Operação de filtração em profundidade, pois as partículas são retidas ao longo

de toda altura da camada filtrante.
Retenção dos microrganismos por impacto direto e retenção mecânica.

→ Fibras de Membramas:

Filtros de membranas microporosas elaborados com material polimérico, por

exemplo politetrafluoretileno (PTFE teflon). Poros de dimensões menores do que
os microrganismos a serem retidos (0,2 m, 0,22 m ou 0,45 m)
A retenção dos microrganismos por impacto direto ocorre na superfície do
elemento filtrante.
Os filtros hidrofóbicos sem água na superfície do filtro diminuem o crescimento
microbiano, diminuindo a possibilidade de enviar ar contaminado para o
biorreator.

Cinética da Destruição Térmica de Microorganismos

De tempos em tempos colhem se amostras e através de técnica de

plaqueamento (UFC Unidades Formadoras de Colônias) colhem se os dados do
número de células viáveis ao longo do tempo de exposição (N).
A esterilização por aquecimento segue uma cinética de 1ª ordem:

Onde:
k = constante de destruição térmica dos microrganismos (min-1)
t = tempo de esterilização.
N = Número de microrganismos/esporos ao final da esterilização por um tempo
t, a T constantes.
N0 = Número de microrganismos/esporos na amostra antes da esterilização (t =
0).

→ Quanto maior a temperatura maior o valo do k e menor a resistência.

Tempo de redução decimal (D):

É o tempo para reduzir a população microbiana em 90% da sua quantidade inicial

(um décmo).

Variação de k com a temperatura:

→ Se o tempo de esterilização for longo praticamente todos os nutrientes,

tais como as vitaminas de um meio de cultura, são destruídos.