ELETROFORESE

CAPILAR E TÉCNICAS
RELACIONADAS

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 Introdução

Eletroforese  Métodos de separação que baseiam-se nas

velocidades de migração diferenciais de espécies carregadas em
um campo elétrico de cc
Papel
Planar
Gel poroso

Eletroforese

Capilar

2
 Eletroforese em Papel

Cuba eletroforética

3
 Eletroforese em Gel

Desvantagens da eletroforese plana  análises demoradas e exigência

de experiência do operador
4
 Eletroforese Capilar

Característica  As separações das substâncias acontecem por

migração dentro de um tubo de sílica cujas extremidades são
conectadas a eletrodos de cargas opostas

Cátions  atraídos para o terminal negativo  cátodo

Ânions  atraídos para o terminal positivo  ânodo

5
 Instrumentação para eletroforese capilar
de zona (ECZ)
Capilar de sílica fundida
Reservatórios de solvente
Eletrodos de platina
Fonte de corrente contínua de alta tenção
Detector

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 Vantagens da eletroforese capilar
Rapidez nas análises
Altas resoluções em comparação
à cromatografia
Picos estreitos
Menores custos

7
 O Capilar de sílica fundida
 Comprimento  de 40 a 100 cm
 Diâmetro interno  10 a 100m
Parede interna  grupos silanóis com carga negativa (pH > 2)
Dupla camada  cátions imóveis fortemente adsorvidos + parte
difusa também rica em cátions

8
 Detectores em Eletroforese Capilar
 Detectores  São similares em desenho e função aqueles
utilizados em CLAE

9
 Mobilidade eletroforética

É a razão entre a velocidade de migração de um íon e o campo

elétrico aplicado
v é a velocidade do íon
e é a mobilidade eletroforética
E é a força do campo elétrico
V é a voltagem aplicada
L é o comprimento do capilar
Ld é a distância entre o detector e a
extremidade do capilar
t é o tempo de migração 10
A mobilidade eletroforética é diretamente proporcional à carga
do íon e inversamente proporcional ao coeficiente de atrito

HO2C CO2H - -
O2C CO2H O2C CO2-
CO2- CO2- CO2-

e = -2,54 x 10-8 m2/V.s e = -4,69 x 10-8 m2/V.s e = -5,95 x 10-8 m2/V.s

11
 Exemplo 1
Uma amostra de várias proteínas é aplicada a um capilar com
revestimento neutro e comprimento total de 25,0 cm e distância até o
detector de 22,0 cm. Duas das proteínas na amostra fornecem tempo
de migração de 15,3 min e 16,2 min quando se usa uma tensão
aplicada de 20 kV. Quais são as velocidades de migração e as
mobilidades eletroforéticas nestas condições?

12
 Pratos teóricos em eletroforese
Tem sido demonstrado que:

N é o número de pratos
e é a mobilidade eletroforética
V é a voltagem aplicada
Se L = Ld tem-se: D é o coeficiente de difusão do soluto (cm2/s)
L é o comprimento do capilar
Ld é a distância ente o detector e a extremidade
do capilar

N em eletroforese capilar  entre 100.000 a 200.000 pratos

13
 Exemplo 2

A primeira proteína do exercício anterior tem coeficiente de difusão de

cerca de 2,0 x 10-7 cm2/s em seu eletrólito de corrida. Se a difusão
longitudinal é o único processo significativo de alargamento de banda
presente durante a separação da proteína por eletroforese capilar,
qual o número máximo de pratos previsível para a proteína quando se
aplica uma tensão de 20,0 e 30,0 kV?

14
 Exemplo 3
Certo cátion inorgânico apresenta uma mobilidade eletroforética de
4,31 X 10-4 cm2 s-1 V-1. Esse mesmo íon mostra um coeficiente de
difusão de 9,8 X 10-6 cm2 s-1. Se esse íon for separado por eletroforese
capilar de zona em um capilar de 50,0 cm, qual seria o número de
pratos esperado nas seguintes voltagens aplicadas:
(a)5,0 kV?
(b)10,0 kV?
(c)30,0 kV/

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 Fatores que diminuem o número de pratos

 Adsorção do analito nas paredes do capilar

 Alargamento da banda extracoluna
 Aquecimento Joule devido ao aumento da tensão

16
 O Fluxo eletrosmótico
 Definição  é o fluxo de migração do solvente em direção ao
cátodo quando uma alta voltagem é aplicada nas extremidades do
capilar
 Causa  os cátions da parte difusa da dupla camada são atraídos
pelo cátodo provocando impulsionamento da solução tampão
 Mudança do sentido do FEO  reação dos grupos silanóis com
grupos alquilamônio

17
18
 Mobilidade eletrosmótica (eo)

É a constante de proporcionalidade entre a velocidade

eletrosmótica (veo) e o campo aplicado (E)

veo = eo E

 Como medir na prática  adiciona-se à amostra uma

molécula neutra, à qual o detector responda

veo = distância percorrida / tempo de migração

19
 Características do fluxo eletrosmótico

 Perfil laminar minimiza o alargamento da banda

Fluxo eletrosmótico  perfil

laminar

Fluxo induzido por diferença de

pressão  perfil parabólico

20
 Características do fluxo eletrosmótico
 Velocidade de migração desejável maior que a migração
eletroforética

21
 Mobilidade aparente do íon
É a soma da mobilidade eletroforética do íon mais a mobilidade
eletrosmótica da solução

Cuidado com
os sinais de ef
e eo

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 Exemplo 4
O analito catiônico do exemplo 3 foi separado por eletroforese capilar
de zona em um capilar de 50,0 cm a 10,0 kV. Sob essas condições de
separação, a velocidade linear do fluxo eletrosmótico foi de 0,85
mm/s em direção ao cátodo. Se o detector foi colocado à 40,0 cm da
extremidade de injeção do capilar, quantos minutos foram
necessários para que o cátion do analito atingisse o detector após a
aplicação do campo?

23
 Análise quantitativa por ECZ
 Normalização da área do pico  é necessária pois os analitos
passam com velocidades diferentes pelo detector  área do pico
não é proporcional a concentração como em cromatografia

 Curvas de calibração  obtida com a área normalizada para

padrões e analitos
24
 Exemplo 5

As proteínas 1 e 2 do exemplo 1 têm áreas medidas de 1290 e 1360

unidades em 20,0 kV, quando registradas por um detector de
absorvância. Se é sabido que essas duas proteínas apresentam uma
resposta semelhante ao detector,
(a)Qual será a área corrigida e a quantidade relativa de cada proteína
na amostra?
(b)Se usarmos apenas as áreas de cada analito o que poderíamos
erradamente concluir?

25
Exemplo de aplicação 1

26
Exemplo de aplicação 2

27
 Eletrocromatografia capilar (ECC)

 ECC  é um híbrido da CLAE e da EC

 Vantagem  Agrupa algumas das melhores características dos
dois métodos
 Como em CLAE  Separação de espécies neutras
 Como em EC  não há necessidade de bombas de alta pressão,
usa microvolumes de amostra e possui altos nº de pratos 
separações eficientes

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 Eletrocromatografia em
coluna recheada

Tipos de ECC

Cromatografia
eletrocinética capilar
micelar

29
 Eletrocromatografia em Coluna Recheada

 É a menos madura das técnicas de eletroseparação

 Capilar recheado com uma fase estacionária reversa de CLAE
 Fase móvel  solvente polar impulsionado pelo Fluxo
eletrosmótico
 Há transferência da massa do analito entre a FE e a FM 
equilíbrio descrito por uma cte (K)

30
Exemplo de um eletrocromatograma

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 Cromatografia Eletrocinética Capilar Micelar

 Desvantagem da EC  não separa analitos de carga neutra

 Descrição da CECM Utiliza uma fase micelar formada por
surfactantes iônicos que incorporam o analito neutro e o faz
migrar
 Como formar a fase micelar?  utilizar o surfactante acima da
CMC  pseudo fase estacionária
 O surfactante mais empregado tem sido o dodecil sulfato sódico
(SDS)
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Cromatografia Eletrocinética Capilar Micelar

Lâmpada do detector

Revestimento de
polimida Micelas
Filtro seletor do
Parede do capilar Janela do comprimento de
detector onda

Analitos
Anodo
Sentido do
FEO Catodo

Conjunto de
fotodíodos

33
Ex: Análise de um medicamento para gripe

34