ELETROFORESE CAPILAR

A eletroforese capilar (EC) é um método físico de análise baseado na migração, dentro de um capilar, de solutos dissolvidos em uma solução eletrolítica, sob influência de uma corrente elétrica. É uma técnica que permite a análise quali e quantitativa íons inorgânicos, ácidos nucléicos, proteínas, metabólitos secundários e fármacos, sendo bastante aplicável em diversas áreas do conhecimento, como química, bioquímica, ciência forense, laboratórios clínicos, indústria farmacêutica, entre outros. Trata-se de uma técnica que apresenta resultados promissores em termos de resolução, velocidade e potencial para automação, principalmente em relação à eletroforese convencional, e apresenta uma instrumentação relativamente simples, como pode ser visto a seguir:

- Uma fonte de alta voltagem, que vai produzir o campo elétrico necessário à separação eletroforética; - Dois reservatórios de eletrólitos, mantidos no mesmo nível, que vão conter as soluções anódica e catódica; - Dois eletrodos (cátodo e ânodo), imersos nos reservatórios dos eletrólitos e conectados à fonte de alta voltagem e que irão consistir nos polos positivo e negativo do sistema; - Um capilar de sílica fundida, de 10-100 µm de diâmetro e 40 a 100 cm de comprimento, feito geralmente de vidro. Os terminais do capilar são imersos nos reservatórios contendo os eletrólitos. Vai ser o caminho por onde os analitos irão migrar de acordo com sua mobilidade eletroforética; - Detector capaz de monitorar a quantidade de analitos que passam através do segmento de detecção do capilar em intervalo de tempo específico. Os detectores mais usuais em eletroforese capilar são baseados em espectrofotometria de absorção (UV-VIS) ou fluorimetria, sendo também utilizada a detecção eletroquímica ou por espectro de massas. Na eletroforese capilar, dois fatores governam o fluxo dos analitos pelo capilar: a migração eletroforética e o fluxo eletro-osmótico. A migração eletroforética é a migração de analito baseada em suas propriedades massa-carga, sendo característica de cada analito e podendo ou não se dar no sentido em direção ao detector. Trata-se, portanto, do movimento dos analitos no capilar devido ao campo elétrico (E). A velocidade eletroforética vai depender de fatores inerentes ao analito (tamanho, forma, carga elétrica) e fatores inerentes ao eletrólito (força iônica, pH, viscosidade e presença de aditivos), conforme a seguinte equação:

0) que vão interagir eletrostaticamente com íons de carga positiva presente no eletrólito. que permite que os analitos. levando consigo os analitos. Como será visto adiante. sendo a força adicional que direciona todos os analitos através do capilar em direção ao detector. a viscosidade para que não haja diminuição desnecessária da velocidade eletroforética que poderia acarretar em falta de reprodutibilidade inter-corrida e diminuição de eficiência. no eletrólito.Como pode ser observado pela equação. a amostra não influencia na velocidade do fluxo . isto é. como pode ser visto na equação a seguir. maior a viscosidade do eletrólito e maior o tamanho do capilar. Já o fluxo eletro-osmótico é o fluxo de eletrólito ao longo do capilar. uniforme em todo o diâmetro do capilar. partícula neutra). quanto maior a carga e a voltagem aplicada. migrem pelo capilar podendo chegar ao detector. menor a velocidade eletroforética. contrário ao que ocorre no bombeamento por pressão (CLAE e CLUE) em que o fluxo se dá de forma parabólica. Se a carga líquida do analito for zero (ou seja. como pode ser visto a seguir: A velocidade do fluxo eletrosmótico (Veo) depende da mobilidade eletro-osmótica (µeo). por sua vez. formando uma camada móvel de cátions em direção ao cátodo (polo negativo) formando um fluxo laminar uniforme. Por isso é importante também observar. que. independente de sua carga. podendo acarretar em alargamento de picos. está diretamente relacionada à densidade de carga da parede interna do capilar e às características do eletrólito. Uma das principais vantagens da eletroforese capilar em relação às demais técnicas cromatográficas é que por conta desse “bombeamento de fase móvel” provocar um fluxo laminar. devido a superfície negativamente carregada da parede interna do capilar de sílica fundida. Como pode ser observado. Quanto maior o tamanho da partícula do analito. maior a velocidade eletroforética. uma das consequências do efeito Joule é a alteração na viscosidade do eletrólito que pode acarreta em perda de reprodutibilidade. Esse fluxo eletro-osmótico ocorre por conta da presença de grupos silanóis ionizados (quando em pH acima de 3. não há mobilidade eletroforética (velocidade igual a zero). independente de sua carga.

A mobilidade eletroforética e o fluxo eletro-osmótico podem. dependendo da carga do soluto. Dessa forma. o que é esquematizado a seguir: . de diferentes densidades de cargas. numa mesma corrida eletroforética. a eletroforese convencional seria muito demorada. atuarem na mesma direção. ou não. maior a ionização dos grupos silanóis da parede interna do capilar e portanto maior a densidade de cargas negativas (potencial zeta) e maior a velocidade eletroosmótica. No entanto. portanto. o que pode ser controlado pelo pH do eletrólito: quanto mais básico o pH. para se acelerar o processo. consegue-se separar ânions e cátions. utiliza-se polaridade invertida e fluxo eletroosmótico invertido.eletroosmótico. na separação de ânions. define-se velocidade total a soma das velocidades eletroforética e eletroosmótica. que vai depender principalmente das cargas da parede interna do capilar. o que pode ser conseguido pela adição de tensoativos ao eletrólito. o que é esquematizado na figura abaixo: Como pode ser observado. nesses casos. Como pode ser observado. elui primeiro as moléculas com maior carga (positiva) e elui por último às que tem menor carga (negativa).

menor o tempo necessário para a corrida. Tempo (t) necessário para o soluto migrar uma distância (l) do terminal de injeção do capilar até a janela de detecção (comprimento efetivo do capilar) é definido pela equação: Ou seja. Consistiria em começar a eletroforese com uma voltagem moderada para a separação dos analitos com mobilidade maior e em seguida aumentar essa voltagem para acelerar a velocidade dos analitos de mobilidade menor (lembrando que. quanto maior o tamanho efetivo do capilar. segundo as equações apresentadas. aumentando-se a voltagem. aumenta-se a velocidade eletroforética e eletroosmótica). Lembrando que o comprimento efetivo do capilar é a porção do capilar que se situa entre o ponto de aplicação da amostra e o detector. sendo definido pela seguinte equação: .A eletroforese com voltagem em gradiente é uma boa alternativa para a separação simultânea de compostos com mobilidades eletroforéticas muito diferentes em um período de tempo reduzido. no entanto é pouco usual. O número de pratos teóricos (N) é um indicativo de eficiência da eletroforese capilar e que implicará diretamente na sua resolução. maior o tempo requerido para a corrida e quanto maior a velocidade total.

Um dos grandes gargalos da eletroforese é o efeito Joule. principalmente quando se pensa em detecção por UV. o número de pratos teóricos pode ser aumentado com o aumento da voltagem. CAPILARES: Tem de 10 a 100 µm de diâmetro e 40 a 100 cm de comprimento. que seria uma espécie de buraco que permite que a luz passe pela amostra mas não passe pelo vidro. O quartzo seria o mais ideal.Quanto menor o diâmetro interno do capilar. O capilar é refrigerado externamente por ar ou líquido para evitar efeito Joule. A solução mais empregada é o uso de um sistema de controle de temperatura (capilar resfriado com líquido ou ar) e usar voltagens adequadas (não muito altas). ele ainda é um problema que pode ocorrer na eletroforese capilar e que pode influenciar enormemente na resolução e repetitibilidade das corridas. o que vai expor grupos silanóis que são importantes para o fluxo eletroosmótico explicado anteriormente. sendo inclusive. . Assim. N é tipicamente é 105 com as voltagens usuais aplicadas em eletroforese capilar. quartzo ou teflon.Portanto. Ao contrários das demais técnicas cromatográficas. podendo ocasionar alargamento dos picos e piora na resolução e repetitibilidade. mas utiliza-se o artifício de se criar uma “janela” no capilar próximo ao detector. O aquecimento produzido pode alterar a viscosidade do eletrólito o que pode alterar a velocidade de migração e comprometer a repetitibilidade das corridas. mas o aumento da voltagem pode provocar efeito Joule que pode comprometer a resolução e repetitibilidade das corridas. necessário utilizar eletrólitos aditivados com substâncias que inibam essa interação. decorrente da passagem da corrente elétrica pelo capilar. menor a corrente elétrica e consequente maior tempo de migração. O vidro absorve UV. São fundidos com sílica (dióxido de silício) na parte interna. permitindo maior elevação da voltagem e redução no tempo de análise e maior eficiência de separação (maior número de pratos teóricos) . o número de pratos (N) não aumenta como o aumento do comprimento do capilar. é desejável que aplique altas voltagens para se obter separações com alta resolução. mas os de vidro são os mais utilizados principalmente por conta do custo mais acessível. O teflon não é muito utilizado pois não suportas elevadas voltagens.Quanto maior o capilar. São geralmente produzids em vidro. O tamanho do capilar influencia na corrida das seguintes formas: . O efeito joule consiste na conversão de energia de elétrica em energia térmica. como se pode observar. em alguns casos. diz-se que a eletroforese capilar é uma técnica de resolução bastante elevada quando comparadas às demais. Por isso. uma vez que quartzo não absorve luz UV. Não deve haver interação do analito com a sílica. Embora ele tenha sido enormemente minimizado com uso de capilares. maior a capacidade de dissipação de calor (menor efeito Joule).

A injeção hidrodinâmica consiste na injeção de amostra com base no uso de pressão. Por isso. não há possibilidade de eletroforese capilar preparativa. portanto. Em ambos os tipos de injeção de amostra. fatores como tempo de injeção. viscosidade da amostra e tamanho efetivo do capilar podem influenciar. que é crucial em algumas áreas de aplicação (como por exemplo na área forense). existe uma dificuldade na detecção por conta do menor volume de amostra (nL) e pequeno diâmetro interno dos capilares. A injeção da amostra no eletroferógrafo capilar pode ser feita de duas formas: por injeção hidrodinâmica ou por injeção eletrocinética. uma forma de injeção que não produz amostras representativas dentro do equipamento. Esse aspecto traz à técnica uma enorme vantagem às demais por conta da pequena demanda de amostra. o que pode ser justificado pelas micrométricas dimensões dos capilares. através da formação de um circuito elétrico entre o recipiente que contém a amostra e o eletroferógrafo. na eletroforese capilar não é possível se realizar fracionamento de amostras. que exigem grande número de amostra. ao contrário das técnicas cromatográficas convencionais. concentração da amostra. o que exige que faz com que as mesmas técnicas utilizadas em CLAE sejam menos sensíveis em EC. no entanto. . vácuo ou gravidade.INJEÇÃO DE AMOSTRA: A quantidade de amostra injetada num eletroferógrafo capilar situa-se na ordem de 10 a 100 nL de amostra. A injeção eletrocinética consiste na injeção com base nas mobilidades eletroforéticas dos analitos. isso também pode ser uma limitação quando se pensa em técnicas preparativas. A injeção eletrocinética tem a desvantagem de favorecer a injeção de moléculas de maior mobilidade. DETECÇÃO: Geralmente os mesmos detectores utilizados em CLAE. No entanto. ou seja. sendo.

ou seja. VANTAGENS DA ELETROFORESE CAPILAR:  Separações de alta eficiência (número alto de pratos teóricos comparativamente à CLAE)  Tempos de análise relativamente curtos (poucos minutos)  Instrumentação relativamente simples  Pequena demanda de amostra  Não há alargamento de bandas  Diminuição do efeito Joule (o calor é dissipado mais facilmente dentro do capilar)  Possibilidade de automatização REFERÊNCIAS QUE EU SUGIRO (ARTIGOS EM PORTUGUÊS):  TAVARES. v. n. o detector ideal deve ser versátil. linha de base estável. na extremidade final do capilar. visível.  TAVARES. sensível. Os principais detectores em linhas para eletroforese capilar são: .Como em qualquer análise. 20. p. M. ampla faixa de linearidade. F. enquanto a solução ainda migra capilar. M.Amperometria e condutivimetria (menos empregados em eletroforese capilar) A espectrometria de massas é um tipo de detecção que é realizado no final capilar. v. Química Nova. 1996. robusto e responsivo a vários tipos de analitos e a escolha do detector vai depender das propriedas fisico-químicas do analito. 173-181. n. baixo nível de ruido. Ler também na Farmacopeia Brasileira 5ª Edição (a parte de fluxo eletroosmótico é muito bem explicadinha lá) e no livro de Química Analítica de Skoog (tem todas as técnicas cromatográficas.Dectores de absorbância (UV. 2. isto é. 5. M. . 1997. Química Nova. praticamente). 19. Mecanismos de separação em eletroforese capilar. UV-indireta) . 493-511. p. Os principais detectores utilizados em eletroforese capilar podem ser em linha.Detectores de fluorescência (detectores de laser induzido por fluorescência ou LIF) . UV-DAD. F. M. Eletroforese capilar: conceitos básicos. ou após a coluna.

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