ELETROFORESE CAPILAR

A eletroforese capilar (EC) é um método físico de análise baseado na migração, dentro de um capilar, de solutos dissolvidos em uma solução eletrolítica, sob influência de uma corrente elétrica. É uma técnica que permite a análise quali e quantitativa íons inorgânicos, ácidos nucléicos, proteínas, metabólitos secundários e fármacos, sendo bastante aplicável em diversas áreas do conhecimento, como química, bioquímica, ciência forense, laboratórios clínicos, indústria farmacêutica, entre outros. Trata-se de uma técnica que apresenta resultados promissores em termos de resolução, velocidade e potencial para automação, principalmente em relação à eletroforese convencional, e apresenta uma instrumentação relativamente simples, como pode ser visto a seguir:

- Uma fonte de alta voltagem, que vai produzir o campo elétrico necessário à separação eletroforética; - Dois reservatórios de eletrólitos, mantidos no mesmo nível, que vão conter as soluções anódica e catódica; - Dois eletrodos (cátodo e ânodo), imersos nos reservatórios dos eletrólitos e conectados à fonte de alta voltagem e que irão consistir nos polos positivo e negativo do sistema; - Um capilar de sílica fundida, de 10-100 µm de diâmetro e 40 a 100 cm de comprimento, feito geralmente de vidro. Os terminais do capilar são imersos nos reservatórios contendo os eletrólitos. Vai ser o caminho por onde os analitos irão migrar de acordo com sua mobilidade eletroforética; - Detector capaz de monitorar a quantidade de analitos que passam através do segmento de detecção do capilar em intervalo de tempo específico. Os detectores mais usuais em eletroforese capilar são baseados em espectrofotometria de absorção (UV-VIS) ou fluorimetria, sendo também utilizada a detecção eletroquímica ou por espectro de massas. Na eletroforese capilar, dois fatores governam o fluxo dos analitos pelo capilar: a migração eletroforética e o fluxo eletro-osmótico. A migração eletroforética é a migração de analito baseada em suas propriedades massa-carga, sendo característica de cada analito e podendo ou não se dar no sentido em direção ao detector. Trata-se, portanto, do movimento dos analitos no capilar devido ao campo elétrico (E). A velocidade eletroforética vai depender de fatores inerentes ao analito (tamanho, forma, carga elétrica) e fatores inerentes ao eletrólito (força iônica, pH, viscosidade e presença de aditivos), conforme a seguinte equação:

Como pode ser observado pela equação. Como pode ser observado. Esse fluxo eletro-osmótico ocorre por conta da presença de grupos silanóis ionizados (quando em pH acima de 3. Como será visto adiante. maior a viscosidade do eletrólito e maior o tamanho do capilar. que. devido a superfície negativamente carregada da parede interna do capilar de sílica fundida. independente de sua carga. Se a carga líquida do analito for zero (ou seja. migrem pelo capilar podendo chegar ao detector. Quanto maior o tamanho da partícula do analito. isto é. menor a velocidade eletroforética. a amostra não influencia na velocidade do fluxo . no eletrólito. uniforme em todo o diâmetro do capilar. maior a velocidade eletroforética. está diretamente relacionada à densidade de carga da parede interna do capilar e às características do eletrólito. sendo a força adicional que direciona todos os analitos através do capilar em direção ao detector. quanto maior a carga e a voltagem aplicada. como pode ser visto a seguir: A velocidade do fluxo eletrosmótico (Veo) depende da mobilidade eletro-osmótica (µeo). contrário ao que ocorre no bombeamento por pressão (CLAE e CLUE) em que o fluxo se dá de forma parabólica. partícula neutra). como pode ser visto na equação a seguir. levando consigo os analitos. por sua vez. a viscosidade para que não haja diminuição desnecessária da velocidade eletroforética que poderia acarretar em falta de reprodutibilidade inter-corrida e diminuição de eficiência. Uma das principais vantagens da eletroforese capilar em relação às demais técnicas cromatográficas é que por conta desse “bombeamento de fase móvel” provocar um fluxo laminar.0) que vão interagir eletrostaticamente com íons de carga positiva presente no eletrólito. uma das consequências do efeito Joule é a alteração na viscosidade do eletrólito que pode acarreta em perda de reprodutibilidade. podendo acarretar em alargamento de picos. que permite que os analitos. independente de sua carga. Já o fluxo eletro-osmótico é o fluxo de eletrólito ao longo do capilar. formando uma camada móvel de cátions em direção ao cátodo (polo negativo) formando um fluxo laminar uniforme. Por isso é importante também observar. não há mobilidade eletroforética (velocidade igual a zero).

a eletroforese convencional seria muito demorada. ou não. elui primeiro as moléculas com maior carga (positiva) e elui por último às que tem menor carga (negativa). de diferentes densidades de cargas. o que pode ser conseguido pela adição de tensoativos ao eletrólito. na separação de ânions. portanto. Como pode ser observado. dependendo da carga do soluto. atuarem na mesma direção. Dessa forma. A mobilidade eletroforética e o fluxo eletro-osmótico podem. utiliza-se polaridade invertida e fluxo eletroosmótico invertido. o que pode ser controlado pelo pH do eletrólito: quanto mais básico o pH. consegue-se separar ânions e cátions. para se acelerar o processo.eletroosmótico. numa mesma corrida eletroforética. o que é esquematizado a seguir: . nesses casos. define-se velocidade total a soma das velocidades eletroforética e eletroosmótica. que vai depender principalmente das cargas da parede interna do capilar. No entanto. o que é esquematizado na figura abaixo: Como pode ser observado. maior a ionização dos grupos silanóis da parede interna do capilar e portanto maior a densidade de cargas negativas (potencial zeta) e maior a velocidade eletroosmótica.

Tempo (t) necessário para o soluto migrar uma distância (l) do terminal de injeção do capilar até a janela de detecção (comprimento efetivo do capilar) é definido pela equação: Ou seja. no entanto é pouco usual. menor o tempo necessário para a corrida. aumenta-se a velocidade eletroforética e eletroosmótica). Consistiria em começar a eletroforese com uma voltagem moderada para a separação dos analitos com mobilidade maior e em seguida aumentar essa voltagem para acelerar a velocidade dos analitos de mobilidade menor (lembrando que.A eletroforese com voltagem em gradiente é uma boa alternativa para a separação simultânea de compostos com mobilidades eletroforéticas muito diferentes em um período de tempo reduzido. aumentando-se a voltagem. Lembrando que o comprimento efetivo do capilar é a porção do capilar que se situa entre o ponto de aplicação da amostra e o detector. segundo as equações apresentadas. sendo definido pela seguinte equação: . quanto maior o tamanho efetivo do capilar. maior o tempo requerido para a corrida e quanto maior a velocidade total. O número de pratos teóricos (N) é um indicativo de eficiência da eletroforese capilar e que implicará diretamente na sua resolução.

Um dos grandes gargalos da eletroforese é o efeito Joule. necessário utilizar eletrólitos aditivados com substâncias que inibam essa interação. São geralmente produzids em vidro. Ao contrários das demais técnicas cromatográficas. O vidro absorve UV. O tamanho do capilar influencia na corrida das seguintes formas: . o número de pratos teóricos pode ser aumentado com o aumento da voltagem. A solução mais empregada é o uso de um sistema de controle de temperatura (capilar resfriado com líquido ou ar) e usar voltagens adequadas (não muito altas). .Quanto maior o capilar. podendo ocasionar alargamento dos picos e piora na resolução e repetitibilidade. O quartzo seria o mais ideal. mas os de vidro são os mais utilizados principalmente por conta do custo mais acessível. São fundidos com sílica (dióxido de silício) na parte interna. O efeito joule consiste na conversão de energia de elétrica em energia térmica. menor a corrente elétrica e consequente maior tempo de migração.Portanto. diz-se que a eletroforese capilar é uma técnica de resolução bastante elevada quando comparadas às demais. é desejável que aplique altas voltagens para se obter separações com alta resolução. Por isso. decorrente da passagem da corrente elétrica pelo capilar. N é tipicamente é 105 com as voltagens usuais aplicadas em eletroforese capilar. O teflon não é muito utilizado pois não suportas elevadas voltagens. principalmente quando se pensa em detecção por UV. que seria uma espécie de buraco que permite que a luz passe pela amostra mas não passe pelo vidro. Assim. maior a capacidade de dissipação de calor (menor efeito Joule). mas o aumento da voltagem pode provocar efeito Joule que pode comprometer a resolução e repetitibilidade das corridas. O capilar é refrigerado externamente por ar ou líquido para evitar efeito Joule. em alguns casos. sendo inclusive. CAPILARES: Tem de 10 a 100 µm de diâmetro e 40 a 100 cm de comprimento. O aquecimento produzido pode alterar a viscosidade do eletrólito o que pode alterar a velocidade de migração e comprometer a repetitibilidade das corridas. o número de pratos (N) não aumenta como o aumento do comprimento do capilar. como se pode observar. ele ainda é um problema que pode ocorrer na eletroforese capilar e que pode influenciar enormemente na resolução e repetitibilidade das corridas. mas utiliza-se o artifício de se criar uma “janela” no capilar próximo ao detector. Embora ele tenha sido enormemente minimizado com uso de capilares. o que vai expor grupos silanóis que são importantes para o fluxo eletroosmótico explicado anteriormente. Não deve haver interação do analito com a sílica. uma vez que quartzo não absorve luz UV.Quanto menor o diâmetro interno do capilar. permitindo maior elevação da voltagem e redução no tempo de análise e maior eficiência de separação (maior número de pratos teóricos) . quartzo ou teflon.

Por isso. A injeção eletrocinética tem a desvantagem de favorecer a injeção de moléculas de maior mobilidade. o que exige que faz com que as mesmas técnicas utilizadas em CLAE sejam menos sensíveis em EC. o que pode ser justificado pelas micrométricas dimensões dos capilares. concentração da amostra. Esse aspecto traz à técnica uma enorme vantagem às demais por conta da pequena demanda de amostra. na eletroforese capilar não é possível se realizar fracionamento de amostras. ao contrário das técnicas cromatográficas convencionais. DETECÇÃO: Geralmente os mesmos detectores utilizados em CLAE. A injeção eletrocinética consiste na injeção com base nas mobilidades eletroforéticas dos analitos. no entanto. Em ambos os tipos de injeção de amostra. vácuo ou gravidade. isso também pode ser uma limitação quando se pensa em técnicas preparativas. não há possibilidade de eletroforese capilar preparativa. uma forma de injeção que não produz amostras representativas dentro do equipamento. ou seja. existe uma dificuldade na detecção por conta do menor volume de amostra (nL) e pequeno diâmetro interno dos capilares. portanto. No entanto. fatores como tempo de injeção.INJEÇÃO DE AMOSTRA: A quantidade de amostra injetada num eletroferógrafo capilar situa-se na ordem de 10 a 100 nL de amostra. através da formação de um circuito elétrico entre o recipiente que contém a amostra e o eletroferógrafo. que é crucial em algumas áreas de aplicação (como por exemplo na área forense). . A injeção da amostra no eletroferógrafo capilar pode ser feita de duas formas: por injeção hidrodinâmica ou por injeção eletrocinética. viscosidade da amostra e tamanho efetivo do capilar podem influenciar. sendo. que exigem grande número de amostra. A injeção hidrodinâmica consiste na injeção de amostra com base no uso de pressão.

p. Eletroforese capilar: conceitos básicos. n. Química Nova. enquanto a solução ainda migra capilar. Os principais detectores utilizados em eletroforese capilar podem ser em linha. ou após a coluna. p. sensível. baixo nível de ruido. visível.Detectores de fluorescência (detectores de laser induzido por fluorescência ou LIF) . 1996. 493-511. M. n.Como em qualquer análise.Amperometria e condutivimetria (menos empregados em eletroforese capilar) A espectrometria de massas é um tipo de detecção que é realizado no final capilar. M. . UV-indireta) . Mecanismos de separação em eletroforese capilar. VANTAGENS DA ELETROFORESE CAPILAR:  Separações de alta eficiência (número alto de pratos teóricos comparativamente à CLAE)  Tempos de análise relativamente curtos (poucos minutos)  Instrumentação relativamente simples  Pequena demanda de amostra  Não há alargamento de bandas  Diminuição do efeito Joule (o calor é dissipado mais facilmente dentro do capilar)  Possibilidade de automatização REFERÊNCIAS QUE EU SUGIRO (ARTIGOS EM PORTUGUÊS):  TAVARES. o detector ideal deve ser versátil. linha de base estável.  TAVARES. 20. UV-DAD. ampla faixa de linearidade. Ler também na Farmacopeia Brasileira 5ª Edição (a parte de fluxo eletroosmótico é muito bem explicadinha lá) e no livro de Química Analítica de Skoog (tem todas as técnicas cromatográficas. v. 173-181. robusto e responsivo a vários tipos de analitos e a escolha do detector vai depender das propriedas fisico-químicas do analito. isto é. 1997. ou seja. Os principais detectores em linhas para eletroforese capilar são: .Dectores de absorbância (UV. na extremidade final do capilar. praticamente). 5. M. M. 2. F. 19. v. F. Química Nova.

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