Apostila

CONSELHO REGIONAL DE
QUÍMICA - IV REGIÃO (SP)
Princípios e aplicações da Cromatografia

Líquida de Alta Eficiência (HPLC)
Ministrante: Guilherme Julião Zocolo
Doutor em Química Analítica - Unesp Araraquara
Contatos: gjzocolo1@gmail.com
Apoio
Bauru, 5 de novembro de 2011

Observação: A versão original desta apresentação, com slides coloridos, no formato
PDF, está disponível na seção downloads do site do CRQ-IV (www.crq4.org.br)
Minicursos CRQ-IV - 2011
Princípios e aplicações da HPLC
Princípios e Aplicações da Cromatografia

Líquida de Alta Eficiência (HPLC)
Dr. Guilherme Julião Zocolo

E mail: gjzocolo1@gmail
E-mail: gjzocolo1@gmail.com
com
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal

Mikhael Semenovich Tswett (1906)

Mikhael Semenovich Tswett (1906)

“Cromatografia”
“Cromatograma”
Cromatograma
“Método cromatográfico”
Berichte der Deutschen Botanischen Gesellschaft
Método físico-químico de separação de

componentes
t d
de uma mistura,
i t que envolve
l a
distribuição diferencial destes em um sistema
heterogêneo bifásico:
1 - FASE ESTACIONÁRIA;
2 - FASE MÓVEL.
MÓVEL

Evolução das Técnicas Cromatográficas
1906 Tswett – CROMATOGRAFIA EM COLUNA (CC)

extratos vegetais; coluna c/ CaCO3; éter de petróleo
1938 Izmailov e Shraiber – CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD, TLC)

extratos vegetais; placa de vidro c/ alumina
ERA da “Cromatografia Moderna”: Prêmios Nobel – 1937, 1938, 1939.
1941 Martin e Synge – CROMATOGRAFIA GASOSA (CG, GC)

Martin e Synge CROMATOGRAFIA GASOSA (CG, GC)
1952 Martin e James – CROMATOGRAFIA GASOSA (CG, GC)
Décadas de 1960/1970
Karr, Jentoft, Gouwn, Huber, Hulsman, Snyder e Kirkiland –
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE, HPLC)
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE, HPLC)

Mecanismo de separação cromatográfica
A separação cromatográfica é obtida a partir de interações

diferenciadas entre os analitos componentes da mistura, fase
estacionária e fase móvel.
FASE MÓVEL AMOSTRA
FM FE FASE
ESTACIONÁRIA
amostra
CAVALHEIRO, A.J. (IQ-UNESP)






SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA: resulta das interações

diferenciais entre analito, FE e FM.
ALARGAMENTO DAS BANDAS: resulta dos processos de
difusão e transferência de massas.
BANDAS ALARGAM-SE  ASSUMEM FORMA GAUSSIANA





CÁLCULO DO FATOR DE RETENÇÃO (k)







Resolução (Rs)
N (  1) k '2
Rs  . .
4  (k '2 1)
EFICIÊNCIA
Depende da
configuração
do sistema
FATORES FÍSICOS
SELETIVIDADE RETENÇÃO
Dependem
D d d
das características
t í ti d
da
FM e FE do sistema
FATORES QUÍMICOS







Efeito da Seletividade (α) sobre R
( ) s
2 Mudanças na FE
2.
- geralmente acompanhada por mudanças na FM
E FEinicial = C18;
Ex. C18 FEalternativas = C8,
C8 fenil
f il
3. Mudanças na temperatura
↑ 1o C  ↓ k de 1‐2%  ↑ α


PRINCIPAIS MECANISMOS DE SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA
Troca Iônica
ô i P
Permeação
ã
Líquido/gás sólido Líquido/gás líquido Líquido sólido
(exclusão)
Líquido/gás gel/sólido
+
-
+
+ -
Interações Iônicas
Bioafinidade
Interações Intermoleculares
Ligação de Hidrogênio
Dipólo/dipólo
Dipólo/dipólo induzido
Dipólo induzido/dipólo induzido
1/37

Esquema de cromatografia por adsorção
Grupop silanol OH solvente

- sílica
HO Si OH 1
O
FIA EM COLUNA)
HO Si OH
O 2 analito
l
Interações Si OH 2
intermoleculares
ATOGRAF
O OH
3
HO Si OH
(CROMA
3
OH
1/37
SANTOS,
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa A.G (UNESP)
Econômica Federal
1/37

CROMATOGRAFIA: CLASSIFICAÇÃO PELA POLARIDADE DA
FASE ESTACIONÁRIA
Cromatografia em FASE NORMAL: fase estacionária polar.
Ex.: sílica gel

OR
RO Si OH
OR
Cromatografia em FASE REVERSA: fase estacionária de baixa

polaridade.
Ex. sílica de fase ligada C18

FASE NORMAL: fase estacionária polar
OR
RO Si OH
OR
OR

FASE REVERSA: fase estacionária de baixa polaridade – C2, C4, C8, C18.

FASE NORMAL: fase estacionária p

polar
OR
RO Si OH
OR
OR
FASE REVERSA: fase estacionária de baixa polaridade – C2, C4, C8, C18.

FASE NORMAL: fase estacionária polar
Quando se utiliza silica-gel derivatizada com grupos polares

(fenila, ciano, amino, diol), tais fases estacionárias
podem ser utilizadas tanto para cromatografia em modo normal
(fase estacionária polar à eluente apolar) ou em fase reversa
(fase estacionária apolar à eluente polar).

FASE ESTACIONÁRIA (Normais e Reversas)
COLUNAS CROMATOGRÁFICAS
‐ tubo: aço inoxidável 316 tratado; contém FE
* colunas capilares e nano: tubos de sílica fundida
p
Coluna guarda (pré-coluna): C18 (5 µm)
Coluna analítica:
C-18 250 x 4,6mm x 5µm
Coluna semi-preparativa:
C-18 250 x 21,2mm x 10µm

DETECTOR
Coluna analítica:
C-18 250 x 4,6mm x 5µm
Coluna semi-preparativa:
C-18 250 x 21,2mm x 10µm
BOMBA – 3 canais INJETORES
1/37

BOMBAS DE ALTA PRESSÃO
‐ Permitem vencer a resistência à passagem da FM exercida pelas partículas da FE.
‐ Função: proporcionar fluxo constante e reprodutível de FM a todo o sistema.
CARACTERÍSTICAS DESEJÁVEIS:
‐ composição da FM e fluxo precisos e exatos
‐ vazão contínua e livre de pulsações
‐ resposta rápida a alterações no fluxo e composição da FM –
á d l fl d gradiente de eluição!!
d d l !!
‐ pressão máxima: 700 atm (10.000 psi)
‐ maior parte construída em aço inox 316; outros materiais: titânio, peek, teflon
maior parte construída em aço inox 316; outros materiais: titânio peek teflon
‐ inércia química a solventes comuns
‐ manutenção simples
manutenção simples
‐ reservatório de solvente ilimitado



BOMBAS DE VOLUME (FLUXO) CONSTANTE
Bombas mais utilizadas em CLAE
Vantagem:
Capacidade de repetição dos volumes ou fluxos e, consequentemente, das
áreas dos picos, mesmo com mudanças na viscosidade da FM ou bloqueio da
coluna por partículas.
p p

BOMBA DO TIPO SERINGA
Collins; Braga; Bonato, 2006
BOMBA DO TIPO PISTÃO RECIPROCANTE OU ALTERNANTE
pistão conectado ao motor por meio
de engrenagens e 1 EXCÊNTRICO
‐ escoam volumes constantes de forma não contínua ou pulsante
escoam volumes constantes de forma não contínua ou pulsante
‐ bomba mais empregada em CLAE atualmente
‐ adequada para pressões elevadas
adequada para pressões elevadas
‐ reservatório de FM: ilimitado
‐ movimentos do pistão na câmara geram PULSOS
movimentos do pistão na câmara geram PULSOS
Lanças, 2009
‐ aplicações: CLAE analítica e preparativa
Collins; Braga; Bonato, 2006
GRADIENTE DE ELUIÇÃO
ELUIÇÃO ISOCRÁTICA: composição da FM (1 ou mais solventes) não
ELUIÇÃO ISOCRÁTICA composição da FM (1 o mais sol entes) não varia durante
aria d rante
a eluição.
G
GRADIENTE DE ELUIÇÃO: composição da FM varia durante a eluição.
U Ç O: co pos ção da a a du a te a e u ção.
Separação de analitos com ampla faixa de k
Lanças, 2009


SISTEMAS DE INTRODUÇÃO DE AMOSTRAS (INJETORES)
INJETORES MANUAIS
INJETORES MANUAIS
‐ amostra deve ser aplicada na coluna pressurizada na forma de uma banda estreita
‐ válvula de introdução de amostra mais comum: válvula de 6 pórticos (orifícios)
‐ alça de amostragem ou loop: comprimento e diâmetro interno definem seu volume
loop para escala analítica
(µL)
loop para escala preparativa

(mL)
http://www.restek.com/hplcsixport/6_Port_Injector_content.html
4. SISTEMAS DE INTRODUÇÃO DE AMOSTRAS (INJETORES)
4 1 INJETORES MANUAIS
4.1. INJETORES MANUAIS
VISÃO ESQUEMÁTICA DO FUNCIONAMENTO DA VÁLVULA DE 6 PÓRTICOS
POSIÇÃO DE CARGA
LOAD saída da amostra
alça de amostragem (loop)

entrada da amostra 2
3
1
6 4 entrada do eluente
5 2
coluna 3
1
6 4
POSIÇÃO DE INJEÇÃO
INJECT 1/37

SISTEMAS DE INTRODUÇÃO DE AMOSTRAS (INJETORES)
a. Com o injetor na posição LOAD, introduzir a seringa até a agulha
encontrar a porta de injeção.
b. Injetar a amostra e virar rapidamente a válvula para a posição INJECT.
c. Remover a seringa.
d. Deixar a válvula do injetor na posição INJECT até a próxima injeção (o

loop será continuamente lavado pela FM).
FM)
Lavar o injetor com solvente após cada injeção e repetir os passos para as
próximas.
ó i



Cavalheiro, A. J. IQ‐UNESP
1/37

Cavalheiro, A. J. IQ‐UNESP
DETECTORES
Função do detector: identificar a presença de substâncias de
interesse que estejam eluindo da coluna cromatográfica.
Característica desejáveis:
- alta sensibilidade e baixo limite de detecção - baixo nível de ruído
- ampla faixa de linearidade - fácil de operar e manter
- confiável e reprodutível - informação qualitativa
- insensibilidade a mudanças na FM e de T - não destruição do soluto
- resposta rápida e linear a alterações de concentrações dos solutos

CLASSIFICAÇÃO
De acordo com as propriedades medidas:
Detectores de propriedades do eluente: medem a variação de propriedades do eluente (ex.
constante
t t dielétrica)
di lét i )
Detectores de propriedades do analito: medem propriedade física ou química do analito (ex.
fluorescência)
De acordo com o tipo de resposta:

Detectores sensíveis à concentração: resposta proporcional à concentração de um componente no
eluente (ex. UV, fluorescência).
Detectores sensíveis ao fluxo de massa: resposta proporcional à quantidade de massa do
componente da amostra que chega ao detector por unidade de tempo (ex. eletroquímico,
espalhamento de luz).
De acordo com a seletividade:

Detectores universais
Detectores seletivos
Detectores específicos




DETECTORES BASEADOS NA ABSORÇÃO DE LUZ UV/VIS
Faixas de λ utilizadas:
Ultravioleta: 190 - 400 nm
Visível: 400 - 800 nm
Espectro eletromagnético
1/37



LEI DE LAMBERT-BEER
Leitura = Unidade de Absorbância (UA)

1 UA = Depreciação da luz incidente em 90 %
Comprimento de onda λ máximo

S l
Solvente
t
ε ε máximo
pH
Temperatura > Sensibilidade
DETECTOR NO UV/VIS DE COMPRIMENTO DE
ONDA FIXO






ONDA FIXO

ONDA VARIÁVEL
Á


Lâmpadas: deutério – UV
tungstênio - visível
DETECTOR NO UV/VIS COM ARRANJO DE
FOTODIODOS (DAD)
‐ arranjo de diodos: série de fotodiodos posicionados lado a lado num cristal
de silício de modo que cada λ difratado pela grade atinja um diodo.
‐ a absorbância de uma amostra pode ser determinada em todos os λ de

modo simultâneo.


DETECTOR -UV/VIS
Qual o comprimento de onda ideal para a análise ?
Criptomoscatona D2
mAU
500 OH OH
O O
215 nm 223 nm 252 nm 280 nm
300
100
250 300 350

nm
max = > 

> sensibilidade


DETECTORES BASEADOS NO FENÔMENO DA FLUORESCÊNCIA







Espectrômetros de massas (HPLC‐MS/MS)

Comparação da resposta de alguns detectores


Modo Isocrático possível

RA
tr/tg < 0,25 1<k k’ < 10

A AMOSTR
A
Amostra
t muitoit retina,
ti muito
it apolar
l
tr/tg < 0,40 0,5 < k’ < 20
Usar THF ou fase reversa não-aquosa (NARP).
Usar coluna menos lipofílica.
IAÇÃO DA
RATÓRIO
Modo ggradiente será necessário

C-18 - AVALI
E EXPLOR
tr/tg > 0,40
Amostra muito polar.

Ácidos/Bases/Açucares
Controlar pH, força iônica.
RADIENTE
Íon-par
Íon par. Troca îônica.
îônica
SA C-
6 mm, 5 m
E REVERS
GR
Amostra complexa
Coluna
C l RP C18,
C18 150 x 44,6
Gradiente Linear: 5 a 100 % de ACN, 60’
Fluxo: 2,0 mL/min.
Detetor: DAD ou 254 nm
FASE
Amostra: < 50 L; 50-100 g

(0,5 - 1 mg/mL)
Amostra fácil – modo isocrático possível

tR/tG = (24 – 19)/60 = 0,083
0 083  < 0,25
0 25
tRp = 19 min. tRu = 24 min.

Gradiente Exploratório
C18, 150 x 4,6 mm, 5 m
5 a 100 % de ACN, 60’
Eluição isocrática possível
2,0 mL/min.
1 < k’ < 10
Resolução
ç satisfatória
k’u = 7  % ACN = 1,7.tRu = 1,7.24 = 40,8 % k’u = 20  % ACN = 1,7.tRu - 10 = 30,8 %
ACN/Água 40:60 ACN/Água 30:70
1/37

Amostra mais difícil – modo isocrático possível - I

tR/tG = (24 – 9,5)/60 0 24  < 0,25
9 5)/60 = 0,24 0 25
tRp = 9,5 min. tRu = 24 min.
Gradiente
G di t Exploratório
E l tó i
C18, 150 x 4,6 mm, 5 m
5 a 100 % de ACN, 60’
2,0 mL/min.
Eluição
ç isocrática possível
p
1 < k’ < 10
Resolução insatisfatória
k’u = 7  % ACN = 1,7.tRu = 1,7.24 = 40,8 % k’u = 20  % ACN = 1,7.tRu - 10 = 30,8 %
ACN/Água 40:60 ACN/Água 30:70
1/37

1/37




TAMPÕES EM CLAE
Tampão pKa Faixa UV limite
Ácido Trifuoracético (TFA) >> 2 1,5-2,5 210 nm (0,1%)
H3PO4/KH2PO4 ou K2HPO4 2,1 < 3,1
7,2 6,2-8,2 < 200 nm (0,1 %)
12,3 11,3-13,3
Ácido cítrico/K3 citrato 3,1
4,7 2,1-6,4 230 nm (10 mM)
5,4
Ácido fórmico/Formiato de K 3,8 2,8-4,8 210 nm (10 mM)
Ácido acético/Acetato de K 48
4,8 3 8-5
3,8 5,8
8 210 nm (10 mM)
KHCO3 ou K2CO3/Ácido acético 6,4 5,4-7,4 < 200 nm (10 mM)
10,3 9,3-11,3
Bis-tris propano.HCl/Bis-tris propano 6,8 5,8-7,8 215 nm (10 mM)
90
9,0 8 0 10 0
8,0-10,0 225 nm (10 mM)
M)
Tris.HCl/Tris 8,3 7,3-9,3 205 nm (10 mM)
NH4Cl/NH3 9,2 8,2-10,2 200 nm (10 mM)
1-Me-Piperidina.HCl/1-Me-Piperidina
1 Me Piperidina.HCl/1 Me Piperidina 10,1
, 9,1-11,1
, , 215 nm ((10 mM))
Et3N.HCl/Et3N 11,0 10,0-12,0 < 200 nm (10 mM)
Snyder; Kirkland; Glajch, 1997



Supressão da Ionização
HO O HO O
OH O O
OH
Genistein OH
Daidzein
HO HO
O O O O O O
O
OH OH
OH OH
OH OH
OH O O
OH OH
Genistin
Daidzin
HO O HO O
O CH3 OH O CH3
O
O
Formononetin
Biochanin A
HO O
Equol
OH

Sistema isocrático MeOH/H2O (50:50) sem ácido acético Sistema isocrático MeOH/H2O (60:40) com ácido acético
100 mAU Reference = isocr cicero 50_50_18-Jan-10 17_31_331.DATA mAU Reference = isocr cicero 60_40_18-Jan-10 16_19_001.DATA
180
95
170
90
160
85
150
80
75 140
70 130
65 120
60 110
55
100
50
90
45
80
40
70
35
60
30
50
25
STH 10.00
STH 10.00
20 40
15 30
10 20
SPW 0.20
SPW 0.20
5 10
0
0
-5
5
-10
-10
-20
-15 RT [min] RT [min]
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27
mAU padrao 7 fitoestrogenos_18-Jan-10 11_04_411.DATA

100
30.51
95
Gradiente exploratório
exploratório, condições estabelecidas por Snyder
Snyder. 90
85
Gradiente (60 min)

80
37.23
75
33.65
70
65
Tempo (min) % H2 O % MeOH 60
17.56
55
50
45
27.15
0 95 5 40
35
20.75
30
60 0 100 25
20
15
10
65 95 5 5
28.53
0
-5
-10
Tempo de equilíbrio de 3 min -15
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
RT [[min]]
60
Ácido ácetico 0,1 % foi usado como supressor iônico

Gradiente otimizado
T
Tempo (min)
( i ) % H2O %M
MeOH
OH
0 70 30
15 35 65
17 0 100
20 70 30
25 70 30
Tempo de equilíbrio de 5 min
Tempo de equilíbrio de 3 min
Ácido ácetico 0,1 % foi usado como

supressor iônico

Agradecimentos
g
• Ao Conselho Regional de Química - CRQ-IV
• Aos Participantes do Curso
Contato
Guilherme Julião Zocolo
E-mail: gjzocolo1@gmail.com

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QUÍMICA - IV REGIÃO (SP)

Princípios e aplicações da Cromatografia

Bauru, 5 de novembro de 2011

Princípios e Aplicações da Cromatografia

Dr. Guilherme Julião Zocolo

Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal

Mikhael Semenovich Tswett (1906)

Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal

Mikhael Semenovich Tswett (1906)

Método físico-químico de separação de

Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal

Evolução das Técnicas Cromatográficas

1906 Tswett – CROMATOGRAFIA EM COLUNA (CC)

1938 Izmailov e Shraiber – CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD, TLC)

1941 Martin e Synge – CROMATOGRAFIA GASOSA (CG, GC)

1952 Martin e James – CROMATOGRAFIA GASOSA (CG, GC)

Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal

Mecanismo de separação cromatográfica

A separação cromatográfica é obtida a partir de interações

FASE MÓVEL AMOSTRA

CAVALHEIRO, A.J. (IQ-UNESP)

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SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA: resulta das interações

BANDAS ALARGAM-SE  ASSUMEM FORMA GAUSSIANA

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CÁLCULO DO FATOR DE RETENÇÃO (k)

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Grupop silanol OH solvente

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Ex.: sílica gel

Cromatografia em FASE REVERSA: fase estacionária de baixa

Ex. sílica de fase ligada C18

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FASE NORMAL: fase estacionária polar

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FASE NORMAL: fase estacionária p

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